一種產(chǎn)除莠霉素的菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬微生物藥物領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)除莠霉素的菌株及其應(yīng)用，該菌株經(jīng)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征及16SrDNA基因分析，鑒定其為一株吸水鏈霉菌（Streptomyceshygroscopicus）。已于2013年12月6日在中國普通微生物菌種保藏管理中心進(jìn)行登記，保藏編號：CGMCCNo.8544。該菌發(fā)酵上清液中活性成分用有機(jī)溶劑萃取后，經(jīng)紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、核磁共振波譜及質(zhì)譜檢測分析，證實(shí)其活性成分為HerbimycinA（除莠霉素A），屬于苯醌安莎類抗生素，發(fā)酵水平可達(dá)1500μg/mL以上，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，提取方便，組分單一，產(chǎn)品質(zhì)量好。HerbimycinA具有重要的生物學(xué)活性，可作為器官移植抗排斥藥物，具有廣譜除草活性，有微弱的抗細(xì)菌和抗真菌活性。此外，HerbimycinA對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。
【專利說明】一種產(chǎn)除莠霉素的菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從自然界分離藥用微生物，具體涉及一種產(chǎn)除莠霉素的菌株及其應(yīng)用，屬于微生物藥物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，陸地放線菌是抗菌、抗腫瘤以及免疫抑制劑等多種藥物的重要來源。土壤放線菌產(chǎn)生的抗生素也已在農(nóng)業(yè)上廣泛應(yīng)用。安莎類抗生素為一個(gè)脂肪鏈(稱為安莎橋)連接于芳香環(huán)的兩個(gè)不相鄰原子間的一類化合物，其分子結(jié)構(gòu)中的芳香環(huán)有兩種:苯環(huán)和萘環(huán)。因此，安莎類抗生素可以分為苯安莎類抗生素和萘安莎類抗生素兩種。
[0003]由吸水鏈霉菌產(chǎn)生的Herbimycin A (除莠霉素A)屬于苯安莎類抗生素。它具有重要的生物學(xué)活性，不但具有廣譜的除草作用，還有抗細(xì)菌(革蘭陽性菌和革蘭陰性菌)、抗霉、抗酵母和抗原蟲等活性，是一種新型的強(qiáng)效免疫抑制劑。免疫抑制劑的主要功能是異源器官移植抗排斥反應(yīng)和人自身免疫性疾病治療，因此，Herbimycin A在器官移植的抗排異反應(yīng)中，將可能得到廣泛應(yīng)用。此外，Herbimycin A具有很好的抗腫瘤增殖的作用，具有極其重要的開發(fā)和研究價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)除莠霉素的菌株及其應(yīng)用。是從自然界尋找藥用微生物，其中一株來 源于土壤的放線菌SH035，其發(fā)酵代謝產(chǎn)物，含生理活性物質(zhì)，經(jīng)提取純化，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0005]一種產(chǎn)除莠霉素的菌株，所述菌株為吸水鏈霉菌(Sirepio焊cm hygroscopicus)SH035，已于2013年12月6日在中國普通微生物菌種保藏管理中心登記保蕆，保藏編號為CGMCC N0.8544。
[0006]所述菌株的代謝產(chǎn)物經(jīng)HPLC、質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)確定，該代謝產(chǎn)物為除莠霉素，與除莠霉素A同質(zhì)。
[0007]所述菌株在抗腫瘤及抗生素藥物方面的應(yīng)用。
[0008]具體方法為:
1、該放線菌SHO 3 5篩選自福建莆田市坪洋村雞角髻山上采集的土壤中，經(jīng)分離獲得具有抗細(xì)菌、真菌和腫瘤細(xì)胞活性的放線菌菌株，命名為吸水鏈霉菌
SHO35,于2013年12月6日在中國普通微生物菌種保藏管理中心登記保蕆，保藏編號為CGMCC N0.8544。
[0009]2、根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征(圖1)、培養(yǎng)特征、生理生化特征和16SrDNA序列比對分析及其進(jìn)化樹構(gòu)建(圖2)，確定該菌株為吸水鏈霉菌，命名為吸水鏈霉菌SH035。
[0010]3、吸水鏈霉菌SH035代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確定。其發(fā)酵上清液中的活性成分，經(jīng)有機(jī)溶劑萃取，濃縮，精制，高效液相色譜(HPLC)，質(zhì)譜(MS)和核磁共振波譜檢測分析，確定該活性成分為Herbimycin A，與除莠霉素同質(zhì)。[0011]4、該出發(fā)菌株的除莠霉素發(fā)酵單位可達(dá)1500 μ g/mL以上，發(fā)酵條件經(jīng)簡單優(yōu)化后，高達(dá)5000 μ g/mL以上,滿足產(chǎn)業(yè)化要求。
