Tat核心肽段在制備高效、可溶性表達的外源蛋白中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明TAT核心肽段在制備高效、可溶性表達的外源蛋白中的應用，公開了一種利用TAT核心肽段促進原核表達體系高效、可溶性表達外源蛋白的方法及其專用表達載體。通過本發(fā)明的實施，不僅可以獲得可溶性的外源蛋白，而且還可以獲得高產量的外源蛋白，為大量制備具有生物活性的外源蛋白奠定基礎和提供關鍵技術，解決了生物工程和藥物研發(fā)等領域外源蛋白難以高效表達的難題，從而可顯著節(jié)約后續(xù)進行外源蛋白分離純化的成本。
【專利說明】TAT核心肽段在制備高效、可溶性表達的外源蛋白中的應用
[0001]本發(fā)明是申請日2010年3月8日，申請?zhí)?01010119397.8，發(fā)明名稱為“利用TAT核心肽段促進外源蛋白可溶性表達的方法及其專用表達載體”的專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明屬于生物技術產品應用領域，涉及大量外源蛋白的制備方法，特別涉及TAT核心肽段在制備高效、可溶性表達的外源蛋白中的應用以及一種利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的方法及其專用表達載體。
【背景技術】
[0003]眾所周知，蛋白質是機體生命活動的重要執(zhí)行者，也是目前市場上大量使用的蛋白類藥物的物質基礎。如何實現有功能的、高活性蛋白質的大量制備并進一步顯著提升生物制品的生產效率，不僅是生物工程領域亟待解決的問題，而且還是基于蛋白質藥物研發(fā)領域的一大難題。
[0004]TAT (Trans-activator transduction)是 HIV-1(Human ImmunodeficiencyVirus-1)編碼的一段富含堿性氨基酸序列的多肽，屬于蛋白轉導結構域家族的成員，目前的研究揭示該家族主要還包括Antp、HSV VP22和人工合成的多聚精氨酸和多聚賴氨酸等，能夠介導多種外源物質如蛋白質、核酸和其他顆粒性物質(如納米材料)等通過所有生物膜性結構，而不失去外源物質的活性。
[0005]根據病毒株的不同，TAT全長含有86-102個氨基酸不等，核心區(qū)含有11個氨基酸(YGRKKRRQRRR)。Frankel與Green分別于1988年獨立證明全長TAT多肽能夠跨膜轉導入細胞，激活HIV-LTR的啟動子,繼而激活后續(xù)蛋白的表達(Frankel et al, Cellular uptakeof the TAT protein from human immunodeficiency virus.Celll988, 55(6):1189-1193 ；Green et al,Autonomous functiona`l domains of chemically synthesized humanimmunodeficiency virus TAT trans-activator protein.Celll988, 55(6):1179-1188)；1994年，Fawel等研究進一步揭不TAT具有蛋白轉導活性(Fawell et al, TATnediateddelivery of heterologous proteins into cells.Proc Natl Acad Sci U SA1994, 91 (2):664-668);而Vives等于1997年揭示TAT中一段富含堿性氨基酸、帶正電荷的核心肽段具有蛋白轉導活性，后續(xù)許多研究都是基于TAT核心區(qū)的跨膜轉導功能展開(Vives et al, A truncated HIV-1TAT protein basic domain rapidly translocatesthrough the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus.J BiolCheml997, 272 (25): 16010-16017)。但直到目前為止，所有的研究僅停留在TAT介導外源物質跨膜轉導現象的層面，沒有資料介紹對TAT多肽其它功能的研究。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明目的在于提供TAT核心肽段在制備可溶性表達的外源蛋白中的應用。[0007]本發(fā)明公開了一種利用TAT核心肽段(氨基酸序列:序列表中序列3)促進外源蛋白高效、可溶性表達的專用表達載體。
