專利名稱：一種輔助鑒定馬鈴薯a病毒的試劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定馬鈴薯A病毒的試劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
馬鈴薯A病毒(Potato virus A, PVA)，屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員， 主要在日本、美國、歐洲各國發(fā)生，我國局部分布，正在采取控制措施。PVA是我國一種重要 的進(jìn)境檢疫性植物病毒。馬鈴薯A病毒的自然寄主要為馬鈴薯，也可侵染其他茄科植物。PVA單獨侵染引 起花葉或皺葉，對馬鈴薯影響較大，嚴(yán)重時可造成減產(chǎn)40%以上(程曄，陳炯，陳劍平，杭州 郊區(qū)馬鈴薯A病毒分離物的基因組3’ -末端序列測定及系統(tǒng)化分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2002，14(2) 71-75.)。若與其它病毒如馬鈴薯X、Y病毒和馬鈴薯M病毒等復(fù)合侵染，則加重 癥狀和產(chǎn)量損失，危害更大(Hooker WJ. Compendium of Potatodisease [Μ]. St. Paul. MN The American Phytopathological Society，1981. )。PVA 能被多種蚜蟲非持久性傳播；另 外，該病毒在馬鈴薯上系統(tǒng)侵染，能夠進(jìn)入薯塊，薯塊帶毒率高，因此也能隨種薯和組培苗 傳播。由于有蚜蟲，該病毒在田間擴散容易，特別是馬鈴薯和其他茄科作物在同一地區(qū)出現(xiàn) 時，能加速該病毒的擴散。當(dāng)種薯生產(chǎn)體系尚未完全建立，自留地比較普遍時，該病毒極易 擴散。馬鈴薯具有很高的食用和經(jīng)濟價值，近年來，已上升為我國第四大糧食作物，對于 維護我糧食安全具有重要意義。許多國家看好中國馬鈴薯市場，大量的馬鈴薯種薯輸入或 將要輸入我國。引進(jìn)的馬鈴薯種薯攜帶馬鈴薯A病毒的機率極大。為了維護我國馬鈴薯這 一巨大產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展、防止馬鈴薯A病毒隨馬鈴薯種薯等進(jìn)境物傳入中國并盡量減少國際 貿(mào)易摩擦，開發(fā)出快速、靈敏檢測馬鈴薯A病毒的先進(jìn)的技術(shù)，意義重大。目前，檢測馬鈴薯A病毒的方法主要以酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)為主(王秀 芬，劉偉等，引進(jìn)加拿大馬鈴薯種薯中病毒的檢測[J].植物檢疫，2002，16(1) 16-18.；劉 洪義，李明福等，黑龍江馬鈴薯病毒病的普查及鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，37 (3) 307-310.；高海霞，鄒明強等，流式微球一步法快速免疫檢測馬鈴薯A病毒[J].微生物學(xué) 報，48(3) :380-384.)，也有少數(shù)采用RT-PCR凝膠電泳技術(shù)的研究報道(吳興泉，謝聯(lián)輝等， 福建馬鈴薯A病毒的分子鑒定及檢測技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2004，12(1) =90-95.； 袁青，殷幼平等，二重RT-PCR快速檢測馬鈴薯病毒的方法[J].植物檢疫，2005，19(3) 135-138.)。ELISA技術(shù)操作步驟繁瑣、檢測周期長、靈敏度低、易出現(xiàn)假陽性；PCR凝膠電泳 技術(shù)較ELISA在多個方面有所提高，但易于造成污染。未見采用實時熒光PCR檢測PVA的 研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定馬鈴薯A病毒的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的輔助鑒定馬鈴薯A病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的序 列5所示DNA組成。所述試劑可由所述特異引物、特異探針甲和特異探針乙組成；所述特異探針甲的 核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示。所述特異探針甲可為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述特異 探針乙可為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列6所示。所述試劑可用于制備輔助鑒定馬鈴薯A病毒的試劑盒。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定馬鈴薯A病毒的試劑盒，它包括所述試劑。所述試劑可用于輔助鑒定馬鈴薯A病毒。