隱孔菌提取物在體內(nèi)和體外抑制流感病毒的制作方法
【專利摘要】隱孔菌提取物在體內(nèi)和體外抑制甲型流感病毒，本發(fā)明涉及隱孔菌提取物在制備流感病毒抑制劑中的應(yīng)用，隱孔菌在體外有效的抑制流感病毒A/Beijing/7/2009(BJ09)H1N1感染MDCK細胞；應(yīng)用小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)提取物可降低病毒感染后肺組織中病毒滴度，保護小鼠免于流感病毒的致死劑量的感染。
【專利說明】隱孔菌提取物在體內(nèi)和體外抑制流感病毒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及隱孔菌提取物在制備流感病毒抑制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]流感病毒是分節(jié)段的單負鏈RNA病毒，屬于正粘病毒科，是傳染性、急性發(fā)熱性呼吸道疾病-流行性感冒的病原體。人流感病毒根據(jù)其核蛋白的抗原性，分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型流感病毒多次引起季節(jié)性大流行(1918H1N1，1957H2N2，1968H3N2以及2009H1N1)，在1918~1919年的大流行中，全世界至少有2000萬~4000萬人死于流感。
[0003]目前已應(yīng)用于臨床的抗流感藥物包括流感病毒基質(zhì)蛋白M2離子通道抑制劑金剛烷胺和金剛烷乙胺及神經(jīng)氨酸酶抑制劑奧司他韋和扎那米韋。M2抑制劑通過抑制M2形成的離子通道的活性而阻止病毒基因組向細胞質(zhì)內(nèi)的釋放，然而目前流行的所有的甲型流感病毒，包括2009年的甲流HlNl以及季節(jié)性流感病毒H3N2，均對M2離子通道抑制劑有抗性。神經(jīng)氨酸酶抑制劑，如奧司他韋，與病毒的神經(jīng)氨酸酶結(jié)合并抑制其活性，從而抑制新組裝的病毒顆粒從細胞中釋放；但是近年來，奧司他韋抗性的季節(jié)性甲型流感病毒(Hl)開始出現(xiàn)，流感病毒的奧司他韋抗性與其神經(jīng)氨酸酶的單個氨基酸突變(H274Y)有關(guān)。2008年，CDC報告稱，大多數(shù)季節(jié)性HlNl分離株對奧司他韋耐受，雖然2009年大流行HlNl多對神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感，但H274Y突變可能出現(xiàn)在大流行的HlNl病毒株中，并導(dǎo)致奧司他韋耐藥，有可能引起一個重大的健康問題，因此有必要開發(fā)新的抗流感病毒藥物。
[0004]隱孔菌(Cryptoporus volvatus (Peck) Shear)是一種生于松林樹干上的野生大型真菌，也有記載生于衰老的冷杉、云杉的樹干或枯立木上，該菌為腐生真菌，在野外有較廣泛的分布，我國的黑龍江、吉林、福建、浙江、廣東、廣西、云南、海南島等省都有生長。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中多用于治療氣管炎和哮喘，有舒筋活絡(luò)，祛風(fēng)除濕的功效。隱孔菌其野生子實體的藥用價值在《滇南本草》、《秦嶺巴山天然志》、《新華本草綱要》和《中國藥用孢子植物》中都有記載。對于隱孔菌的理化成分進行分析顯示其含有多種生理活性物質(zhì)，比如多糖、多肽、揮發(fā)油及隱孔酸等。據(jù)報道隱孔菌的提取物具有抗腫瘤、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種對抗流感病毒的天然產(chǎn)物來源。
[0006]隱孔菌提取物在體外有效的抑制流感病毒A/Beijing/7/2009 (BJ09) HlNl感染MDCK細胞；應(yīng)用小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)提取物可降低病毒感染后肺組織中病毒滴度，保護小鼠免于流感病毒的致死劑量的感染。這些研究結(jié)果表明，隱孔菌子實體的提取物有望開發(fā)成新的抗流感病毒的藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 圖1為間接免疫熒光測定隱孔菌水提取物抑制流感病毒HlNl在MDCK細胞內(nèi)復(fù)制的結(jié)果。[0008]MDCK細胞感染流感病毒HlNl (Μ0Ι = 0.1)，培養(yǎng)液中含有指定濃度的隱孔菌提取物，24小時后進行間接免疫熒光，檢測病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制。