[0008]本發(fā)明所提供的專用表達載體，是含有一個或多個TAT核心多肽編碼區(qū)的原核表達載體。
[0009]所述TAT核心多肽編碼區(qū)為能夠根據三聯體密碼組合成其氨基酸序列的任意核酸編碼序列，如序列I所示的tayggnmgna araarmgnmg ncarmgnmgn mgn序列，其中y=a、t、g或c, m=a、t、g或c, n=a、t、g或c, r=a、t、g或c ;優(yōu)選的核苷酸序列可如序列表中序列2所不的 tacggcagga agaagcggag acagcgacga aga。
[0010]用于構建所述專用表達載體的出發(fā)載體可為任意一種外源基因的原核表達載體，如 pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-T0P0、pET101/D-T0P0 或 PQE30 等，優(yōu)選為 pET28。
[0011]其中，以PET28為出發(fā)載體構建的專用表達載體為pET28b_TAT。
[0012]所述外源蛋白包括有生物活性的外源蛋白(例如NGB)以及有指示功能的蛋白(例如 EGFP)。
[0013]另一方面，用以上所述的專用表達載體構建的帶外源基因的原核表達載體也屬于本發(fā)明。具體的，可以為圖2(B)所構建的原核表達載體pET28b-TAT-EGFP，或圖6(B)所構建的原核表達載體pET28b-TAT-NGB。 [0014]本發(fā)明還公開了一種利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的方法。
[0015]本發(fā)明所提供的利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的方法，可包括以下步驟:
[0016]I)將外源基因插入上述專用表達載體中，得到含有TAT核心多肽編碼區(qū)和外源基因的原核表達載體；
[0017]2)將原核表達載體向原核表達體系轉化；
[0018]3)原核表達載體的誘導表達；
[0019]4)外源蛋白的制備。
[0020]制備得到的外源蛋白可采用SDS-PAGE、免疫印跡和熒光顯微鏡觀察等方法鑒定。
[0021]在上述外源蛋白的表達方法中，步驟I)中的原核表達載體中，所述TAT核心肽段可以是一個拷貝或多個拷貝與外源蛋白的核酸編碼序列相連接；所述TAT核心肽段編碼區(qū)可以置于外源蛋白編碼序列的上游或下游。
[0022]步驟2)中的原核表達體系可為大腸桿菌或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。
[0023]所述大腸桿菌可為E.coli BL21 (DE3)、E.coli BL21 (DE3)plys、BLR(DE3)、B834、DH5a、HBlOl 或 JM109 等。
[0024]上述重組表達載體和重組菌均可按照常規(guī)方法構建。
[0025]步驟3)中可采用化學試劑誘導外源基因在宿主細胞中表達，其中，化學試劑誘導表達條件可為:采用500mL搖瓶發(fā)酵(150mL/瓶)；誘導劑IPTG誘導表達(終濃度ImM)；誘導表達的OD6tltl=0.6-1.0 ;誘導表達時間6-8小時。
[0026]此外，還可低溫誘導外源蛋白的表達，低溫誘導表達條件為:采用平皿涂布制備克??；4°C低溫誘導表達；誘導表達時間4天。
[0027]步驟4)中外源蛋白的制備方法可為:用預冷的PBS重懸菌體后超聲破碎、離心。
[0028]本發(fā)明提出了 TAT核心肽段促進原核表達體系高效可溶性表達外源蛋白的新用途，并具體提供了一種利用TAT核心肽段促進原核表達體系高效、可溶性表達外源蛋白的方法及其專用表達載體。經檢測，表達產物主要以可溶性的形式存在宿主菌裂解上清中，且占裂解上清總蛋白的25-30%。通過本發(fā)明的實施，不僅可以獲得可溶性的外源蛋白，而且還可以獲得高產量的外源蛋白，可為大量制備具有生物活性的外源蛋白奠定基礎和提供關鍵技術，可望解決生物工程和藥物研發(fā)領域等外源蛋白難以高效表達的部分難題，從而可顯著節(jié)約后續(xù)進行外源蛋白分離純化的成本等。雖然TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的具體機制還有待進一步研究，但是這種通過與TAT核心肽段融合而促進外源蛋白高效、可溶性表達的技術不僅可用于顯著提升外源蛋白的表達量并促進其形成正確的折疊構象，而且在提高原核表達生產水平和提升生物工程產品生產效率等方面也具有十分重要的應用價值。因此，本發(fā)明具有十分廣泛的應用前景，有望成為生物工程研究和藥物研發(fā)的重要技術手段。[0029]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為本發(fā)明利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達方法的流程圖
