專利名稱：一種快速檢測馬鈴薯y病毒煙草分離物不同株系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種快速檢測馬鈴薯Y病毒煙草分離物 不同株系的方法。
背景技術(shù)：
馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是馬鈴薯病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y 病毒屬(Potyvirus)的典型成員。在東亞地區(qū)、中南美洲、加拿大、墨西哥、哥斯達(dá)黎加及美 國均有發(fā)生，我國各主要煙區(qū)亦普遍發(fā)生，該病毒還可侵染茄科、莧科、藜科、菊科和豆科的 120余種植物。馬鈴薯Y病毒病毒粒子呈彎曲線狀，無包膜，長約700nm，直徑11 13nm，螺旋對 稱結(jié)構(gòu)，可在感病寄主體內(nèi)形成風(fēng)輪狀內(nèi)含體。標(biāo)準(zhǔn)沉降常數(shù)S20w= 154S，氯化銫中的浮 力密度為1. 33g/cm3。煙葉粗汁液的鈍化溫度為55°C，10min，稀釋限點(DEP)為1X10—4，體 外存活期(LIV) 5 10天。病毒核酸為單分子線形正義ssRNA，長9496nt，基因組結(jié)構(gòu)具有典型馬鈴薯Y病毒 屬病毒結(jié)構(gòu)特征，核酸約占病毒粒子重量的5%。病毒外殼蛋白由一種多肽組成，分子質(zhì)量 約 30 47kDa。馬鈴薯Y病毒基因組RNA具有典型的馬鈴薯Y病毒屬病毒基因組結(jié)構(gòu)特征，其5' 端為VPg結(jié)構(gòu)，3'端為Poly(A)尾。基因組編碼一個多聚蛋白，切割產(chǎn)生10個蛋白，分別 為Pl蛋白(功能未知)、HC-Pro蛋白(與蚜蟲傳播相關(guān))、P3蛋白(功能未知)、6K1蛋白 (功能未知)、CI蛋白(柱狀內(nèi)含體蛋白)、6Κ2蛋白(功能未知)、NIa-VPg蛋白(即VPg 蛋白)、NIa-Pro蛋白(核內(nèi)含體蛋白酶)、NIa蛋白(核內(nèi)含體復(fù)制酶)和外殼蛋白?；诓《就鈿さ鞍卓乖贵w反應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附法和基于病毒核酸的PCR檢測 是目前應(yīng)用最為廣泛的檢測病毒的方法。免疫捕捉RT-PCR結(jié)合了上述兩種方法的優(yōu)點。免 疫捕捉反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(IC-RT-PCR)主要由三個部分組成，第一部分的免疫反應(yīng)類 似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的測定過程，第二部分為第一鏈cDNA的合成，第三 部分即通常的PCR檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種馬鈴薯Y病毒煙草分離物不同株系的鑒定方法。本發(fā)明為快速的檢測大量樣品，將免疫捕捉反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(IC-RT-PCR) 主要有三個組成部分，第一部分的免疫反應(yīng)類似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的測 定過程，第二部分的第一鏈cDNA的合成，第三部分的PCR檢測，用一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)試劑盒將后兩步合并為一步。整個技術(shù)省略了繁瑣的RNA提取、第一鏈cDNA的合成以 及PCR產(chǎn)物回收、克隆和病毒核苷酸序列測定與分析等步驟，利用抗體的高效價及特異性， 特異快速的獲得目的片段，通過簡單的酶切反應(yīng)鑒定病樣中馬鈴薯Y病毒的不同株系，為 研究病毒的分子變異提供了一種快速、特異和高靈敏度的方法，從而簡化了 RT-PCR技術(shù)鑒定馬鈴薯Y病毒的不同株系的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下1)用馬鈴薯Y病毒特異抗體誘捕馬鈴薯Y病毒；
2)高溫變性獲得病毒RNA作為模板；3)利用馬鈴薯Y病毒不同株系外殼蛋白基因簡并引物進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；4)利用限制性內(nèi)切酶EcoR V對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；5)瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段。