[0009]圖2為隱孔菌水提取物降低HlNl感染細胞上清中的病毒滴度。
[0010]MDCK細胞感染流感病毒HlNl (Μ0Ι = 0.1)，培養(yǎng)液中含有指定濃度的隱孔菌提取物，24小時后收集上清測定病毒滴度。
[0011]圖3為用MTT實驗確定隱孔菌水提取物對MDCK細胞的毒性。MDCK細胞與不同濃度的隱孔菌水提取物或生理鹽水對照孵育48小時，然后MTT檢測細胞存活率。以生理鹽水對照中細胞存活率為100%。
[0012]圖4為隱孔菌乙醇提取物抑制流感病毒HlNl在MDCK細胞內(nèi)復(fù)制。
[0013]MDCK細胞感染流感病毒HlNl (Μ0Ι = 0.1)，培養(yǎng)液中含有指定濃度的隱孔菌提取物，24小時后進行間接免疫熒光，檢測病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制。
[0014]圖5為隱孔菌乙醇提取物降低HlNl感染細胞上清中的病毒滴度。
[0015]MDCK細胞感染流感病毒HlNl (Μ0Ι = 0.1)，培養(yǎng)液中含有指定濃度的隱孔菌提取物，24小時后收集上清測定病毒滴度。
[0016]圖6為用MTT實驗確定隱孔菌乙醇提取物對MDCK細胞的毒性。MDCK細胞與不同濃度的隱孔菌乙醇提取物或DMSO對照孵育48小時，然后MTT檢測細胞存活率。以DMSO對照中細胞存活率為100%。
[0017]圖7為隱孔菌提取物減輕流感病毒HlNl毒株感染小鼠引起的體重降低。
[0018]圖8為隱孔菌提取物提高流感病毒HlNl毒株感染小鼠的存活率。
[0019]圖9為隱孔菌提取物降低流感病毒HlNl毒株感染小鼠肺臟內(nèi)的病毒滴度。
【具體實施方式】
[0020]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0021]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0022]下述實施例中的隱孔菌(Cryptoporusvolvatus (Peck) Shear) (KohmeiKADOWAK1.Behavioral observation of two fungivorous beetles (Coleoptera:Tenebrionidae)on wood-decayingbracket fungus Cryptoporus volvatusens_.Entomological Science (2010) 13,159-161)米自中國云南，公眾可從野外米集，也可從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所獲得，以重復(fù)本申請實驗。
[0023]下述實施實例中的流感病毒A/Beijing/7/2009 (BJ09)在符合國家生物安全的有關(guān)規(guī)定的情況下，可從中國醫(yī)學(xué)科藥用植物研究所獲得，以重復(fù)本申請實驗。
[0024]實驗方法
[0025]1、流感病毒繁殖及病毒滴度測定
[0026]流感病毒A/Beijing/7/2009 (BJ09)于2009年12月分離自疑似流感癥狀的年輕人，用MDCK細胞繁殖，標準噬斑實驗確定其滴度。
[0027]流感病毒空斑實驗步驟如下:
[0028]1.準備MDCK六孔板:在其長至90%時鋪板，一瓶75cm2MDCK細胞大約可鋪3個六孔板，一定要注意搖勻，使細胞平鋪且均勻，不會出現(xiàn)空隙。[0029]2.預(yù)熱:將4%瓊脂置于70°C水浴鍋融化，完全融化后，置于37°C水浴鍋溫育。
[0030]3.稀釋病毒:將病毒用含有1%雙抗的DMEM(不含血清)10倍倍比稀釋，稀釋倍數(shù)視病毒特性自行判斷。需注意的是，各個稀釋度之間一定要更換槍頭，避免由于吹打混勻時槍頭上粘帶病毒導(dǎo)致稀釋不準確。
[0031]4.洗板:用PBS緩沖液洗板，每孔2_3ml，洗兩次(注意切勿使細胞干燥)后,用槍頭吸凈殘余液體，每孔加入400-600 μ I病毒液(更換槍頭)，輕搖混勻，使病毒液體均勻覆蓋。做好標記后置于C02培養(yǎng)箱37°C孵育lh。