[0031]圖2為原核表達載體pET28b-EGFP/TAT-EGFP構建示意圖
[0032]圖3為離心后誘導表達菌體示意圖
[0033]圖4為TAT-EGFP和EGFP蛋白表達情況鑒定分析
[0034]圖5為熒光顯微鏡觀察分析TAT-EGFP和EGFP的熒光信號強弱
[0035]圖6為原核表達載體pET28b-NGB/TAT-NGB構建示意圖
[0036]圖7為離心后誘導表達菌體示意圖
[0037]圖8為TAT-NGB菌液裂解上清示意圖
[0038]圖9為TAT-NGB和NGB蛋白表達情況鑒定分析
[0039]圖10為熒光顯微鏡觀察及分析TAT-EGFP和EGFP熒光信號變化
【具體實施方式】
[0040]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0041]實施例1、構建利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的專用表達載體pET28b-TAT
[0042]首先通過化學合成的方法合成含有酶切位點為NcoI (上游)和NdeI (下游)的雙鏈TAT的核心編碼序列片段(本實施例中選用序列表中序列2)，然后采用限制性內切酶NcoI和NdeI雙酶切該核心片段和空載體pET28b，分別回收目的片段后，經T4DNA連接酶連接外源DNA片段和空載體，轉化入感受態(tài)細胞BL21 (DE3)。按照常規(guī)方法提取質粒DNA并進行NcoI和NdeI雙酶切鑒定，最后送英駿公司直接測序，確證含有TAT核心片段的原核表達載體pET28b-TAT構建成功，為后續(xù)TAT功能的鑒定奠定了基礎。
[0043]實施例2、利用TAT核心肽段促進增強型綠色熒光蛋白(EGFP)高效、可溶性表達
[0044]如圖1所示，用本發(fā)明的方法促進增強型綠色熒光蛋白(EGFP)高效、可溶性表達，具體方法包括以下步驟:
[0045]一、構建攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼基因的原核表達載體pET28b-TAT-EGFP 和 pET28b_EGFP
[0046]1、通過聚合酶鏈式反應技術(PCR)擴增目的基因EGFP
[0047]通過常規(guī)PCR方法擴增出EGFP的cDNA片段，50 μ I PCR反應體系為:模板DNA0.5 μ I ； 10 X dNTP5 μ I ； 10 X LA Taq 緩沖液 5 μ I ;上下游引物各 0.5 μ I ;LA Taq 酶
0.25 μ 1，ddH2038.25 μ I。PCR 反應條件為:95°C 2 分鐘；95°C 30 秒，56°C 45 秒，72°C 60 秒(32個循環(huán))-JTC 7分鐘。反應結束后，對PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約717bp的目的片段。
[0048]2、限制性內切酶分別酶切目的基因EGFP、載體pET28b和pET28b_TAT
[0049]如圖2所示(⑷:pET28b多克隆位點示意圖；(B):原核表達載體pET28b-TAT-EGFP的構建示意圖；(C):原核表達載體pET28b_EGFP的構建示意圖)，用限制性內切酶EcoR I和Not I切割目的基因EGFP和載體pET28b-TAT，用限制性內切酶BamH I和Xho I切割目的基因EGFP和載體pET28b，回收酶切產物后用T4DNA連接酶連接，將連接產物轉化涂布LB平皿。
[0050]3、鑒定
[0051]將長出的克隆分別通過限制性內切酶酶切及測序鑒定，得到序列及插入位置均正確的攜帶TAT核心肽段編碼區(qū)和EGFP的原核表達載體pET28b-TAT-EGFP和作為對照的攜帶EGFP的原核表達載體pET28b-EGFP。