[0012]5、發(fā)酵主要培養(yǎng)基組成:葡萄糖1.5%，淀粉3.0%，黃豆餅粉3.5%，玉米粉2.0%，MgS04 0.5%, CaC03 0.2%,淀粉酶 0.01%, pH 7.2。
[0013]6、代謝產(chǎn)物提取精制。發(fā)酵液經(jīng)酸化，過濾，去除固體物，得到濾液，經(jīng)溶媒萃取，濃縮，蒸干，洗滌，得到干品，即為Herbimycin Α。提取方便，組分單一，產(chǎn)品質(zhì)量好，收率可達(dá)70%以上，含量可達(dá)98%以上。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本申請的吸水鏈霉菌SH035,其生物合成Henbimycin A的發(fā)酵單位可達(dá)1500 μ g/mL以上，發(fā)酵條件經(jīng)簡單優(yōu)化后，高達(dá)5000 μ g/mL以上，滿足產(chǎn)業(yè)化要求。本發(fā)明提供的代謝產(chǎn)物Herbimycin A，提取方便，組分單一，產(chǎn)品質(zhì)量好，收率可達(dá)70%以上，含量可達(dá)98%以上，這些優(yōu)勢未見報(bào)道。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1吸水鏈霉菌SH035的菌絲形態(tài)(a)和菌落形態(tài)(b)，光鏡(X 1000)。
[0016]圖2吸水鏈霉菌SH035的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。
[0017]圖3 Herbimycin A的結(jié)構(gòu)不意圖。
[0018]圖4 Herbimycin A 的 HPLC 分析圖。
[0019]圖5 Herbimycin A 的質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】`
[0020]實(shí)施例1:菌株SH035的篩選分離
從福建莆田市坪洋村雞角髻山上采集的土壤分離獲得多個(gè)菌株，經(jīng)過初篩和復(fù)篩后得到具有抑菌活性的放線菌，其中一株編號為放線菌SH035。
[0021]實(shí)施例2:放線菌SH035菌株的鑒定
2.1菌落特征觀察:用高氏I號培養(yǎng)基、察氏(Czapck)培養(yǎng)基、葡萄糖門冬酰胺培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)，涂布于以上5種培養(yǎng)基平板上，28°C恒溫培養(yǎng)3至5天，待其長出孢子后，觀察單菌落形態(tài)以及孢子顏色。
[0022]高氏I號培養(yǎng)基:菌落較大，圓形，邊緣整齊，表面干燥且有皺狀隆起，初期為白色，形成孢子后呈淺灰色，氣生菌絲為灰色，基內(nèi)菌絲為淡黃色。
[0023]葡萄糖門冬酰胺培養(yǎng)基:菌落較小，圓形，形成的孢子為白色，菌落周邊不產(chǎn)孢子，氣生菌絲為灰白色，基內(nèi)菌絲為淡黃色，菌落表面有水珠產(chǎn)生。
[0024]察氏培養(yǎng)基:菌落圓形，邊緣整齊，菌落表面干燥，形成的孢子為灰色，氣生菌絲灰色，基內(nèi)菌絲灰色。
[0025]馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基:菌落圓形，邊緣整齊，中間凸起，菌落表面長滿了豐富的灰白色孢子，氣生灰白色，基內(nèi)菌絲降黃色到褐色。
[0026]淀粉培養(yǎng)基:菌落較小，圓形，不透明，邊緣整齊，菌落表面不形成孢子，孢子絲為灰白色，基內(nèi)菌絲為淺黃色。
[0027]附培養(yǎng)基配方法:
高氏 I 號培養(yǎng)基:可溶性淀粉 2%, KNO3 0.1%，MgSO4.7H20 0.05%, K2HPO4.3H20 0.05%,NaCl 0.05%, FeSO4.7H20 0.001%,瓊脂 2%, pH 7.4 ~7.6。
[0028]察氏(Czapck)培養(yǎng)基:蔗糖3%, NaNO3 0.2%，MgSO4.7H20 0.05%，K2HPO4.3H20
0.1%，KCl 0.05%, FeSO4.7H20 0.001%，瓊脂 2%, pH 自然。
[0029]葡萄糖門冬酰胺培養(yǎng)基:葡萄糖1%，天冬酰胺0.05%, K2HPO4.3H20 0.05%,瓊脂2%, pH 7.2 ~7.4。
[0030]淀粉培養(yǎng)基:可溶性淀粉0.2%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%, NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH7.0 ~7.2。
[0031]馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。