結(jié)果分析吸附在PCR管壁上的馬鈴薯Y病毒特異性抗血清能捕捉煙草病樣中的 馬鈴薯Y病毒病毒粒子，一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(one step RT-PCR)擴增產(chǎn)物經(jīng)酶 切后得到大小約為260bp和540bp的兩條片段或者僅含有一條約SOObp的片段，與報道的 馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因0株系和C株系(PVY°，PVYe)在病毒核苷酸堿基序列263位置有 一個EcoR V酶切位點相符，而馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因N株系和NTN株系(PVYn，PVYntn) 在該位置沒有EcoR V酶切位點。因此，通過酶切反應(yīng)可以區(qū)分馬鈴薯Y病毒0株系和C株 系與N株系和NTN株系的差異。未經(jīng)馬鈴薯Y病毒抗血清吸附的PCR管中沒有擴增到目的 片段。表明IC-RT-PCR方法利用免疫結(jié)合原理可以捕捉到病株汁液中微量的病毒，進(jìn)行PCR 檢測，同時利用簡單的酶切反應(yīng)可以快速的鑒定馬鈴薯Y病毒不同株系。電泳結(jié)果中如果含有約260bp和540bp的片段，說明樣品中含有馬鈴薯Y病毒0 株系或C株系，否則含有馬鈴薯Y病毒N株系或NTN株系。本發(fā)明的方法將快速、特異和高靈敏度的免疫捕捉RT-PCR與快捷的PCR產(chǎn)物酶切 鑒定，從而快速、簡便的檢測馬鈴薯Y病毒煙草分離物不同株系。


圖1是檢測昭通、玉溪、保山煙草樣品中的馬鈴薯Y病毒不同株系的電泳檢測結(jié)^ ο
具體實施例方式1.引物設(shè)計上游引物5‘ -TGCATATGGSAAATGACACAATCGATGCAG-3 ‘下游引物5'-CCAAGCTTCATGTTCTTSACTCCAAGTARA-3'用于擴增馬鈴薯Y病毒不同株系外殼蛋白基因區(qū)域SOlbp片段；2.病毒粒子的免疫捕捉在PCR管中加入稀釋為1 5000的馬鈴薯Y病毒兔多抗血清，4°C下包被過夜后， 吸出PCR管中液體，用含有0. 2%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(0. lmol/L,pH7. 0)洗滌PCR管內(nèi) 壁3次，吸出PCR管中液體，備用；煙草病樣用含有0.2%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(0. Imol/ L，pH7. 0)研磨，IOOOg離心lmin，取100 μ L上清液加入上述PCR管中，溫育3h后，吸出PCR 管中液體，用含有0. 2%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(0. lmol/L,pH7. 0)洗滌PCR管內(nèi)壁3次， 吸出PCR管中液體，再用滅菌的0.2%焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水洗滌1次PCR管內(nèi)壁， 吸出PCR管中液體，短暫離心后，吸凈PCR管內(nèi)的液體。
3.高溫變性
加25 μ L滅菌的0. 2%焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的超純水，97°C變性5min,即刻插入冰內(nèi)放置預(yù)冷3-5min ；
4. 一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(one step RT-PCR)
應(yīng)用大連寶生物公司一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(one step RT-PCR)試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系
lOXOne-step RT-PCR Buffer5 μ L
25mmol/L MgCl210 μ L
10mmol/L dNTPs5 μ L
5U/μ L AMV Reverse Transcriptase XL1 μ L
40U/μ L RNase Inhibitor1 μ L
5U/y L AMY-Optimized Taq1 μ L
0. 1 μ g/μ L上下游引物各IyL
反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件
50°C溫育 40min ；94°C變性 3min ；94°C變性 40s，50°C退火 40s，72°C延伸 lmin，反應(yīng)30循環(huán)；72°C延伸lOmin，降至常溫；
5.酶切反應(yīng)
應(yīng)用大連寶生物公司EcoR V限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切反應(yīng)體系
10XH Buffer 2μ L
PCR 產(chǎn)物 IOyL
滅菌超純水 7 μ L
EcoR V限制性內(nèi)切酶 IyL
酶切反應(yīng)條件
37°C酶切4小時；65°C處理lOmin，終止酶切反應(yīng)，降至常溫；