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定馬鈴薯A病毒的方法，包括如下步驟以待測病毒的 cDNA為模板，用特異引物對甲進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物甲；以待測病毒的cDNA為模板，用特 異弓I物對乙進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物乙；如果PCR產(chǎn)物甲為73bp且PCR產(chǎn)物乙為76bp，待測 病毒為候選的馬鈴薯A病毒；所述特異引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序 列2所示DNA組成的引物對；所述特異引物對乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序 列5所示DNA組成的引物對。本發(fā)明還保護另一種輔助鑒定馬鈴薯A病毒的方法，包括如下步驟以待測病毒 的cDNA為模板，用特異引物對甲和特異探針甲進(jìn)行實時熒光PCR，得到擴增曲線甲；以待測 病毒的cDNA為模板，用特異引物對乙和特異探針乙進(jìn)行實時熒光PCR，得到擴增曲線乙；根 據(jù)擴增曲線甲和擴增曲線乙判斷待測病毒是否為候選的馬鈴薯A病毒；所述特異引物對甲 為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述特異引物對乙 為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對；所述特異探針甲為 TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙為TaqMan探針，核苷酸 序列如序列表的序列6所示。如果所述擴增曲線甲和所述擴增曲線乙均為陽性，待測病毒 為候選的馬鈴薯A病毒。所述待測病毒具體可為馬鈴薯A病毒、馬鈴薯V病毒、馬鈴薯Y病毒或香石竹環(huán)斑病毒。本發(fā)明還保護一種檢測待測樣本中是否含有馬鈴薯A病毒的方法，包括如下步 驟(1)提取待測樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(2)以所述cDNA為模板，用特異引物對甲和特異探針甲進(jìn)行實時熒光PCR，得到擴 增曲線甲；以所述cDNA為模板，用特異引物對乙和特異探針乙進(jìn)行實時熒光PCR，得到擴增 曲線乙；根據(jù)擴增曲線甲和擴增曲線乙判斷待測樣本中是否含有馬鈴薯A病毒；所述特異 引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述特異 引物對乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對；所述特異 探針甲為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙為TaqMan探 針，核苷酸序列如序列表的序列6所示。如果所述擴增曲線甲和所述擴增曲線乙均為陽性， 待測樣本含有馬鈴薯A病毒。所述TaqMan探針5’末端具體可連接有熒光報告染料FAM，3’末端具體可連接有 熒光淬滅染料TAMRA。
不同的方法，靈敏度和準(zhǔn)確性差異較大，如ELISA與PCR凝膠電泳方法靈敏度相差 100倍以上，PCR凝膠電泳與實時熒光PCR技術(shù)靈敏度相差也在100倍以上。即使同樣采用 實時熒光PCR技術(shù)，由于引物的擴增效率不一樣，靈敏度差異也可達(dá)到1000倍以上。在實 際檢測鑒定工作中，為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，經(jīng)常需要對一個結(jié)果進(jìn)行兩個以上的確認(rèn)試 驗，不同方法檢測靈敏度不一樣，很難保證兩個試驗的結(jié)果完全一樣，這就為結(jié)果的判斷增 加了難度，特別是在檢測目標(biāo)含量極少的情況下，這種難度就會進(jìn)一步加大。若兩套方法檢 測靈敏度一樣或非常接近，這個難題就迎刃而解。實時熒光PCR(Realtime-PCR)檢測技術(shù)是國際最近十余年發(fā)展起來的高新檢測 技術(shù)，該技術(shù)將PCR擴增與熒光檢測系統(tǒng)有機結(jié)合起來。與目前已報道的其它檢測技術(shù) 相比，該技術(shù)具有巨大的優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在(a)能實時觀察PCR過程中待檢測樣品模板 DNA(或cDNA)擴增情況，無需進(jìn)行電泳、染色和紫外檢測，大大簡化了操作程序并縮短檢測 時間；(b)采用熒光信號放大功能，大大提高了靈敏度；(c)特異性引物與特異熒光探針雙 保險結(jié)構(gòu)有效提高了檢測的準(zhǔn)確性；(d)全封閉的操作系統(tǒng)，減少了 PCR產(chǎn)物對實驗室環(huán)境 的染污和樣品間的交叉染污，有效降低和避免了假陽性結(jié)果。實時熒光PCR技術(shù)，是目前最 準(zhǔn)確、最靈敏的技術(shù)，其優(yōu)越性使之在植物檢疫中具有廣闊的應(yīng)用范圍和前景。