[0032]2.2菌絲體特征觀察:采用插片法以及深層培養(yǎng)法觀察待測菌菌絲的形態(tài)以及孢子特征。插片法:取待測菌菌懸液涂布于高氏I號固體培養(yǎng)基上，用鑷子夾取已滅過菌的蓋玻片，以大約45°角斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，每平板插3-4片。將插片后的平板倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3-5天后用鑷子小心取出蓋玻片，然后將有菌的一面蓋在載玻片上，直接用顯微鏡觀察待測菌的氣生菌絲、基內(nèi)菌絲及孢子的著生情況。深層培養(yǎng)法:由此從形態(tài)上初步確定待測菌的分類地位。
[0033]2.3生理生化特征觀察:明膠液化緩慢，牛奶胨化不凝固，可以水解淀粉，在纖維素上生長緩 慢，硝酸鹽不還原，不產(chǎn)生黑色素和h2s。該菌能廣泛利用多種糖類，其中以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖較為合適，蔗糖、棉子糖、甘露醇、果糖、鼠李糖、肌醇和半乳糖次之。
[0034]2.4分子生物學(xué)鑒定:通過提取SH035基因組DNA和16S rDNA PCR擴(kuò)增，SH035擴(kuò)增出的16S rDNA片段長度為1584bp，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。與鏈霉菌屬(.Streptomyces sp.)在遺傳上很相近,鑒定該菌株為一株新的吸水鏈霉菌,其進(jìn)化樹見圖2。
[0035]實(shí)施例3:吸水鏈霉菌SH035發(fā)酵代謝產(chǎn)物的制備
3.1菌株復(fù)壯培養(yǎng):將分離保存的吸水鏈霉菌SH035，接種至高氏I號固體培養(yǎng)基上，于28 °C條件下，恒溫培養(yǎng)至試管斜面長滿孢子，供后續(xù)使用。
[0036]3.2發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)液組成:葡萄糖1.5%，淀粉3.0%，黃豆餅粉3.5%，玉米粉
2.0%, MgSO4 0.5%, CaCO3 0.2%，淀粉酶適量，pH 1.2。每1000mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液180 mL;配制后121°C滅菌20 min，待冷卻至室溫在無菌條件下用接種環(huán)挑取一環(huán)吸水鏈霉菌SH035孢子接種，在28°C條件下，搖床轉(zhuǎn)速180 rpm，發(fā)酵培養(yǎng)144 h，發(fā)酵單位可達(dá)2000~5000 μ g/mL。
[0037]3.3代謝產(chǎn)物提取:發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液，加鹽酸酸化到pH 2.0，靜置30 min,氫氧化鈉溶液回調(diào)到pH 7.0后，離心收集發(fā)酵液，去除固體物。上清濾液加入四分之一體積的乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)真空濃縮，得到黃色固體，即為高純度代謝產(chǎn)物，收率70%以上，含量達(dá)98以上，供后續(xù)結(jié)構(gòu)分析確定。
[0038]實(shí)施例4:吸水鏈霉菌SH035發(fā)酵代謝產(chǎn)物的鑒定
發(fā)酵提取精制的代謝產(chǎn)物，經(jīng)HPLC (圖4)，MS (5)和氫核磁共振氫譜及碳核磁共振碳譜(表1)分析，綜合分析結(jié)果，分子式為=C3tlH42N2O9，分子量為:574.3。推測其化學(xué)結(jié)構(gòu)為herbimycin A (圖 3)。
[0039]表1菌株SH035代謝產(chǎn)物1H和13C NMR數(shù)據(jù)
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)除莠霉素的菌株，其特征在于:所述菌株為吸水鏈霉菌(5?/.--/7?θ?_7----5.hygroscopicus)SH035,已于2013年12月6日在中國普通微生物菌種保藏管理中心登記保蕆，保藏編號為CGMCC N0.8544。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)除莠霉素的菌株，其特征在于:所述菌株的代謝產(chǎn)物經(jīng)HPLC、質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)確定，該代謝產(chǎn)物為除莠霉素，與除莠霉素A同質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)除莠霉素的菌株在抗腫瘤及抗生素藥物方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK103805543SQ201410035955
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】洪文榮, 林藝輝, 陳成立 申請人:福州大學(xué), 福州市鼓樓區(qū)榮德生物科技有限公司