輔助鑒定馬鈴薯病毒的特異引物對及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輔助鑒定馬鈴薯病毒的特異引物對及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一組引物對組合物，由序列1和序列2所示DNA分子組成的引物對甲、序列3和序列4所示DNA分子組成的引物對乙和序列5和序列6所示DNA分子組成的引物對丙組成?？捎糜谳o助鑒定馬鈴薯病毒并可用于檢測待測植物樣本是否感染馬鈴薯病毒。采用本發(fā)明提供的特異引物對組合，可以快速、準(zhǔn)確、靈敏的同步檢測出馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒，具有高穩(wěn)定性、高靈敏性、低突變性、低毒性等特點(diǎn)，可以廣泛的推廣應(yīng)用。
【專利說明】輔助鑒定馬鈴薯病毒的特異引物對及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種輔助鑒定馬鈴薯病毒的特異引物對及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]馬鈴薯是世界上僅次于水稻、小麥和玉米的第四大農(nóng)作物。我國是世界馬鈴薯第一生產(chǎn)大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)，“十五”期間，馬鈴薯年均種植面積7015.9萬畝，占全世界總面積的1/4，年產(chǎn)量1，415.60萬噸，占世界年總產(chǎn)量的1/5。
[0003]馬鈴薯因具有耐旱、耐寒、耐瘠薄、適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，全國大部分地區(qū)的土壤及氣候條件都可滿足其生產(chǎn)。中國是一個(gè)人口大國，耕地減少和人口增加的矛盾不可逆轉(zhuǎn)，水資源日益緊缺、擴(kuò)大有效灌溉面積難度較大，大力發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)對確保糧食安全，促進(jìn)農(nóng)民增收，振興農(nóng)村區(qū)域經(jīng)濟(jì)具有重要的戰(zhàn)略意義。
[0004]馬鈴薯病毒病分布于世界各馬鈴薯種植區(qū)，可導(dǎo)致馬鈴薯退化，產(chǎn)量降低，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)80%以上，是當(dāng)前馬鈴薯生產(chǎn)中的主要限制因子。在我國由北向南馬鈴薯帶毒率逐漸增高，造成我國中部和南部不能自行留種，必須從北部發(fā)病輕的地區(qū)引種，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前馬鈴薯上已發(fā)現(xiàn)多種病毒、類病毒，已報(bào)道的有25種以上病毒或病毒病，所幸的是其中僅有少數(shù)病毒危害嚴(yán)重，如馬鈴薯X病毒、Y病毒、S病毒、卷葉病毒等。
[0005]目前，對于馬鈴薯病毒檢測方法概括起來主要有3大類。即指示植物法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、RT-PCR法，以下分別作一介紹。指示植物是經(jīng)過篩選的對某種病毒有?；苑磻?yīng)的植物。例如千日紅對X病毒的反應(yīng)是接種后在葉片上出現(xiàn)紅色病斑；洋酸漿對Y病毒的反應(yīng)是種后在葉片上出現(xiàn)小枯斑；地霉松對A病毒的反應(yīng)是在葉片上出現(xiàn)許多小型點(diǎn)狀病斑等。早期鑒定PSTV株系的方法是用指示植物Rutgers番茄進(jìn)行重復(fù)接種。但是指示植物法周期長，需要嚴(yán)格的環(huán)境條件，很難用于大規(guī)模檢測。ELISA方法經(jīng)濟(jì)簡便，快速直觀，但其也存在一定的缺點(diǎn):首先是抗體的制備所需時(shí)間長，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，其次它一次只能檢測一種病毒，檢測多種病毒時(shí)靈敏度降低。此外，此法在檢測病毒時(shí)還經(jīng)常存在假陽性反應(yīng)，給脫毒苗的檢測帶來困難。目前應(yīng)用于馬鈴薯病毒檢測的試劑盒多利用酶免法，這種方法受到血清學(xué)方法本身的靈敏度和假陽性的限制，無法對病毒進(jìn)行高靈敏度和準(zhǔn)確性的診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定馬鈴薯病毒的特異引物對及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供了一組引物對組合物，由特異引物對甲、特異引物對乙和特異引物對丙組成；所述特異引物對甲由序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成；所述特異引物對乙由序列表的序列3所示DNA分子和序列表的序列4所示DNA分子組成；所述特異引物對丙由序列表的序列5所示DNA分子和序列表的序列6所示DNA分子組成。
[0008]所述引物對組合物可用于輔助鑒定馬鈴薯病毒。[0009]所述引物對組合物可用于檢測待測植物樣本是否感染馬鈴薯病毒。