馬鈴薯A病毒(Potato virus A,PNk)是我國重要的檢疫性有害生物，本研究根據(jù) PVA中CP基因(coat protein gene)的保守序列，設(shè)計了兩套引物探針組合物(每套引物 探針組合物由上游引物、下游引物和探針組成)，建立了雙引物探針-RT-Realtime PCR檢 測PVA的方法。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點如下⑴上述實時熒光PCR技術(shù)的優(yōu)點在本發(fā) 明得以全部體現(xiàn)，如準(zhǔn)確、靈敏、簡便、快速和能有效減少污染等；(2)兩套引物探針相互驗 證，進(jìn)一步有效提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性；(3)兩套引物探針的擴增效率一致，因此對于同一個 樣品的兩次驗證實驗，結(jié)果的能保證基本一致，從而降低了結(jié)果判斷的難度，在實際檢測工 作、科研和解決重大的國際貿(mào)易爭端中具有極強的可操作性；(4)兩套引物探針的擴增效 率極高，檢出低限均可達(dá)0. 5fg/ μ 1植物總RNA。


圖1為特異性測定中試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果；縱軸為ARn，橫軸為循環(huán)數(shù)；A 為 PVA，B 為 PVV，C 為 PVY，D 為 CRSV，E 為 CK1，F(xiàn) 為 CK2。圖2為特異性測定中試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果；縱軸為Δ Rn，橫軸為循環(huán)數(shù)；A 為 PVA，B 為 PVV，C 為 PVY，D 為 CRSV，E 為 CK1，F(xiàn) 為 CK2。圖3為靈敏度測定中試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果；縱軸為Δ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù)；Α、 B、C、D、E、F、G、H、I、J 所對應(yīng)的 RNA 濃度依次為 5ng/μ l、500pg/μ l、50pg/μ l、5pg/μ 1、 500fg/ μ 1、50fg/ μ 1、5fg/ μ 1、0· 5fg/ μ 1、0· 05fg/ μ 1、0· 005fg/ μ 1，K 對應(yīng) DEPC 水。圖4為為靈敏度測定中試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果；縱軸為Δ Rn，橫軸為循環(huán)數(shù)； 八、8、(、0』、卩、6、!1、1、所對應(yīng)的 RNA 濃度依次為 5ng/μ l、500pg/μ l、50pg/μ l、5pg/μ 1、 500fg/ μ 1、50fg/ μ 1、5fg/ μ 1、0· 5fg/ μ 1、0· 05fg/ μ 1、0· 005fg/ μ 1，K 對應(yīng) DEPC 水。圖5為試劑甲和試劑乙的擴增效率對比圖；縱軸為ARn,橫軸為循環(huán)數(shù)；A為試劑 甲，B為試劑乙。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實 驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均 為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實時熒光PCR基因擴增儀為ABI PRISM 7000(美國 ABI公司)；核酸蛋白分析儀為BioPhotometer (德國印pendorf公司)；植物總RNA提取 試劑盒(商品名Ε. Ζ. N. ATM，美國Omega公司產(chǎn)品，貨號R2867_01)購自北京雙羸生物公 司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司(TaKaRa)(貨號DRR037A)、實時熒光PCR試劑盒 (Platinum 定量 PCR SuperMix-UDG，貨號C11730-025)購自美國 Invitrogen 公司。以 下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實時熒光PCR的結(jié)果的判定 標(biāo)準(zhǔn)為Ct值<40，為陽性；Ct值彡40，為陰性。馬鈴薯A 病毒(Potato Virus A, PVA) =ATCC 編號 PVAS-266 ；香石竹環(huán)斑病毒(Carnationringspot virus, CRSV) :ATCC 編號 PV-21 ；馬鈴薯V 病毒(potato V virus, PVV) =ATCC 編號 PV-754 ；馬鈴薯Y 病毒(potato virus Y, PVY) =ATCC 編號 PV-50 ；ATCC 即美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(American Type Culture Collection) , http:// www, atcc. orR/ο實施例1、試劑的制備一、引物和探針的設(shè)計根據(jù)美國NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中馬鈴薯A病毒基因組(NC_004039)中CP基因序列 保守區(qū)，分別設(shè)計兩條上游引物(PVA1F和PVA2F)、兩條下游引物(PVAIR和PVA2R)和兩條 TaqMam 探針(PVA1P 禾口 PVA2P)。