一種禽流感病毒的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于禽流感病毒免疫檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及到一種用表面等離子體諧振(Surface Plasmon Resonance, SPR)技術(shù)檢測(cè)禽流感病毒的方法以及用于上述方法的SPR生化分析儀芯片及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]人禽流行性感冒又稱人禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亞型中的一些毒株弓I起的急性呼吸道傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織資料，禽流感為病毒誘發(fā)的動(dòng)物傳染病，通常僅感染鳥類，偶爾感染豬。禽流感病毒具有高度物種特異性，但偶爾也跨越物種屏障，感染人類。
[0003]根據(jù)抗原特性及其基因的不同，流感病毒分為A、B、C三型，也被稱為甲、乙、丙三型。A型(即甲型)攻擊力最強(qiáng)，也最常見，禽流感病毒就屬于A型流感病毒。流感病毒表面密布的糖蛋白也即抗原結(jié)構(gòu)分H和N兩大類,H代表Hemagglutinin (血細(xì)胞凝集素),可幫助病毒與呼吸道黏膜上皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，吸附可宿主的呼吸道上皮細(xì)胞上。N代表Neuramidinase (神經(jīng)氨酸)，可幫助病毒作用于核蛋白的受體，使病毒和上皮細(xì)胞的核蛋白結(jié)合，在核內(nèi)組成RNA型可溶性抗原，并滲出至胞質(zhì)周圍，復(fù)制子代病毒，以出芽方式排出上皮細(xì)胞，排出的病毒擴(kuò)散至附近細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，臨床上出現(xiàn)發(fā)熱，肌肉痛和白細(xì)胞減低等全身毒血癥樣反應(yīng)。A型流感病毒根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H分為15個(gè)亞型(Hl?H15)，N分為9個(gè)亞型(NI?N9)，H N組合可以有144種可能。不過，目前僅有3種組合——H1NUH2N2以及H3N2具有感染人類的能力，其他組合如H5N1型禽流感病毒雖然偶爾也傳染給人類，但自然宿主仍然主要是多種禽類和動(dòng)物。AIV基因共編碼至少 10 種蛋白質(zhì)(PA、PB1、PB2、HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NS2 等)。除 NSl 與 NS2 為非結(jié)構(gòu)蛋白外，其余均為結(jié)構(gòu)蛋白，其中HA和NA為糖基化的結(jié)構(gòu)蛋白，其它均為非糖基化結(jié)構(gòu)蛋白。
[0004]最早的禽流感記錄在1878年，意大利發(fā)生雞群大量死亡，當(dāng)時(shí)被稱為雞瘟。到1955年，科學(xué)家證實(shí)其致病病毒為甲型流感病毒。此后，這種流行性疾病被更名為禽流感。1999年3月至11月，英國(guó)倫巴第地區(qū)暴發(fā)禽流感，到次年3月1300萬(wàn)只病禽被捕殺。2002年10月，美國(guó)加州暴發(fā)禽流感，僅加州就銷毀326多萬(wàn)只雞；4月，荷蘭發(fā)生禽流感，人類感染者達(dá)80人，并出現(xiàn)死亡病例。自從2003年以來，禽流感病毒持續(xù)在全球蔓延，造成數(shù)千萬(wàn)只家禽被宰殺銷毀，染病死亡者已達(dá)數(shù)十人。由于存在大流行的潛在危險(xiǎn)，因此引起了廣泛的關(guān)注。
[0005]禽流感被發(fā)現(xiàn)100多年來，人類并沒有掌握有效的預(yù)防和治療方法，僅能以消毒、隔離、大量宰殺禽畜的方法防止其蔓延。目前，國(guó)際上加強(qiáng)了對(duì)于禽流感檢測(cè)技術(shù)的研究。禽流感特異性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)可以分為直接檢測(cè)病毒法和基于抗體的檢測(cè)方法兩類。直接檢測(cè)法包括傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)，以及檢測(cè)特異性的病毒抗原或核酸。目前，隨著儀器微型化和計(jì)算技術(shù)的發(fā)展，人類不僅能夠迅速判斷病毒的亞型，還能夠?qū)Σ《镜娜蚪M進(jìn)行測(cè)定，并且對(duì)單個(gè)病毒進(jìn)行遺傳分析?；诳贵w的禽流感病毒檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散以及紅血球凝集抑制法，還有基于ELISA的方法，這些方法提供了禽流感的現(xiàn)場(chǎng)篩查和確定禽流感病毒亞型的檢測(cè)方法?？乖东@和側(cè)流ELISA方法(試紙條)是被廣泛應(yīng)用的禽流感檢測(cè)方法，這些方法最初是應(yīng)用于人感染禽流感的臨床診斷的，后來迅速發(fā)展被應(yīng)用于畜牧業(yè)。
[0006]但是這些方法具有如下缺點(diǎn):
