肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒。該試劑盒及檢測(cè)方法是根據(jù)研究報(bào)道與肌萎縮側(cè)索硬化癥相關(guān)的致病基因，包括SOD1、FUS、VAPB、ANG、TARDBP、FIG4、OPTN、VCP、Sigmar1、CHMP2B、PFN1位點(diǎn)，設(shè)計(jì)和合成各基因特異性引物，通過采集待測(cè)個(gè)體的標(biāo)本，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，將得到RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，然后將樣本序列與正?；蛐蛄羞M(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)是否有致病突變。本發(fā)明能一次性檢測(cè)出致病基因蛋白編碼區(qū)（CDS）所有的致病突變位點(diǎn)，具有簡(jiǎn)便快速，準(zhǔn)備可靠，特異性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以同時(shí)檢出ALS病人和無癥狀患者。
【專利說明】肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]發(fā)明涉及一種遺傳性疾病的基因診斷試劑盒，更具體的說是一種肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(motor neuron disease, MND)的一個(gè)主要類型，由Charcot在1865年第一次描述。其病變主要累及脊髓前角細(xì)胞，腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核及錐體束，表現(xiàn)為上.下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元同時(shí)受損的特征，屬于慢性進(jìn)行性變性疾病?；颊吲R床表現(xiàn)為上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元同時(shí)受累的癥狀.受累肢體肌無力.肌萎縮.肌束震顫.痙攣.腱反射活躍.出現(xiàn)病理反射。延髓上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累可出現(xiàn)痙攣性構(gòu)音障礙，表現(xiàn)為言語緩慢.吃力.失真，并常伴有鼻音，下頜反射呈陽性；延髓下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累主要表現(xiàn)為舌肌無力萎縮.纖顫，發(fā)音無力和吞咽障礙。該病每年發(fā)病率約為疒3/105，多為中.老年起病，男性多于女性，多數(shù)患者在出現(xiàn)臨床癥狀后3飛年內(nèi)死于呼吸肌麻痹，給患者和家庭帶來沉重的生理和心理負(fù)擔(dān)。
[0005]ALS起病隱匿，疾病早期臨床癥狀不典型，該病的診斷尚存在一定困難。目前國(guó)內(nèi)外臨床上一直使用的為1998年世界神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟推薦的ALS診斷標(biāo)準(zhǔn)。2001年，中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)參照世界神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟的診斷標(biāo)準(zhǔn)提出了我國(guó)肌萎縮側(cè)索硬化癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，必須有以下神經(jīng)癥狀和體征:(1)下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病孫特征(包括目前臨床表現(xiàn)正常，肌肉的肌電圖異常)；(2)上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病損體征；(3)病情逐步發(fā)展。根據(jù)以上3個(gè)特征，又做以下3個(gè)程度的診斷:(1)確診ALS:全身四個(gè)區(qū)域(腦.頸.胸.腰骶神經(jīng)支配區(qū))的肌肉群，3個(gè)區(qū)域有上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病損的癥狀和體征；(2)擬診ALS:在2個(gè)區(qū)域有上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病損的癥狀和體征；(3)可能ALS:在一個(gè)區(qū)域有上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病損的癥狀和體征，或在2~3個(gè)區(qū)域有上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病損癥狀和體征。根據(jù)情況選擇適當(dāng)?shù)妮o助檢查以排除其他疾病，如肌電圖，包括運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度和阻滯測(cè)定及胸鎖乳突肌檢查，脊髓和腦干MRI檢查和肌肉活檢。
[0006]根據(jù)這些診斷標(biāo)準(zhǔn)，典型的ALS診斷并不困難，但是用于臨床工作，這一標(biāo)準(zhǔn)顯得過于嚴(yán)格。ALS患者發(fā)病早期可以表現(xiàn)為單純下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累，也可以單純表現(xiàn)為延髓受累癥狀，當(dāng)病情發(fā)展至符合該確診標(biāo)準(zhǔn)時(shí)往往延誤了最佳治療時(shí)機(jī)。甚至約有25%的ALS患者死亡后仍然不能得到診斷，一些不典型的病例也不能得到及時(shí)得到診斷，尤其對(duì)ALS的臨床實(shí)驗(yàn)中的患者的篩選非常不利。同時(shí)由于ALS神經(jīng)病變部位的隨機(jī)性，ALS的臨床表現(xiàn)也因人而異，因病變部位而不同，其癥狀和體征也難以與一些重要疾病鑒別，如椎管源性脊髓病.多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病，進(jìn)行性脊肌萎縮癥，青年良性遠(yuǎn)端手肌萎縮癥等，單憑臨床癥狀極易誤診。[0007]迄今為止，ALS的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能是多種因素共同作用的結(jié)果，其中環(huán)境和遺傳因素被認(rèn)為是主要病因，尤其是遺傳因素。近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)了多個(gè)基因與ALS發(fā)病有關(guān)，包括SODl、FUS、VAPB、ANG、TARDBP.FIG4、OPTN、VCP、Sigmarl、CHMP2B、PFNl，并在離體和在體實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了基因突變與發(fā)病密切相關(guān)。至今報(bào)道的各致病基因突變也有多種，如SODl基因已報(bào)道了 100多個(gè)不同的突變類型，TARDBP基因突變位點(diǎn)達(dá)到50多個(gè)，這些突變包括錯(cuò)義突變.缺失，無義突變等，分布于各個(gè)外顯子。ALS疾病具有明顯的遺傳異質(zhì)性，不同種族和家系各種原發(fā)致病位點(diǎn)分布情況也不一樣。