[0052]二、轉化宿主大腸桿菌及菌體復蘇
[0053]將步驟一構建正確的原核表達載體pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP轉化入大腸桿菌BL21(DE3)并涂布至LB平皿待長出克隆，各組分別挑取一個克隆接種到5mL含有Kana+(終濃度100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌約16小時，待菌體完全復蘇。
[0054]三、原核表達載體pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP的誘導表達
[0055]將復蘇的菌液稀釋至OD6qq=0.8，然后吸取5mL菌液接種到150mL含有Kana+ (終濃度 100 μ g/mL)的 LB 培養(yǎng)基中，37°C、220rpm 搖菌約 4-5 小時后測定 OD6tltl,待 OD6tltl=0.6-1.0時迅速加入誘導劑IPTG (終濃度ImM)，并于30°C、220rpm誘導表達6小時。在誘導表達O小時、2小時、4小時和6小時時各組分別取菌液IOmL待制備樣品檢測。
[0056]四、蛋白樣品的制備
[0057]上述誘導表達菌液于4°C、12000rpm離心10分鐘收集菌體，然后于4°C低溫下拍照，如圖3所示(左邊兩個為TAT-EGFP離心菌體，右邊兩個為EGFP離心菌體。)，從實驗結果可以直觀地看出TAT-EGFP表現出明顯的綠色熒光，且其熒光信號明顯強于EGFP，這說明制備的TAT-EGFP具有顯著的活性；預冷的PBS重懸菌體后超聲破碎，制備總蛋白；另取預冷的PBS重懸菌體后超聲破碎，在4°C、12000rpm離心收集上清和沉淀，分別制備上清蛋白和沉淀蛋白樣品待鑒定。
[0058]五、蛋白樣品鑒定
[0059]1、SDS-PAGE和免疫印跡鑒定
[0060]上述制備的蛋白樣品分別采用15% SDS-PAGE和免疫印跡鑒定，然后采用ImageJ圖像分析軟件和0rigin8.0統計軟件分析作圖，結果如圖4所示((A):15% SDS-PAGE鑒定；(B):免疫印跡鑒定；(C):柱狀圖顯示)。從圖中可以看出，TAT-EGFP和EGFP蛋白均以可溶性的形式表達于上清中，且TAT-EGFP總蛋白表達量及上清蛋白表達量明顯高于EGFP(參見圖4中(A)和(B))，柱狀圖分析也顯示了同樣的結果(圖4中(C)，**:P〈0.01，與EGFP比較)。上述實驗數據顯示TAT核心肽段不僅能夠提高外源蛋白的表達量，而且能夠促進外源蛋白可溶性表達。
[0061]2、熒光顯微鏡觀察
[0062]結果如圖5所示((A):圖像采集及組合分析；⑶=TAT-EGFP和EGFP圖片放大2倍的效果圖)，從圖中可以看出TAT-EGFP的熒光信號明顯強于EGFP，而對照組未見任何熒光信號(圖5 (A));當將TAT-EGFP和EGFP組合圖片放大后，還可以清楚地看到TAT-EGFP單個細胞的熒光強度也明顯強于EGFP(圖5 (B))。
[0063]實施例3、利用TAT核心肽段促進人源腦紅蛋白(rhNGB)高效、可溶性表達
[0064]如圖1所示，用本發(fā)明的方法促進人源腦紅蛋白(rhNGB)高效、可溶性表達，具體方法包括以下步驟:
[0065]一、構建攜帶人源腦紅蛋白(rhNGB)編碼基因的原核表達載體pET28b-TAT-NGB和pET28b-NGB
[0066]1、通過聚合酶鏈式反應技術(PCR)擴增目的基因NGB
[0067]通過常規(guī)PCR方法擴增出NGB的cDNA片段，50μ I PCR反應體系為:質粒模板 0.5μ I ;10Χ(1ΝΤΡ5μ I ;10XEx Taq 緩沖液 5 μ I ;上下游引物各 0.5 μ I ;Ex Taq 酶
0.25 μ l,ddH2038.25 μ L.PCR 反應條件為:95°C 4 分鐘；95°C 45 秒，56°C 30 秒，72°C 45 秒(30個循環(huán))-JTC 7分鐘。反應結束后，對PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約453bp的目的片段。
`[0068]2、限制性內切酶分別酶切目的基因NGB、載體pET28b和pET28b_TAT
