一種馬鈴薯病毒的快速靈敏檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種云南馬鈴薯主栽品種麗薯6號、云薯401、宣薯2號病株中馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒4種病毒的檢測方法。本發(fā)明通過對云南馬鈴薯主栽品種麗薯6號、云薯401、宣薯2號病株中馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒4種特異性混合抗體誘捕病樣中病毒，不必提取樣品總RNA進行隨機引物逆轉(zhuǎn)錄和特異性病毒引物復合PCR反應。本方法將快速、特異的免疫沉淀與靈敏的復合RT-PCR結合，同時設置健康馬鈴薯隨機引物cDNA產(chǎn)物和相應病毒PCR特異片段陽性質(zhì)粒作為陰、陽性對照，從而快速、準確、靈敏的應用于檢測田間馬鈴薯植株樣品、抗病毒材料及田間環(huán)境疑似侵染源等方面。
【專利說明】一種馬鈴薯病毒的快速靈敏檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病毒學檢測【技術領域】，具體涉及一種馬鈴薯病毒的快速靈敏檢測方法。
【背景技術】
[0002]馬鈴薯病毒病田間表現(xiàn)癥狀復雜多樣，常見的癥狀類型可歸納如下:(1)花葉型。葉面出現(xiàn)淡綠、黃綠和濃綠相間的斑駁花葉(有輕花葉、重花葉、皺縮花葉和黃斑花葉之分)，葉片基本不變小，或葉片變小、皺縮，植株矮化。(2)卷葉型。葉緣向上卷曲，甚至呈圓筒狀，色淡，變硬革質(zhì)化，有時葉背出現(xiàn)紫紅色。(3)壞死型(或稱條斑型)。葉脈、葉柄、莖枝出現(xiàn)褐色壞死斑或連合成條斑，甚至葉片萎垂、枯死或脫落。(4)叢枝及束頂型。分枝纖細而多，縮節(jié)叢生或束頂，葉小花少，明顯矮縮。常見的馬鈴薯病毒病有3種類型?；ㄈ~型:葉面葉綠素分布不均，呈濃綠淡綠相間或黃綠相間斑駁花葉，嚴重時葉片皺縮，全株矮化，有時伴有葉脈透明；壞死型:葉、葉脈、葉柄及枝條、莖部都可出現(xiàn)褐色壞死斑，病斑發(fā)展連接成壞死條斑，嚴重時全葉枯死或萎蔫脫落；卷葉型:葉片沿主脈或自邊緣向內(nèi)翻轉(zhuǎn)，變硬、革質(zhì)化，嚴重時每張小葉呈筒狀。此外還有復合侵染，引致馬鈴薯發(fā)生條斑壞死。輕花葉病:由X病毒引起，并常與其他病毒負荷侵染。病株生育正常，僅葉片表現(xiàn)出不同的斑駁或輕微花葉，氣溫過高、過低時癥狀都易隱蔽。病毒由汁液接觸傳染。重花葉病:病株上的葉脈、葉柄及莖均有黑褐色壞死條斑，并發(fā)脆易折。感病初期葉片呈現(xiàn)斑駁花葉或有枯斑，以后背面葉脈壞死， 甚至沿葉柄蔓延至主莖。主莖發(fā)病時產(chǎn)生褐色條斑，導致全葉萎蔫，但不脫落。重花葉病由Y病毒侵染引起。Y病毒既可以通過汁液機械傳染，又可以通過蚜蟲傳染。Y病毒與X病毒混合侵染時呈現(xiàn)嚴重的皺縮花葉及矮化癥。我國發(fā)生的馬鈴薯退化，主要由這兩種病毒復合侵染所致。馬鈴薯卷葉病:病株葉片邊緣以主脈為中心向上卷曲，革質(zhì)化，葉色變淡，有的略呈紫紅色。有的病株塊莖切面呈網(wǎng)狀壞死斑。病薯產(chǎn)生的重病株，植株短化，老葉卷成筒狀。本病由馬鈴薯卷葉病毒引起，在自然條件下由蚜蟲傳染。病原為:馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒。
[0003]馬鈴薯X病毒(Potato virus J簡稱PVX)在馬鈴薯上引起輕花葉癥，有時產(chǎn)生斑駁或環(huán)斑，病毒粒體線形，長480-580納米，其寄主范圍廣，系統(tǒng)侵染的植物主要是茄科，病毒稀釋限點100000-1000000倍，鈍化溫度68~75°C，體外存活期I年以上。
[0004]馬鈴薯S病毒{Potato virus S簡稱PVS)，在馬鈴薯上引起輕度皺縮花葉或不顯癥，病毒粒體線形，長650納米，其寄主范圍較窄，系統(tǒng)侵染的植物僅限于茄科的少數(shù)植物，病汁液稀釋限點1~10倍，鈍化溫度55飛(TC，體外存活期3~4天。