二、試劑的組成1、試劑甲的組成試劑甲由PVA1F、PVA1R和PVAlP組成(引物和探針由上海生工合成)。PVAlF(上游引物)5，-CTCGCAGAGGCGTACATTGA-3，(序列表的序列 1)；PVAlR(下游引物)5，-GGTTGCGTTGAAGACCATACC-3，(序列表的序列 2)；PVAlP (探針)5，(FAM)-ATGAGAAGTCGTGAGAAACCATACATGCCC-3，(TAMARA)；(核苷 酸序列為序列表的序列3，5’端標(biāo)記報告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料TAMRA)。PVAlF和PYAlR的靶序列大小為73bp (見序列表的序列7)。2、試劑乙的組成試劑乙由PVA2F、PVA2R和PVA2P組成(引物和探針由上海生工合成)。PVA2F(上游引物)5，-GCGCTGAAGAATTCGAACACT-3，(序列表的序列 4)；PVA2R(下游引物)5，-GCCTTTCTGTGTCCTCTTCTGAA-3，(序列表的序列 5)；PVA2P (探針)5，(FAM)-TGTGACATTTCCGTCCAGTCCAAACATG-3，(TAMARA)；(核苷酸 序列為序列表的序列6，5’端標(biāo)記報告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料TAMRA)。PVA2F和PVA2R的靶序列大小為76bp (見序列表的序列8)。實施例2、試劑的應(yīng)用分別取感染四種病毒(PVA、PVV、PVY和CRSV)的馬鈴薯葉片，取健康馬鈴薯葉片作為對照、應(yīng)用實施例1制備的試劑甲和試劑乙分別進(jìn)行特異性測定、靈敏度測定，并進(jìn)行試 劑甲和試劑乙的擴增效率對比。一、試劑的特異性測定1、總RNA提取及質(zhì)量控制用植物總RNA提取試劑盒從感染每種病毒的葉片(4種)和健康葉片(CKl)中分 別提取總RNA。用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測定其OD值，得出其濃度與純度值，并以 此控制核酸質(zhì)量。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將步驟1從5種葉片中提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ； DEPC水作為總RNA的對照(CK2)。S. M W M (25 μ L) 5 μ L PrimerScript Buffer (5 X ) , 1. 25 μ L PrimerScript EnzymeMix 1,1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ Μ),1. 25 μ L Random 6 mers (100 μ Μ)，2 μ L 總 RNA,力口 DEPC 水至 25 μ L。反應(yīng)條件37°C、15min，85°C、5s。3、試劑的特異性用實時熒光PCR試劑盒和實施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進(jìn)行實時熒光PCR。試齊[J甲的反應(yīng)體系(25yL) =PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVAlF (15 μ Μ) 1 μ 1，PVAlR (15 μ Μ) 1 μ 1，PVAlP (10 μ Μ) 1 μ 1，cDNA 2. O μ 1，補充 DEPC/K至 25 μ 1。每個cDNA設(shè)置2個重復(fù)。試齊[J乙的反應(yīng)體系(25yL) :PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVA2F(15yM)ly 1，PVA2R(15 μ Μ) 1 μ 1，PVA2P (10 μ Μ) 1 μ 1，cDNA 2. 0 μ 1，補充 DEPC/K至 25 μ 1。每個cDNA設(shè)置2個重復(fù)。試劑甲和試劑乙的反應(yīng)體系均在ABI PRISM 7000的96孔板中進(jìn)行；循環(huán)條件為 50°C、2min ；95°C、2min ；95°C、15s，60°C、30s，45 個循環(huán)。采用試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果見圖1。采用試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果見圖2。 應(yīng)用試劑甲只有在PVA中出現(xiàn)擴增曲線(Ct值=21)，判為陽性；應(yīng)用試劑乙只有在PVA中 出現(xiàn)擴增曲線(Ct值=20)。