[0007]ELISA方法操作過程復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；試紙條方法簡(jiǎn)單快速，但是讀數(shù)具有主觀性，準(zhǔn)確性低。
[0008]SPR檢測(cè)技術(shù)的原理如錯(cuò)誤！未找到引用源。所示。具有橫磁(TransverseMagnetic, TM)偏振的平行入射光通過棱鏡耦合，照射在傳感芯片上，入射光與傳感芯片表面的金屬膜的表面等離子體波發(fā)生諧振，在棱鏡的另一側(cè)采用光檢測(cè)裝置檢測(cè)出射光的強(qiáng)度。在金屬膜的表面，制備有敏感膜(如抗體、受體等分子)。微流通道覆蓋在傳感芯片的表面，用于引入待測(cè)樣品。當(dāng)待測(cè)樣品中含有與敏感膜發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)(如抗原)時(shí)，出射光的強(qiáng)度會(huì)發(fā)生改變。利用SPR檢測(cè)禽流感病毒可以實(shí)現(xiàn)禽流感病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，而且具有操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外還沒有利用檢測(cè)禽流感病毒的便攜式SPR儀、方法以及試劑盒的相關(guān)論文及專利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明將便攜式表面等離子體諧振生化分析儀應(yīng)用于禽流感病毒的檢測(cè)，并且提供檢測(cè)方法與芯片以及試劑盒。本發(fā)明提出的檢測(cè)方法無需標(biāo)記，現(xiàn)場(chǎng)快速、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
[0010]本發(fā)明提出了一種禽流感病毒檢測(cè)方法，其包括:
[0011]步驟1、將從環(huán)境中獲取的待測(cè)樣品注入SPR生化分析儀；
[0012]步驟2、在所述SPR生化分析儀中，待測(cè)樣品在SPR敏感芯片表面反應(yīng)預(yù)定時(shí)間；
[0013]步驟3、SPR生化分析儀計(jì)算出禽流感病毒的濃度數(shù)值，并根據(jù)預(yù)先設(shè)定的警戒值進(jìn)行報(bào)警或不報(bào)警；
[0014]其中，所述SPR敏感芯片為其表面固定有禽流感病毒抗體或禽流感病毒抗原的SPR金屬片。
[0015]其中，所述SPR敏感芯片表面固定有禽流感病毒抗體時(shí)，步驟I中所述待測(cè)樣品直接注入SPR分析儀。
[0016]其中，所述SPR敏感芯片表面固定有禽流感病毒抗原時(shí)，所述待測(cè)樣品需要進(jìn)行預(yù)處理,并與禽流感病毒抗體混合后注入SPR分析儀。
[0017]其中，所述預(yù)處理包括將待測(cè)樣品經(jīng)過裂解液裂解并溫浴一段時(shí)間后注入SPR生化分析儀。
[0018]其中，SPR分析儀通過檢測(cè)SPR敏感芯片表面的折射率的變化而檢測(cè)禽流感病毒。
[0019]其中，所述固定在SPR敏感芯片上的禽流感病毒抗體為針對(duì)禽流感病毒表面蛋白NA的抗體，所述固定在SPR敏感芯片上的禽流感病毒抗原是指禽流感內(nèi)部蛋白Ml。
[0020]其中，所述SPR敏感芯片為其基板為玻璃或塑料，基板表面有兩層金屬膜，下層為鉻膜，上層為金膜或銀膜，上層金膜或銀膜的厚度為40-50nm，下層鉻膜的厚度為3_7nm。
[0021]其中，在所述SPR敏感芯片上固定禽流感病毒抗體或抗原的過程如下:
[0022]將表面的金屬膜經(jīng)過葡聚糖修飾的SPR敏感芯片用去離子水清洗，并將其表面吹干；將SPR敏感芯片浸泡在0.4M N-羥基琥珀酰亞胺(EDC)和0.1M N-乙基-N’ - ( 二甲氨基丙基)碳二亞胺(NHS)的混合液中，SPR敏感芯片表面進(jìn)行活化10分鐘，活化后用去離子水清洗后吹干；將禽流感病毒抗體用PH4.2-4.6醋酸緩沖液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛群?，滴加在芯片表面以制備固定有禽流感病毒抗體的SPR敏感芯片，或?qū)⑶萘鞲胁《究乖胮H值4.2-4.6醋酸緩沖液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛群?，滴加在芯片表面以制備固定有禽流感病毒抗原的SPR敏感芯片；20°C反應(yīng)5分鐘；將芯片泡入IM乙醇胺溶液中反應(yīng)10分鐘，以滅活剩余的結(jié)合位點(diǎn)；快速將芯片用去離子水吹干，置于4°C保存。
[0023]其中，所述裂解液為Triton或SDS，工作濃度為10% -0.5%;溫浴的溫度為25-45度，溫浴的時(shí)間10-90分鐘。
[0024]其中，被檢測(cè)的禽流感病毒包括所有亞型的完整禽流感病毒顆?；虿《舅槠?，以及以任伺已知的方式獲得的禽流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白；所述待測(cè)樣品包括水、土壤或空氣。
[0025]本發(fā)明所采用的生化分析儀便攜式表面等離子體諧振生化分析儀為中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行