[0010]所述引物組合物可用于制備試劑盒。
[0011]所述引物組合物和陽性標(biāo)準(zhǔn)品可用于制備試劑盒；所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為重組質(zhì)粒甲、重組質(zhì)粒乙和重組質(zhì)粒丙；所述重組質(zhì)粒甲是將序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子插入pMD18-T載體得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒乙是將序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子插入PMD18-T載體得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒丙是將序列表的序列9所示的雙鏈DNA分子插入pMD18-T載體得到的重組質(zhì)粒。
[0012]所述試劑盒的功能為如下(a)或(b):
[0013](a)輔助鑒定馬鈴薯病毒；
[0014](b)輔助檢測待測植物樣本是否感染馬鈴薯病毒。
[0015]本發(fā)明還保護(hù)一種應(yīng)用所述引物對組合物輔助鑒定馬鈴薯病毒的方法，包括如下步驟:
[0016]以待測病毒的cDNA為模板，同時(shí)采用所述特異引物對甲、所述特異引物對乙和所述特異引物對丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種且大小為250-500bp (具體可為381-401bp，更具體可為391bp)，所述待測病毒為候選的馬鈴薯X病毒；如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種，且大小為100-250bp (具體可為221-241bp，更具體可為231bp)，所述待測病毒為候選的馬鈴薯S病毒；如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種，且大小為500-750bp (具體可為614-634bp，更具體可為624bp)，所述待測病毒為候選的馬鈴薯卷葉病毒。
[0017]本發(fā)明還保護(hù)一種應(yīng)用所述引物對組合物輔助鑒定馬鈴薯病毒的方法，包括如下步驟:`
[0018]以待測病毒的cDNA為模板，分別采用所述特異引物對甲、所述特異引物對乙和所述特異引物對丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；如果采用所述特異引物對甲得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種且大小為250-500bp (具體可為381-401bp，更具體可為391bp)，所述待測病毒為候選的馬鈴薯X病毒；如果采用所述特異引物對乙得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種且大小為100-250bp (具體可為221-241bp，更具體可為231bp)，所述待測病毒為候選的馬鈴薯S病毒；如果采用所述特異引物對丙得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種且大小為500-750bp (具體可為614-634bp，更具體可為624bp)，所述待測病毒為候選的馬鈴薯卷葉病毒。
[0019]本發(fā)明還保護(hù)一種應(yīng)用所述引物對組合物輔助檢測待測植物樣本是否感染馬鈴薯病毒的方法，包括如下步驟:
[0020]以待測植物樣本的cDNA為模板，同時(shí)采用所述特異引物對甲、所述特異引物對乙和所述特異引物對丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0021]如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種且大小為250_500bp (具體可為381_401bp，更具體可為391bp)，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯X病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種且大小為100-250bp (具體可為221-241bp，更具體可為231bp)，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯S病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種且大小為500-750bp (具體可為614-634bp，更具體可為624bp)，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯卷葉病毒；