[0069]如圖6所示((A):pET28b多克隆位點示意圖；⑶原核表達載體pET28b_TAT_NGB的構建示意圖；(C):原核表達載體pET28b-NGB的構建示意圖)，用限制性內切酶BamH I和Xho I切割目的基因NGB和載體pET28b-TAT，用限制性內切酶BamH I和Xho I切割目的基因NGB和載體pET28b-TAT，回收酶切產物后用T4DNA連接酶連接，將連接產物轉化涂布LB平皿。
[0070]3、鑒定
[0071]將長出的克隆分別通過限制性內切酶酶切及測序鑒定，得到序列及插入位置均正確的攜帶TAT核心肽段編碼區(qū)和NGB的原核表達載體pET28b-TAT-NGB和作為對照的攜帶NGB的原核表達載體pET28b-NGB。
[0072]二、轉化宿主大腸桿菌及菌體復蘇
[0073]將步驟一構建正確的原核表達載體pET28b-TAT-NGB和pET28b_NGB轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)并涂布至LB平皿待長出克隆，各組分別挑取一個克隆接種到5mL含有Kana+(終濃度100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌約16小時，待菌體完全復蘇。
[0074]三、原核表達載體pET28b-TAT-NGB和pET28b_NGB的誘導表達
[0075]將復蘇的菌液稀釋至OD6qq=0.8，然后吸取5mL菌液接種到150mL含有Kana+ (終濃度 100 μ g/mL)的 LB 培養(yǎng)基中，37°C、220rpm 搖菌約 4-5 小時后測定 OD6tltl,待 OD6tltl=0.6-1.0時迅速加入誘導劑IPTG (終濃度ImM)，并于30°C、220rpm誘導表達8小時。
[0076]四、蛋白樣品的制備
[0077]上述誘導表達菌液于4°C、12000rpm離心10分鐘以收集菌體，然后于4°C低溫下拍照(如圖7所示，左邊為TAT-NGB離心菌體，右邊為NGB離心菌體)，從實驗結果可以直觀地看出TAT-NGB呈現出鮮艷的肉紅色，且其肉紅色明顯強于NGB，這說明制備的TAT-NGB具有明顯的活性；預冷的PBS重懸菌體后超聲破碎，40C、12000rpm離心收集上清并于4°C低溫條件下拍照(如圖8)，超聲上清也呈現出鮮艷的肉紅色，進一步說明TAT-NGB具有活性，最后制備蛋白樣品待鑒定。
[0078]五、蛋白樣品鑒定
[0079]步驟四制備的蛋白樣品采用15%的SDS-PAGE和免疫印跡鑒定，然后采用ImageJ圖像分析軟件和0rigin8.0統計軟件分析作圖，結果如圖9所示((A):15% SDS-PAGE鑒定；(B):免疫印跡鑒定；(C):柱狀圖顯示)。從圖中可以看出，TAT-NGB和NGB蛋白均主要以可溶性的形式表達于上清中，且TAT-NGB總蛋白表達量及上清蛋白表達量明顯高于NGB (圖9(A)和(B))，柱狀圖分析也顯示了同樣的結果(圖9 (C)，**:P〈0.01，與NGB比較)。
[0080]實施例4、利用TAT核心肽段在未添加誘導劑及4°C低溫條件下促進增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的高效、可溶性表達
[0081]如圖1所示，用本發(fā)明的方法促進增強型綠色熒光蛋白(EGFP)高效、可溶性表達，具體方法包括以下步驟:
[0082]一、構建攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼基因的原核表達載體
[0083]pET28b-TAT-EGFP 和 pET28b_EGFP
[0084]具體構建方法見實施例2。
[0085]二、轉化宿主大腸桿菌及菌體復蘇
[0086]將步驟一構建正確的原核表達`載體pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)并涂布至含有Kana+ (終濃度100 μ g/mL)的LB平皿上，置于37°C恒溫箱孵育10-12小時待長出克隆。
[0087]三、原核表達載體的誘導表達
[0088]將上述長出克隆的平皿(平皿上不含任何誘導劑)迅速置于4°C恒溫冰箱低溫誘導表達4天，其間O小時、24小時、48小時、72小時和96小時分別采集圖像。
[0089]四、熒光顯微鏡觀察分析