6.電泳檢測PCR反應(yīng)結(jié)束后取5μ L反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，在0. 5ΧΤΒΕ緩沖液 環(huán)境中，80V穩(wěn)壓電泳1. 5h，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。電泳結(jié)果中如果含有約260bp和540bp的片段，說明樣品中含有馬鈴薯Y病毒0 株系或C株系，否則含有馬鈴薯Y病毒N株系或NTN株系。
權(quán)利要求
一種快速檢測馬鈴薯Y病毒煙草分離物不同株系的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行1)用馬鈴薯Y病毒特異抗體誘捕馬鈴薯Y病毒；2)高溫變性獲得病毒RNA作為模板；3)利用馬鈴薯Y病毒不同株系外殼蛋白基因簡并引物進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；4)利用限制性內(nèi)切酶EcoR V對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；5)瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬鈴薯Y病毒煙草分離物不同株系的檢測方法，其特征在于 誘捕馬鈴薯Y病毒是在PCR管中加入稀釋為1 5000的馬鈴薯Y病毒兔多抗血清，4°C下包 被過夜后，吸出PCR管中液體，用含有0. 2%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌PCR管內(nèi)壁3次， 吸出PCR管中液體，備用；煙草病樣用含有0. 2%吐溫20的磷酸鹽緩沖液研磨，IOOOg離心 Imin，取100 μ L上清液加入上述PCR管中，溫育3h后，吸出PCR管中液體，用含有0. 2%吐 溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌PCR管內(nèi)壁3次，吸出PCR管中液體，再用滅菌的0. 2%焦碳酸二 乙酯處理的水洗滌1次PCR管內(nèi)壁，吸出PCR管中液體，短暫離心后，吸凈PCR管內(nèi)的液體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬鈴薯Y病毒煙草分離物不同株系的檢測方法，其特征在于 一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)高溫變性獲得病毒RNA模板時，加25μ L滅菌的0. 2%焦碳酸 二乙酯處理的超純水至上述處理的PCR管中，97°C變性5min，即刻將PCR管插入冰內(nèi)放置預(yù) 冷 3-5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬鈴薯Y病毒煙草分離物不同株系的檢測方法，其特征在于 馬鈴薯Y病毒不同株系外殼蛋白基因簡并引物為上游引物5 ‘ -TGCATATGGSAAATGACACAATCGATGCAG-3 ‘下游引物5 ‘ -CCAAGCTTCATGTTCTTSACTCCAAGTARA-3 ‘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬鈴薯Y病毒煙草分離物不同株系檢測方法，其特征在于利 用限制性內(nèi)切酶EcoR V對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切時，酶切反應(yīng)條件為37°C酶切4小時；65°C處 理lOmin，終止酶切反應(yīng)，降至常溫。
全文摘要
本發(fā)明是一種馬鈴薯Y病毒煙草分離物不同株系的檢測方法。通過馬鈴薯Y病毒特異性抗體誘捕病株樣品中的馬鈴薯Y病毒、高溫變性獲得病毒RNA作為模板、利用馬鈴薯Y病毒不同株系外殼蛋白基因簡并引物進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(one stepRT-PCR)、利用限制性內(nèi)切酶EcoR V對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段。該方法將快速、特異和高靈敏度的免疫捕捉RT-PCR與快捷的PCR產(chǎn)物酶切鑒定，從而快速、簡便的檢測馬鈴薯Y病毒煙草分離物不同株系。
文檔編號C12Q1/68GK101974654SQ20101051928
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者丁銘, 付修庭, 卯志勇, 張仲凱, 張磊, 方琦, 游堂貴, 秦西云, 董家紅, 趙聲春, 陸文林, 黃韡 申請人:云南省煙草公司昭通市公司;云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所;云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院