[0008]針對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化癥的早期臨床診斷較難，且存在一定的誤診和漏診，利用基因診斷技術(shù)將成為確診的有力手段，不僅可以對(duì)患者所患疾病做出判斷，也可以對(duì)表型正常但攜帶某種特定疾病基因或者特定疾病的易感性做出判斷。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱PCR技術(shù))是近年發(fā)展起來體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，由于其具有快速.靈敏.特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，所以該技術(shù)很快用于實(shí)踐中。
[0009]傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，但一次PCR只能鑒別一個(gè)突變位點(diǎn)。從中國(guó)專利在內(nèi)的有關(guān)資料檢索表明，以PCR為基礎(chǔ)發(fā)展起來的RT-PCR結(jié)合現(xiàn)在發(fā)展起來的基因測(cè)序技術(shù)，單管可以同時(shí)檢測(cè)到ALS疾病一個(gè)致病基因內(nèi)所有外顯子的多個(gè)突變，目前尚未見到這一技術(shù)進(jìn)行ALS疾病分子診斷的專利和報(bào)道。本項(xiàng)專利即是利用RT-PCR結(jié)合基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)ALS各相關(guān)致病基因蛋白編碼區(qū)域(CDS)的所有致病突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)ALS做出快速診斷。
[0010]

【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]本發(fā)明的目的是提供一種肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)的基因診斷試劑盒及檢測(cè)方法，在于為肌萎縮側(cè)索硬化癥的相關(guān)致病基因提供一種簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、特異性好高的基因診斷方法，可應(yīng)用于患者、表型正常的攜帶者及產(chǎn)前基因診斷，從而為臨床診斷和早期的預(yù)防治療提供參考。
[0012]本發(fā)明依據(jù)國(guó)內(nèi)外對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)的分子遺傳學(xué)研究的成果，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與 ALS 相關(guān)的致病基因，包括 SODl、FUS、VAPB、ANG、TARDBP、FIG4、0PTN、VCP、Sigmar1、CHMP2B、PFN1，發(fā)病與上述基因的蛋白編碼區(qū)(⑶S)基因突變密切相關(guān)。利用RT-PCR方法結(jié)合基因測(cè)序技術(shù)，就能達(dá)到明確全面檢測(cè)該疾病的目的。
[0013]具體的技術(shù)方案是:
肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，包括有用于擴(kuò)增如下11個(gè)基因的引物:S0D1、FUS、VAPB, ANG、TARDBP, FIG4、OPTN、VCP, Sigmarl、CHMP2B、PFNl。
[0014]優(yōu)選地，上述引物是如表1所示，引物在最終擴(kuò)增體系中的濃度也列于表1。
[0015]表1優(yōu)選的引物序列以及引物在最終擴(kuò)增體系中的濃度
【權(quán)利要求】
1.一種肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，其特征在于，包括有用于擴(kuò)增如下11個(gè)基因的引物:SODl、FUS、VAPB、ANG、TARDBP、F1G4、OPTN、VCP、S1gmarl、CHMP2B、PFNl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，其特征在于，所述的引物如下所示:S0D1，SEQ 1D N0.1 ~2 ；FUS, SEQ 1D N0.3 ~4 ；VAPB, SEQ 1D N0.5 ~6 ;ANG, SEQ 1D N0.7 ~8 ；TARDBP, SEQ 1D N0.9 ~10 ；F1G4, SEQ 1D N0.11 ~12 ；0PTN, SEQ1D N0.13 ~14 ；VCP, SEQ 1D N0.15 ~16 ；S1gmarl, SEQ 1D N0.17 ~18 ；CHMP2B, SEQ 1DN0.19 ~20 ；PFN1, SEQ 1D N0.21 ~22。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，其特征在于:各個(gè)引物在擴(kuò)增體系中的終濃度都是0.4 μ Mo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，其特征在于:所述試劑盒的擴(kuò)增體系由以下組成=1OX緩沖液，5.0μ 1 ;10mM dNTP，1.0 μ 1 ;正向引物，2.0μ 1 ;反向引物，2.0μ 1 ;Taq 酶，0.2μ 1 ；dd H2O,補(bǔ)足至 50μ 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，其特征在于:還包括有RNA提取試劑盒和/或反轉(zhuǎn)錄試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103898211SQ201410082951
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】陳實(shí), 黎寒 申請(qǐng)人:江蘇雄鳴醫(yī)藥科技有限公司