[0090]將步驟三4°C低溫條件下誘導表達的克隆置于熒光顯微鏡下觀察蛋白表達情況，實驗結果如圖10所示((A):熒光顯微鏡觀察TAT-EGFP和EGFP單克隆熒光信號變化；(B):線條圖顯示TAT-EGFP和EGFP熒光變化)。TAT-EGFP單克隆的熒光信號隨著時間的增加在增強，且在24小時時增加最快(圖10 (A));統計分析也顯示了同樣的結果，24小時時，TAT-EGFP和EGFP都達到了較高表達水平，隨著時間的增加二者的表達水平緩慢增加，但總體上 TAT-EGFP 的表達量明顯高于 EGFP(圖 10 (B)，*:Ρ〈0.05，**:Ρ〈0.01，與 EGFP 比較)。
[0091]用實施例1 同樣方法，以 pBV220、pET30、pCRT7/CT-T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30為出發(fā)載體可以得到系列的利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的專用表達載體，并可進一步按照實施例2或3或4的方法得到高表達水平的外源蛋白。另外，轉化宿主不限于大腸桿菌，也可為枯草桿菌等；所用的大腸桿菌也不限于E.coliBL21 (DE3)，也可以為 E.coli BL21(DE3)plys、BLR(DE3)、B834、DH5a、HB101 或 JM109 等。借鑒本發(fā)明技術，這些過程均成為常規(guī)操作，恕不再一一例舉。
【權利要求】
1.TAT核心肽段在制備高效、可溶性表達的外源蛋白中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述TAT核心肽段，是含有一個或多個TAT核心多肽編碼區(qū)的原核表達載體。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述TAT核心多肽編碼區(qū)為能夠根據三聯體密碼組合成其氨基酸序列的任意核酸編碼序列，如序列表中序列I所示。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特征在于:所述TAT核心多肽編碼區(qū)優(yōu)選的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。
5.根據權利要求2或3或4所述的應用，其特征在于:用于構建所述原核表達載體的出發(fā)載體為 PET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT_T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于:所述出發(fā)載體為pET28b，以一個TAT核心多肽編碼區(qū)構建得到的原核表達載體，命名為pET28b-TAT。
7.根據權利要求2或3或4或5或6所述的應用，其特征在于:將外源蛋白編碼基因插入所述的原核表達載體中得到含有TAT核心多肽編碼區(qū)和外源基因的原核表達載體，所述TAT核心多肽編碼區(qū)可以置于外源蛋白編碼序列的上游或下游。
8.根據權利要求1至7任一所述的應用，其特征在于:所述外源蛋白包括有生物活性的外源蛋白以及有指示功能的蛋白。
9.根據權利要求8所`述的應用，其特征在于:所述有生物活性的外源蛋白包括但不限于腦紅蛋白(NGB)，有指示功能的蛋白包括但不限于增強型綠色熒光蛋白(EGFP)。
10.根據權利要求7至9任一所述的應用，其特征在于:制備高效、可溶性表達的外源蛋白還包括以下過程: 1)將含有TAT核心多肽編碼區(qū)和外源基因的原核表達載體向原核表達體系轉化，原核表達體系為大腸桿菌、枯草桿菌等，所述大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、BLR(DE3)、B834、DH5a、HBlOl 或 JM109 等； 2)原核表達體系用化學試劑或低溫進行誘導表達，化學試劑誘導表達條件為:終濃度ImM的誘導劑IPTG誘導表達；誘導表達的OD6tltl=0.6-1.0 ;誘導表達時間6_8小時；低溫誘導表達條件為:采用平皿涂布制備克隆；4°C低溫誘導表達；誘導表達時間4天；以及外源蛋白的收集。
【文檔編號】C12N15/75GK103865945SQ201410067808
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2010年3月8日 優(yōu)先權日:2010年2月10日
【發(fā)明者】張成崗, 吳永紅, 高艷 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所