[0022]如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有兩種，且大小分別為250_500bp(具體可為381_401bp，更具體可為391bp)和100-250bp (具體可為221-241bp，更具體可為231bp)，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯X病毒和馬鈴薯S病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有兩種，且大小分別為250-500bp(具體可為381-40Ibp，更具體可為39Ibp)和500_750bp (具體可為614_634bp，更具體可為624bp)，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯X病毒和馬鈴薯卷葉病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有兩種，且大小分別為100-250bp (具體可為221-241bp，更具體可為231bp)和500_750bp(具體可為614-634bp，更具體可為624bp)，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒 ；
[0023]如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有三種，且大小分別為250_500bp(具體可為381_401bp，更具體可為391bp)、100-250bp (具體可為221_241bp，更具體可為231bp)和500_750bp (具體可為614-634bp，更具體可為624bp)，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒；
[0024]如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不為以上所述任何一種，所述待測植物樣本疑似未感染馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒。
[0025]本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成的特異引物對。
[0026]所述特異引物對可用于輔助鑒定馬鈴薯X病毒。
[0027]所述特異引物對可用于輔助檢測待測植物樣本是否感染馬鈴薯X病毒。
[0028]所述特異引物對可用于制備試劑盒的應(yīng)用；所述試劑盒的功能為如下(C)或(d):
[0029](C)輔助鑒定馬鈴薯X病毒；
[0030](d)輔助檢測待測植物樣本是否感染馬鈴薯X病毒。
[0031]以上任一所述馬鈴薯病毒具體可為馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒。以上任一所述待測植物樣本具體可為馬鈴薯植物樣本。
[0032]本發(fā)明公開了用于輔助鑒定馬鈴薯病毒的特異引物對，具有良好的特異性和靈敏度，采用本發(fā)明提供的特異引物對組合，可以快速、準(zhǔn)確、靈敏的同步檢測出馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒?？蓪⒈景l(fā)明提供的三對特異引物對組合得到試劑盒，用于馬鈴薯病毒的檢測，具有高穩(wěn)定性、高靈敏性、低突變性、低毒性等特點(diǎn)，可以廣泛的推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為特異弓丨物對甲的特異性。
[0034]圖2為特異弓丨物對乙的特異性。
[0035]圖3為特異引物對丙的特異性。
[0036]圖4為特異引物對甲檢測馬鈴薯X病毒的靈敏度。
[0037]圖5為特異引物對乙檢測馬鈴薯S病毒的靈敏度。
[0038]圖6為特異引物對丙檢測馬鈴薯卷葉病毒的靈敏度。
[0039]圖7為應(yīng)用特異引物對檢測染病植物。
【具體實(shí)施方式】
[0040]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。pMD18-T 購自 TaKaRa，貨號(hào):D101A。
[0041]馬鈴薯X病毒(PVX):公眾可以從中國科學(xué)院微生物研究所獲得；參考文獻(xiàn):王春香，高謙，潘乃機(jī)，陳章良.(1991)馬鈴薯X病毒外殼蛋白基因的cDNA克隆和全序列測定?植物學(xué)報(bào)，33 (5):363-369.。
[0042]馬鈴薯S病毒(PVS):公眾可以從中國科學(xué)院微生物研究所獲得；參考文獻(xiàn):李廣存，楊煜，王秀麗，李元軍，畢玉平.(2004)馬鈴薯S病毒外殼蛋白基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá).園藝學(xué)報(bào)，31 (4):517-519.。
[0043]馬鈴薯卷葉病毒(PLRV):公眾可以從中國科學(xué)院微生物研究所獲得；參考文獻(xiàn):路平，王蒂，司懷軍.(2005)馬鈴薯卷葉病毒的RT-PCR快速檢測.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),4(40):532-534.。
[0044]實(shí)施例中所用的馬鈴薯植株均為中薯3號(hào)，購自中國農(nóng)科院蔬菜花卉所。
[0045]2 X PCR buffer:含有 KCl 100mmol/L、MgCl 8mmol/L、dNTPs lmmol/L、Taq 酶 1U/U L、 Tris-Cl (PH8.3) 50mmol/L、10% (體積比)EvaGreen 染料(購自 Biotum 生物公司，貨號(hào):31000)，其余為水。