[0005]馬鈴薯A病毒{PotatoJ簡稱PVA)在馬鈴薯上引起輕花葉或不顯癥病毒粒體線形，長730納米，其寄主范圍較窄，僅侵染茄科少數(shù)植物，病汁液稀釋限點10倍，鈍化溫度44~52°C，體外存活期12~18小時。
[0006]馬鈴薯Y病毒(potato virus Y簡稱PVY),在馬鈴薯上引起嚴重花葉或壞死斑和壞死條斑，病毒粒體線形，長730納米，該病毒寄主范圍較廣，可侵染茄科多種植物，病汁液稀釋限點100-1000倍，鈍化溫度52~62°C，體外存活期1~2天。
[0007]馬鈴薯卷葉病毒PoiaioFirw1S簡稱PLRV)病毒粒體球狀，直徑25納米。該病毒寄主范圍主要是茄科植物，在馬鈴薯上引起卷葉癥，病毒稀釋限點10000倍，鈍化溫度70°c，體外存活期12~24小時，ZC低溫下存活4天。此外TMV也可侵染馬鈴薯。
[0008]在馬鈴薯生長中，馬鈴薯病毒病發(fā)生危害普遍且嚴重影響了馬鈴薯產(chǎn)質(zhì)量，主要病原為馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒，但田間對這類病毒病病原難以通過癥狀區(qū)分，因此無法制定有效的病害預防措施；在研究病害侵染循環(huán)和病害發(fā)生早期，利用血清學檢測方法檢測時，其檢測靈敏度不能較好地確定不同病毒的侵染情況，因此，需要建立一種可以大量、快速、準確、靈敏的檢測方法對不同時期病樣以及田間周邊環(huán)境中病毒傳播介體、中間寄主等進行檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種馬鈴薯病毒的快速靈敏檢測方法。
[0010]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，包括前處理、PCR反應、電泳檢測步驟，具體包括:
A、前處理:待測樣品與DEPC處理的PBST溶液混合后進行研磨，離心后取上清液備用；根據(jù)GenBank序列數(shù)據(jù)庫中馬鈴薯病毒序列，選擇單一病毒中較為保守的區(qū)域設計引物，不同病毒間試驗優(yōu)化不同引物對間的相互影響，篩選用于復合PCR的不同病毒檢測引物對，在PCR管中加入用D EPC溶液稀釋的病毒特異性抗體，混合抗體包被于無RNA酶及DNA酶的PCR管備用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置0.5^1.5h以捕捉(或沉淀)對應的病毒粒子，吸出PCR管中液體，用經(jīng)DEPC處理的PBST溶液洗滌PCR管內(nèi)壁2~4次，吸出PCR管中液體，再用DEPC處理水洗滌f 2次PCR管內(nèi)壁，吸出PCR管中液體，離心，吸凈PCR管中液體，PCR管3飛。C放置待用；
B、PCR反應:在PCR管中以病毒RNA作為模板，利用9個單核苷酸堿基的隨機弓丨物進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA鏈，應用馬鈴薯病毒引物對進行復合PCR反應；
C、電泳檢測:取反應液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0011]本發(fā)明基于病毒外殼蛋白抗原與抗體反應的酶聯(lián)免疫吸附法和基于病毒核酸的PCR檢測是目前應用最為廣泛的檢測病毒的方法。免疫捕捉(或沉淀)RT-PCR結合了上述兩種方法的優(yōu)點。免疫捕捉反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(IC-RT-PCR)主要由三個部分組成，第一部分的免疫反應類似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的包被及吸附過程，第二部分為cDNA鏈的合成，第三部分即通常的PCR檢測。本發(fā)明的方法將快速、特異和高靈敏度的免疫捕捉(或沉淀)與復合RT-PCR結合，從而快速、特異的檢測樣品中的馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯卷葉病毒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明工作流程不意圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。[0014]本發(fā)明所述的馬鈴薯病毒的快速靈敏檢測方法，包括前處理、PCR反應、電泳檢測步驟，具體包括:
A、前處理:待測樣品與DEPC處理的PBST溶液混合后進行研磨，離心后取上清液備用；根據(jù)GenBank序列數(shù)據(jù)庫中馬鈴薯病毒序列，選擇單一病毒中較為保守的區(qū)域設計引物，不同病毒間試驗優(yōu)化不同引物對間的相互影響，篩選用于復合PCR的不同病毒檢測引物對，在PCR管中加入用DEPC溶液稀釋的病毒特異性抗體，混合抗體包被于無RNA酶及DNA酶的PCR管備用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置0.5^1.5h以捕捉或沉淀對應的病毒粒子，吸出PCR管中液體，用經(jīng)DEPC處理的PBST溶液洗滌PCR管內(nèi)壁2~4次，吸出PCR管中液體，再用DEPC處理水洗滌f 2次PCR管內(nèi)壁，吸出PCR管中液體，離心，吸凈PCR管中液體，PCR管3飛。C放置待用；
B、PCR反應:在PCR管中以病毒RNA作為模板，利用9個單核苷酸堿基的隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA鏈，應用馬鈴薯病毒引物對進行復合PCR反應；
C、電泳檢測:取反應液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0015]所述的“9個單核苷酸堿基的隨機引物”為購自由上海英俊生物技術有限公司、生工生物工程(上海)有限公司、寶生物工程(大連)合成。
[0016]所述的馬鈴薯病毒為馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒。
[0017]A步驟中所述的混合抗體包被為在PCR管中加入終濃度分別為1:5000、1:5000、I: 5000和1:5000的馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯卷葉病毒多抗稀釋液100μ 1，3~5°C包被過夜或36~38°C包被0.5~1.5h后，吸出PCR管中液體，用經(jīng)DEPC處理的PBST溶液洗滌PCR內(nèi)壁2飛次，吸進管中液體，PCR管待用。
[0018]所述的DEPC處理的PBST溶液為含有0.01%吐溫20的0.lmol/L,pH7.0的磷酸鹽緩沖液中加入0.2%DEPC充分混勻后放置過夜，高壓滅菌30min得到。
[0019]A步驟中所述的待測樣品與DEPC處理的PBST溶液的重量比為1:5~10。
[0020]A步驟中所述的DEPC處理水為超純水中加入0.2%DEPC充分混勻后放置過夜，121 °C高溫高壓滅菌30min得到。
[0021]A步驟中所述的離心轉(zhuǎn)速為5000~10000r/min,離心5~lOmin。
[0022]B步驟所述的RNA模板為高溫變性法、沉淀法或抗體捕獲法獲得。 [0023]B步驟所述的馬鈴薯病毒引物對為:(見表1)
表1用于復合PCR檢測的馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯Y病毒
引物
【權利要求】