PVV、PVY、CRSV、CK1和CK2均未出現(xiàn)擴增信號，判為陰性。結(jié) 果表明，試劑甲(或試劑乙)的特異性很好，結(jié)果與預(yù)計相符。二、試劑的靈敏度測定1、總RNA提取和各個稀釋液的制備用植物總RNA提取試劑盒從感染PVA的葉片中提取總RNA。用核酸蛋白分析 儀BioPhotometer測定其OD值，得出其濃度和純度值。濃度值為50ng/l·! 1，純度值為 0D260/280 = 2. 14，0D260/230 = 2. 38。用DEPC水將提取的總RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到各個稀釋液。各個稀釋液中， RNA 濃度分別為 5ng/ μ 1、500pg/ μ 1、50pg/ μ 1、5pg/ μ 1、500fg/ μ 1、50fg/ μ 1、5fg/ μ 1、 0. 5fg/y 1、0· 05fg/y 1、0· 005fg/y 1。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將各個稀釋液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的對照。S. M W M (25 μ L) 5 μ L PrimerScriρt Buffer (5 X ) , 1. 25 μ L PrimerScript EnzymeMix 1,1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ Μ), 1. 25 μ L Random 6 mers (100 μ Μ)，2 μ L 稀釋液，補充 DEPC 水至 25 μ L。反應(yīng)條件37°C、15min，85°C、5s。3、試劑的靈敏度用實時熒光PCR試劑盒和實施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進(jìn)行實時熒光PCR。試齊[J甲的反應(yīng)體系(25yL) =PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVAlF (15 μ Μ) 1 μ 1，PVAlR (15 μ Μ) 1 μ 1，PVAlP (10 μ Μ) 1 μ 1，cDNA 2. 0 μ 1，補充 DEPC/K至 25 μ 1。每個cDNA設(shè)置2個重復(fù)。試齊[J乙的反應(yīng)體系(25yL) =PCR buffer (2 X) 12. 5 μ 1, ROX 0. 5μ 1, PVA2F(15yM)ly 1，PVA2R(15 μ Μ) 1 μ 1，PVA2P (10 μ Μ) 1 μ 1，cDNA 2. 0 μ 1，補充 DEPC/K至 25 μ 1。每個cDNA設(shè)置2個重復(fù)。試劑甲和試劑乙的反應(yīng)體系均在ABI PARISM 7000的96孔板中進(jìn)行；循環(huán)條件 為50°C、2min ；95°C、2min ；95°C、15s，60°C、30s，45 個循環(huán)。采用試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果見圖3。采用試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果見圖4。 應(yīng)用試劑甲可以判為陽性的最低稀釋度為0. 5fg/yl植物總RNA(Ct值=39)；應(yīng)用試劑乙 可以判為陽性的最低稀釋度為0. 5fg/yl植物總RNA(Ct值=39)。結(jié)果表明，應(yīng)用試劑甲 (或試劑乙)檢測的靈敏度可達(dá)10_8，即0. 5fg/ μ 1植物總RNA0三、試劑甲和試劑乙的擴增效率對比1、總 RNA 提取用植物總RNA提取試劑盒從感染PVA的葉片中提取總RNA。用核酸蛋白分析儀 BioPhotometer測定其OD值，得出其濃度和純度值。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的對照。反應(yīng)體系同步驟一的2。3、試劑的靈敏度用實時熒光PCR試劑盒和實施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的 cDNA進(jìn)行實時熒光PCR。方法同步驟一的3。實時熒光PCR結(jié)果見圖5。采用試劑甲的Ct值=18 ；采用試劑乙的Ct值=17。 結(jié)果表明，試劑甲和試劑乙的擴增效率幾乎完全一樣。
權(quán)利要求
1.一種輔助鑒定馬鈴薯A病毒的試劑，包括特異引物；所述特異引物由序列表的序列 1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA 組成。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于所述試劑由所述特異引物、特異探針甲和特 異探針乙組成；所述特異探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙的 核苷酸序列如序列表的序列6所示。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于所述特異探針甲為TaqMan探針；所述特異 探針乙為TaqMan探針。