[0046]實(shí)施例1、馬鈴薯病毒引物的設(shè)計(jì)
[0047]根據(jù)三種馬鈴薯病毒的保守序列設(shè)計(jì)馬鈴薯X病毒(PVX)特異性引物20對、馬鈴薯S病毒(PVS)特異性引物20對、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)的特異性引物18對。經(jīng)過篩選和優(yōu)化，得到PVX、PVS、PLRV的特異性引物各1對，具體如下:
[0048]針對PVX的特異引物對(又稱特異引物對甲，靶序列為39 1bp ):
[0049]上游引物F1:5’ -ACTGCAGGCGCAACTCCTGCCACAG-3’(序列表的序列 1)；
[0050]下游引物R1:5’ -GTGCTTGCCAGTTAGCAGGTGGAC-3’(序列表的序列 2)。
[0051 ] 針對PVX的特異引物對(又稱特異引物對乙，靶序列為23 1bp ):
[0052]上游引物F2:5’-ATCGATGAGCTGTTCAAGATGG-3’(序列表的序列 3);
[0053]下游引物R2:5’ -GATCGAGTCCAAGGGCACTGCGCC-3’(序列表的序列 4)。
[0054]針對PLRV的特異引物對(又稱特異引物對丙，靶序列為624bp ):
[0055]上游引物F3:5’ -AGTACGGTCGTGGTTAAAGGAAATG-3’(序列表的序列 5)；
[0056]下游引物R3:5’ -CTATTTGGGGTTTTGCAAAGCCAC-3’(序列表的序列 6)。
[0057]實(shí)施例2、引物對的特異性(單重RT-PCR)
[0058]一、特異引物對甲的特異性
[0059]分別將馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒進(jìn)行如下步驟:
[0060]1、提取病毒的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0061]2、以步驟I的cDNA為模板，采用特異引物對甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0062]PCR 擴(kuò)增體系:模板 2 μl，2 XPCR buffer 10 μl，上游引物(20 μM) 1 μl，下游引物(20μM) 1 u l，ddH20 6 μL。
[0063]PCR 擴(kuò)增條件:94°C 3min ；94°C 30s、58°C 30s、72°C 30s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C 10min。
[0064]3、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1(圖1中，泳道1為分子量標(biāo)記，泳道2為馬鈴薯X病毒，泳道3為馬鈴薯S病毒，泳道4為馬鈴薯卷葉病毒)。結(jié)果表明，特異引物對甲特異性針對馬鈴薯X病毒(在250bp-500bp之間具有特異條帶)，與其它馬鈴薯病毒沒有交叉反應(yīng)?；厥仗禺悧l帶并進(jìn)行測序，其大小為391bp。
[0065]二、特異引物對乙的特異性
[0066]分別將馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒進(jìn)行如下步驟:
[0067]1、提取病毒的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0068]2、以步驟I的cDNA為模板，采用特異引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。[0069]PCR擴(kuò)增體系和PCR擴(kuò)增條件同步驟一。
[0070]3、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2(圖2中，泳道I為分子量標(biāo)記，泳道2為馬鈴薯S病毒，泳道3為馬鈴薯X病毒，泳道4為馬鈴薯卷葉病毒)。結(jié)果表明，特異引物對乙特異性針對馬鈴薯S病毒(在100bp-250bp之間具有特異條帶)，與其它馬鈴薯病毒沒有交叉反應(yīng)?；厥仗禺悧l帶并進(jìn)行測序，其大小為231bp。
[0071]三、特異引物對丙的特異性
[0072]分別將馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒進(jìn)行如下步驟:
[0073]1、提取病毒的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0074]2、以步驟I的cDNA為模板，采用特異引物對丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0075]PCR擴(kuò)增體系和PCR擴(kuò)增條件同步驟一。
[0076]3、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3(圖3中，泳道I為分子量標(biāo)記，泳道2為馬鈴薯卷葉病毒，泳道3為馬鈴薯S病毒，泳道4為馬鈴薯X病毒)。結(jié)果表明，特異引物對丙特異性針對馬鈴薯卷葉病毒(在500bp-750bp之間具有特異條帶)，與其它馬鈴薯病毒沒有交叉反應(yīng)?；厥仗禺悧l帶并進(jìn)行測序，其大小為624bp。