[0032]5.準備配置覆蓋液:在孵育終止前5-10分鐘，在預(yù)熱的雙抗DMEM中加入TPCK-TRYPSIN,混勻，然后將雙抗DMEM與瓊脂按照3: I比例混合，吹吸混勻，覆蓋液中TPCK-TRYPSIN 終濃度為 2-5 μ g/ml。
[0033]6.瓊脂覆蓋:孵育終止后,將細胞板中病毒液棄掉,每孔加入3ml覆蓋液,置于4°C冰箱15-20分鐘(放平)使之凝固，之后移入C02培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)，24h后開始觀察空斑形成情況(12h觀察一次)。
[0034]7.固定及染色:出斑后(一般在48-72小時出)，用I % ο結(jié)晶紫染色，首先于每個孔加入1ml福爾馬林固定細胞，固定6小時左右，用自來水沖洗細胞孔，將膠甩出，然后于每孔加入300-400 μ I結(jié)晶紫溶液放置5分鐘，用自來水沖掉殘余染液，即可見空斑。
[0035]8.計數(shù)并計算病毒PFU:成功出斑后，各個稀釋度之間空斑數(shù)量若相應(yīng)成比例，則此結(jié)果可用。
[0036]計算方法:挑選出斑數(shù)為20-100個的孔進行空斑計數(shù)。計算方法:空斑數(shù)X病毒稀釋倍數(shù)+接種體積(ml)。例如:孵育時每孔加入500 μ I病毒液，IO4稀釋，孔中空斑個數(shù)為40個，則該病毒滴度為40X 104 + 0.5 = 8X 105PFU/ml。
[0037]2、間接免疫熒光
[0038]吸棄細胞培養(yǎng)液，用固定液4°C固定細胞10分鐘；PBS洗兩次，5%羊血清37°C封閉30分鐘；吸棄上清，加抗流感病毒NP蛋白的一抗AA5H (Abeam, Hong Kong)，37°C孵育I小時或4°C孵育過夜；PBS洗3次，每次5分鐘；加FITC標記的兔抗鼠二抗，37°C避光I小時；PBS洗3次，.每次5分鐘；突光顯微鏡下觀察病毒陽性孔。
[0039]3、隱孔菌提取物的制備
[0040]3.1.水提物制備:用蒸餾水浸泡隱孔菌干子實體，水與隱孔菌干子實體的重量比為6: 1，4°C浸泡2-4小時，勻漿器充分攪碎至60目，4°C浸提10小時，SOOOg離心30分鐘，收集上清液，凍干，得到隱孔菌提取物保存于-20°C。用時用生理鹽水溶解并用0.22 μ m濾膜過濾。過濾后溶液保存于_80°C備用。
[0041]3.2.醇提物的制備:隱孔菌粉碎,加入6-8倍的95%的乙醇，加熱回流lh，過濾，藥渣再加95%乙醇6倍熱提I小時，濾過，濾液減壓濃縮成浸膏，用時用生理鹽水溶解并用
0.22 μ m濾膜過濾。過濾后溶液保存于-80°c備用。
[0042]4、MTT
[0043] 將細胞用培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，接種到96孔板，37°C、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24小時。用培養(yǎng)液稀釋隱孔菌提取物，以等體積的生理鹽水做溶劑對照。吸棄細胞培養(yǎng)液，加入含有提取物或生理鹽水的培養(yǎng)液，370C ,5% C02環(huán)境下培養(yǎng)48小時，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μ I DMS0，37°C孵育10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。用酶標儀在550nm波長處測吸光度，以對照組細胞存活率為100%，計算實驗組細胞存活率:
[0044]實驗組細胞存活率=0D(實驗組)/0D(對照組)X100%
[0045]5、隱孔菌提取物體外抑制流感病毒HlNl復(fù)制
[0046]MDCK細胞在96孔板中長成致密單層后接種流感病毒A/Bei jing/7/2009 (BJ09)(MOI = 0.1)，37°C孵育2小時，然后將細胞培養(yǎng)液換成含有不同濃度隱孔菌提取物及2mg/ml TPCK-treated胰酶，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集細胞上清測定病毒滴度，同時固定細胞做間接免疫熒光檢測細胞內(nèi)的病毒。
[0047]6、隱孔菌提取物在小鼠體內(nèi)抑制流感病毒