1.一種馬鈴薯病毒快速靈敏檢測方法，其特征在于包括前處理、PCR反應、電泳檢測步驟，具體包括: A、前處理:待測樣品與DEPC處理的PBST溶液混合后進行研磨，離心取上清液備用；根據(jù)GenBank序列數(shù)據(jù)庫中馬鈴薯病毒序列，選擇單一病毒中較為保守的區(qū)域設計引物，不同病毒間試驗優(yōu)化不同引物對的相互影響，篩選用于復合PCR的不同病毒檢測引物對，在PCR管中加入用DEPC溶液稀釋的病毒特異性抗體，混合抗體包被于無RNA酶及DNA酶的PCR管備用；取上清液50 μ I加入PCR管中，36~38°C放置0.5^1.5h以捕捉(或沉淀)對應的病毒粒子，吸出PCR管中液體，用經(jīng)DEPC處理的PBST溶液洗滌PCR管內(nèi)壁2~4次，吸出PCR管中液體，再用DEPC處理水洗滌f 2次PCR管內(nèi)壁，吸出PCR管中液體，離心，吸凈PCR管中液體，PCR管3飛。C放置待用； B、PCR反應:在PCR管中以病毒RNA作為模板，利用9個單核苷酸堿基的隨機弓丨物進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA鏈，應用馬鈴薯病毒引物對進行復合PCR反應； C、電泳檢測:取PCR反應液5μ I進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的馬鈴薯病毒快速靈敏檢測方法，其特征在于所述的馬鈴薯病毒為馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒。
3.根據(jù)權利要求1所述的馬鈴薯病毒快速靈敏檢測方法，其特征在于A步驟中所述的混合抗體包被為在PCR管中加入終濃度分別為1:5000、1:5000、1:5000和1:5000的馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯卷葉病毒多抗稀釋液100 μ 1，3飛。C包被過夜或36~38°C包被0.5~1.5h后，吸出PCR管中液體，用經(jīng)DEPC處理的PBST溶液洗滌PCR內(nèi)壁2飛次，吸進管中液 體，PCR管待用。
4.根據(jù)權利要求1所述的馬鈴薯病毒快速靈敏檢測方法，其特征在于所述的DEPC處理的PBST溶液制備方法為:在含有0.01%吐溫20的0.lmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液中加入0.2%DEPC充分混勻后，放置過夜，高壓滅菌30min。
5.根據(jù)權利要求1所述的馬鈴薯病毒快速靈敏檢測方法，其特征在于A步驟中所述的待測樣品與DEPC處理的PBST溶液的重量比為1:5~10。
6.根據(jù)權利要求1所述的馬鈴薯病毒快速靈敏檢測方法，其特征在于A步驟中所述的DEPC處理水為超純水中加入0.2%DEPC充分混勻后放置過夜，121 °C高溫高壓滅菌30min得到。
7.根據(jù)權利要求1所述的馬鈴薯病毒快速靈敏檢測方法，其特征在于A步驟中所述的離心轉(zhuǎn)速為5000~10000r/min,離心5~lOmin。
8.根據(jù)權利要求1所述的馬鈴薯病毒快速靈敏檢測方法，其特征在于B步驟所述的RNA模板為高溫變性法、沉淀法或抗體捕獲法獲得。
9.根據(jù)權利要求1所述的馬鈴薯病毒快速靈敏檢測方法，其特征在于B步驟所述的馬鈴薯病毒引物對為:
10.根據(jù)權利要求1所述的馬鈴薯病毒快速靈敏檢測方法，其特征在于所述的PCR反應體系為50 μ L體系，其中10倍Taq酶緩沖液5 μ L、10 mmol/L濃度的6種引物各I μ L、.2.5 mmol/L dNTPs 3 μ L、Taq酶I μ L、滅菌超純水15 μ L ;反應條件為94°C預變性4min ;94°C變性lmin, 58°C退火30s，72。。延伸lmin,30個循環(huán)；最后72°C延伸10 min。
【文檔編號】C12Q1/70GK103757138SQ201410034605
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月25日 優(yōu)先權日:2014年1月25日
【發(fā)明者】丁銘, 盧訓, 張仲凱 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術與種質(zhì)資源研究所