[0077]實(shí)施例3、引物對的靈敏度
[0078]一、特異引物對甲的靈敏度
[0079]1、提取馬鈴薯X病毒的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用核酸蛋白分析儀測定cDNA濃度，經(jīng)測定，PVX的cDNA濃度為501.5ng/ U I。
[0080]2、用無菌水將 cDNA 稀釋為 400ng/ u l、300ng/ u l、200ng/ u 1> IOOng/ u l、50ng/U l>25ng/u I和10ng/iil七個(gè)濃度梯度的稀釋液(按濃度從高至低，依次命名為稀釋液I至稀釋液7)。
[0081]3、分別以各個(gè)稀釋液為模板，采用特異引物對甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0082]PCR擴(kuò)增體系和PCR擴(kuò)增條件同實(shí)施例2的步驟一。
[0083]4、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖4(圖4中，泳道I為分子量標(biāo)記；泳道2-8依次代表以稀釋液I至稀釋液7為模板)。特異引物對甲檢測馬鈴薯X病毒的最低濃度為50ng/ V-1。
[0084]二、特異引物對乙的靈敏度
[0085]1、提取馬鈴薯S病毒的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用核酸蛋白分析儀測定cDNA濃度，經(jīng)測定，PVS的cDNA濃度為460.4ng/ U I。
[0086]2、用無菌水將 cDNA 稀釋為 400ng/ u l、300ng/ u l、200ng/ u 1> IOOng/ u l、50ng/U l>25ng/u I和10ng/iil七個(gè)濃度梯度的稀釋液(按濃度從高至低，依次命名為稀釋液I至稀釋液7)。
[0087]3、分別以各個(gè)稀釋液為模板，采用特異引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0088]PCR擴(kuò)增體系和PCR擴(kuò)增條件同實(shí)施例2的步驟一。
[0089]4、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖5(圖5中，泳道I為分子量標(biāo)記；泳道2-8依次代表以稀釋液I至稀釋液7為模板)。特異引物對乙檢測馬鈴薯S病毒的最低濃度為50ng/ V-1。
[0090]三、特異引物對丙的靈敏度
[0091]1、提取馬鈴薯卷葉病毒的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用核酸蛋白分析儀測定cDNA濃度，經(jīng)測定，PLRV的cDNA濃度為568.4ng/ U I。
[0092]2、用無菌水將 cDNA 稀釋為 400ng/ u l、300ng/ii l、200ng/ii lU00ng/u l、50ng/U l>25ng/u I和10ng/iil七個(gè)濃度梯度的稀釋液(按濃度從高至低，依次命名為稀釋液I至稀釋液7)。
[0093]3、分別以各個(gè)稀釋液為模板，采用特異引物對丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0094]PCR擴(kuò)增體系和PCR擴(kuò)增條件同實(shí)施例2的步驟一。
[0095]4、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖6(圖6中，泳道I為分子量標(biāo)記；泳道2-8依次代表以稀釋液I至稀釋液7為模板)。特異引物對丙檢測馬鈴薯卷葉病毒的最低濃度為25ng/ V-1。
[0096]實(shí)施例4、應(yīng)用特異引物對檢測染病植物
`[0097]將馬鈴薯X病毒接種健康馬鈴薯植株，10天后取出現(xiàn)發(fā)病表征的葉片，作為植物樣本甲。將馬鈴薯S病毒接種健康馬鈴薯植株，10天后取出現(xiàn)發(fā)病表征的葉片，作為植物樣本乙。將馬鈴薯卷葉病毒接種健康馬鈴薯植株，10天后取出現(xiàn)發(fā)病表征的葉片，作為植物樣本丙。馬鈴薯X病毒引起的發(fā)病表征為:馬鈴薯3、4片葉時(shí)產(chǎn)生輕葉癥，有時(shí)葉脈間出現(xiàn)壞死斑。馬鈴薯S病毒引起的發(fā)病表征為:葉背面產(chǎn)生條斑，葉卷曲，或葉表面呈油光、皺縮、條斑。馬鈴薯卷葉病毒引起的發(fā)病表征為:葉片向上卷曲，葉變厚，發(fā)脆。
[0098]1、提取植物樣本甲的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為cDNA樣本甲。
[0099]2、提取植物樣本乙的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為cDNA樣本乙。
[0100]3、提取植物樣本丙的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為cDNA樣本丙。
[0101]4、分別進(jìn)行如下幾組PCR體系的PCR擴(kuò)增:
[0102]PCR體系-1:cDNA樣本甲2 iil，2 XPCR buffer 10 yl，特異引物對甲的上游引物(20iiM) liil，特異引物對甲的下游引物(20iiM) liil，ddH20 6 u 10