[0048]6周齡BALB/c小鼠，分為5個組,每組8只，每次實驗前用舒泰(Virbac S.A.,Carros, France ;20μ g/g體重)麻醉。兩組通過滴鼻感染103 5pfu BJ09H1N1病毒，然后給予隱孔菌提取物，一組低劑量(16.5 μ g提取物/g體重)，一組高劑量(50 μ g提取物/g體重)，攻毒后連續(xù)給予提取物8天，每天2次，灌胃和肌肉注射各一半劑量；一組小鼠只給與高劑量(50 μ g提取物/g體重)的提取物，不攻毒；一組攻毒，但是給予等量的生理鹽水；還有一組只給與等量的生理鹽水。攻毒后4天，BJ09/生理鹽水，BJ09/16.5μ g/g，或者BJ09/50 μ g/g組各取3只安樂處死，取肺檢測病毒滴度。每天觀察剩余的小鼠的臨床癥狀，一直觀察14天。期間小鼠體重下降到原來的75%以下時可判定為死亡并進行安樂死。
[0049]7、分離小鼠肺臟病毒
[0050]將小鼠用Zoletil安樂死，用酒精棉球擦拭腹部進行消毒，用消毒的剪刀、鑷子打開胸腔，將整個肺臟取下放入2ml無菌離心管中。向離心管中加入PBS(含青、鏈霉素各10000單位/ml，pH7.2)，肺臟質(zhì)量(g):PBS體積(ml)為1: 3，用組織研磨器充分研磨(頻率:30次/s，5分鐘)。將研磨液離心(8000r/min，8分鐘)，上清中即含有肺臟病毒，取上清用于病毒的滴度測定。
[0051]8、數(shù)據(jù)分析
[0052]所有數(shù)據(jù)都是獨立重復(fù)三次得到的平均值，用雙尾T-test (成對)分析差異顯著性，P ≤ 0.05 被認為差異顯著，0.01 < P ≤ 0.05 (*), 0.001 < P ≤ 0.01 (**)。
[0053]實驗結(jié)果
[0054]MDCK 細胞感染流感病毒 A/Bei jing/7/2009HlNl(BJ09/HlNl)后加入 lmg/ml 或3mg/ml的隱孔菌提取物，感染后24小時間接免疫熒光檢測細胞內(nèi)的病毒(圖1)，同時收集細胞培養(yǎng)上清測定病毒滴度(圖2)。結(jié)果顯示隱孔菌提取物能夠劑量依賴性的減少病毒對細胞的感染，并且抑制流感病毒的產(chǎn)量。lmg/ml的提取物能使病毒滴度下降為1/7，而3mg/ml的提取物則能使病毒下降為1/30。并且，隱孔菌的乙醇提取物能在25和100 μ g/ml濃度有效的抑制流感病毒HlNl在MDCK細胞中復(fù)制(圖4，圖5)。為了排除隱孔菌提取物對細胞非特異性的毒性對流感病毒復(fù)制的影響，我們用MTT實驗檢測了不同濃度提取物下MDCK細胞的存活率(圖3和圖6)。50mg/ml的水提取物作用于細胞48小時后，細胞狀態(tài)與對照相比沒有明顯差異，當(dāng)提取物濃度升高到400mg/ml時，細胞存活率下降到了小于10% (圖3)。125mg/ml的隱孔菌乙醇提取物對MDCK細胞作用于48小時后，細胞狀態(tài)與對照相比沒有明顯差異(圖6)。因此，我們確定隱孔菌提取物可以在體外抑制流感病毒復(fù)制。
[0055]動物實驗結(jié)果表明，隱孔菌提取物對正常小鼠無明顯的毒副作用。高劑量藥物能夠顯著降低因流感病毒感染導(dǎo)致的小鼠體重損失，并且有利于感染后體重的恢復(fù)。低劑量藥物也有一定效果，但不如高劑量的突出(圖7)。高、低劑量的藥物均能減輕小鼠的臨床癥狀，緩解體重損失，降低小鼠的死亡率(圖8)。高劑量藥物能使小鼠的死亡率降低60%。高、低劑量的藥物均能顯著降低病毒在小鼠臟器中的復(fù)制(圖9)。
【權(quán)利要求】
1.隱孔菌提取物在制備抑制流感病毒在寄主細胞中復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是隱孔菌子實體的水提取物或醇提物。
2.隱孔菌提取物在制備抑制流感病毒在寄主中復(fù)制的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述隱孔菌提取物是隱孔菌子實體的水提取物或醇提物。
3.隱孔菌在制備流感病毒抑制劑中的應(yīng)用。
4.隱孔囷在制備 抑制流感病毒在寄王細胞中復(fù)制的廣品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/70GK103908477SQ201410032743
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】曹麗, 斯建勇, 高麗, 劉金華, 孫怡朋 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所