4.權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑在制備輔助鑒定馬鈴薯A病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種輔助鑒定馬鈴薯A病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑。
6.權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑在輔助鑒定馬鈴薯A病毒中的應(yīng)用。
7.一種輔助鑒定馬鈴薯A病毒的方法，包括如下步驟以待測病毒的cDNA為模板，用 特異引物對甲進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物甲；以待測病毒的cDNA為模板，用特異引物對乙進(jìn)行 PCR，得到PCR產(chǎn)物乙；如果PCR產(chǎn)物甲為73bp且PCR產(chǎn)物乙為76bp，待測病毒為候選的馬 鈴薯A病毒；所述特異引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組 成的引物對；所述特異引物對乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組 成的引物對。
8.一種輔助鑒定馬鈴薯A病毒的方法，包括如下步驟以待測病毒的cDNA為模板，用 特異引物對甲和特異探針甲進(jìn)行實時熒光PCR，得到擴增曲線甲；以待測病毒的cDNA為模 板，用特異引物對乙和特異探針乙進(jìn)行實時熒光PCR，得到擴增曲線乙；根據(jù)擴增曲線甲和 擴增曲線乙判斷待測病毒是否為候選的馬鈴薯A病毒；所述特異引物對甲為序列表的序列 1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述特異引物對乙為序列表的序列4 所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對；所述特異探針甲為TaqMan探針，核苷 酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序 列6所示。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述待測病毒為馬鈴薯A病毒、馬鈴薯 V病毒、馬鈴薯Y病毒或香石竹環(huán)斑病毒。
10.一種檢測待測樣本中是否含有馬鈴薯A病毒的方法，包括如下步驟(1)提取待測樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為CDNA；(2)以所述cDNA為模板，用特異引物對甲和特異探針甲進(jìn)行實時熒光PCR，得到擴增曲 線甲；以所述cDNA為模板，用特異引物對乙和特異探針乙進(jìn)行實時熒光PCR，得到擴增曲線 乙；根據(jù)擴增曲線甲和擴增曲線乙判斷待測樣本中是否含有馬鈴薯A病毒；所述特異引物 對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述特異引物 對乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對；所述特異探針 甲為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異探針乙為TaqMan探針，核 苷酸序列如序列表的序列6所示。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定馬鈴薯A病毒的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑包括由序列表的序列1、序列2、序列4和序列5所示DNA組成的特異引物。所述試劑還可包括序列3所示探針甲和序列6所示探針乙。馬鈴薯A病毒是我國重要的檢疫性有害生物，本發(fā)明提供了兩套PCR引物探針組合物，建立了雙引物探針-RT-Realtime PCR檢測PVA的方法。該方法采用實時熒光PCR技術(shù)，有效提高了檢測的靈敏度；兩套擴增效率一致的引物探針相互驗證確認(rèn)，有效提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實際檢測中具有較強的可操作性。本方法準(zhǔn)確、靈敏、簡便、快速，檢出低限均可達(dá)0.5fg/μl植物總RNA。
文檔編號C12Q1/68GK102002535SQ20101056113
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者朱水芳, 楊益娥, 粟智平, 耿金培, 趙文軍, 陳洪俊, 魯閩 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 煙臺出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心