[0103]PCR體系-2:cDNA樣本乙2 iil，2 XPCR buffer 10 yl，特異引物對乙的上游引物(20iiM) liil，特異引物對乙的下游引物(20iiM) liil，ddH20 6 u 10
[0104]PCR體系-3:cDNA樣本丙2 iil，2 XPCR buffer 10 yl，特異引物對丙的上游引物(20iiM) liil，特異引物對丙的下游引物(20iiM) liil，ddH20 6 u 10
[0105]PCR 體系-4:cDNA 樣本甲 Iii 1，cDNA 樣本乙 Iii 1，2XPCR buffer IOy 1，特異引物對甲和特異引物對乙的上游引物(20 ii M)各I ill，特異引物對甲和特異弓丨物對乙的下游引物(20iiM)各 I u 1，ddH20 I。
[0106]PCR 體系-5:cDNA 樣本甲 Iii 1，cDNA 樣本丙 Iii 1，2XPCR buffer IOy 1，特異引物對甲和特異引物對丙的上游引物(20 ii M)各I ill，特異引物對甲和特異弓丨物對丙的下游引物(20iiM)各 I u 1，ddH20 4u I。
[0107]PCR 體系-6:cDNA 樣本乙 Iii 1，cDNA 樣本丙 Iii 1，2XPCR buffer IOy 1，特異引物對乙和特異引物對丙的上游引物(20 ii M)各I ill，特異引物對乙和特異引物對丙的下游引物(20iiM)各 I u 1，ddH20 I。
[0108]PCR 體系-7:cDNA 樣本甲 0.1，cDNA 樣本乙 0.7 y 1，cDNA 樣本丙 0.7 y 1，2XPCRbuffer 10 iil，特異引物對甲、特異引物對乙和特異引物對丙的上游引物(20 PM)各I iil，特異引物對甲、特異引物對乙和特異引物對丙的下游引物(20 PM)各I yl，ddH201.9u 10
[0109]PCR擴(kuò)增條件同實(shí)施例2的步驟一。
[0110]PCR體系-1、PCR體系-3和PCR體系-5的1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖7A，其中泳道I為分子量標(biāo)記，泳道2為PCR體系-3，泳道3為PCR體系-1，泳道4為PCR體系_5。
[0111]PCR體系-2、PCR體系-3和PCR體系-6的結(jié)果見圖7B，其中泳道I為分子量標(biāo)記，泳道2為PCR體系-3，泳道3為PCR體系-2，泳道4為PCR體系-6。
[0112]PCR體系-1、PCR體系-2和PCR體系_4的結(jié)果見圖7C，其中泳道I為分子量標(biāo)記，泳道2為PCR體系-1，泳道3為PCR體系-2，泳道4為PCR體系-4。
[0113]PCR體系-1、PCR體系-2、PCR體系_3和PCR體系_7的結(jié)果見圖7D，其中泳道I為PCR體系-3，泳道2為PCR體系-1，泳道3為PCR體系-2，泳道4為PCR體系-7，泳道5為分子量標(biāo)記。
[0114]在雙重PCR中都有兩條明亮的條帶，大小與預(yù)期相符。三重PCR中出現(xiàn)三條與預(yù)期相符的條帶。結(jié)果表明，三對特 異引物對在同一管PCR反應(yīng)體系中具有較好地兼容性。
[0115]實(shí)施例5、陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備和應(yīng)用
[0116]一、陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0117]合成序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子，插入PMD18-T載體，得到重組質(zhì)粒甲。
[0118]合成序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子，插入pMD18-T載體，得到重組質(zhì)粒乙。
[0119]合成序列表的序列9所示的雙鏈DNA分子，插入pMD18-T載體，得到重組質(zhì)粒丙。
[0120]二、陽性標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用
[0121]1、以重組質(zhì)粒甲為模板，采用特異引物對甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只顯示一條帶，即391bp的條帶。
[0122]2、以重組質(zhì)粒乙為模板，采用特異引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只顯示一條帶，即231bp的條帶。
[0123]3、以重組質(zhì)粒丙為模板，采用特異引物對丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只顯示一條帶，即624bp的條帶。
【權(quán)利要求】
1.引物對組合物，由特異引物對甲、特異引物對乙和特異引物對丙組成；所述特異引物對甲由序列表的序列I所示DNA分子和序列表的序列2所示DNA分子組成；所述特異引物對乙由序列表的序列3所示DNA分子和序列表的序列4所示DNA分子組成；所述特異引物對丙由序列表的序列5所示DNA分子和序列表的序列6所示DNA分子組成。
2.權(quán)利要求1所述引物對組合物在輔助鑒定馬鈴薯病毒中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述引物對組合物在輔助檢測待測植物樣本是否感染馬鈴薯病毒中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述引物組合物在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b): (a)輔助鑒定馬鈴薯病毒； (b)輔助檢測待測植物樣本是否感染馬鈴薯病毒。
5.應(yīng)用權(quán)利要求1所述引物對組合物輔助鑒定馬鈴薯病毒的方法，包括如下步驟: 以待測病毒的cDNA為模板，同時(shí)采用所述特異引物對甲、所述特異引物對乙和所述特異引物對丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種且大小為250-500bp，所述待測病毒為候選的馬鈴薯X病毒；如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種且大小為100-250bp，所述待測病毒為候選的馬鈴薯S病毒；如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一種且大小為500-750bp，所述待測病毒為候選的馬鈴薯卷葉病毒。
6.應(yīng)用權(quán)利要求1所述引物 對組合物輔助檢測待測植物樣本是否感染馬鈴薯病毒的方法，包括如下步驟: 以待測植物樣本的cDNA為模板，同時(shí)采用所述特異引物對甲、所述特異引物對乙和所述特異引物對丙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種且大小為250-500bp，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯X病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種且大小為100-250bp，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯S病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種且大小為500-750bp，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯卷葉病毒； 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有兩種，且大小分別為250-500bp和100-250bp，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯X病毒和馬鈴薯S病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有兩種，且大小分別為250-500bp和500-750bp，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯X病毒和馬鈴薯卷葉病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有兩種，且大小分別為100-250bp和500-750bp，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒； 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有三種，且大小分別為250-500bp、100-250bp和500_750bp，所述待測植物樣本疑似感染馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒； 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不為以上所述任何一種，所述待測植物樣本疑似未感染馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒和馬鈴薯卷葉病毒。
7.序列表的序列I所不DNA分子和序列表的序列2所不DNA分子組成的特異引物對。
8.權(quán)利要求7所述特異引物對在輔助鑒定馬鈴薯X病毒中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求7所述特異引物對在輔助檢測待測植物樣本是否感染馬鈴薯X病毒中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求7所述特異引物對在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的功能為如下(c)或(d): (c)輔助鑒定馬鈴薯X病毒； (d)輔助檢測待測植物樣本是否感 染馬鈴薯X病毒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103509878SQ201210208281
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月21日
【發(fā)明者】仲乃琴, 武曉敏, 馬銀平, 董彥旭, 馬瓊, 蒙靜, 沈振榮 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所