一種阿爾茲海默癥的基因診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種阿爾茲海默癥的基因診斷試劑盒。該試劑盒可以檢測研究報(bào)道與阿爾茲海默癥相關(guān)的10個(gè)致病基因，包括APP、APOE、PSEN1、PSEN2、GSK3β、DYRK1A、Tomm40、CLU、PICALM、TAU。檢測方法是：設(shè)計(jì)和合成各基因特異性引物，通過采集待測個(gè)體的標(biāo)本，運(yùn)用RT?PCR技術(shù)，將各基因得到特異性DNA產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，然后將樣本序列與正?；蛐蛄羞M(jìn)行比對，分析是否有致病突變，以評估個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明之阿爾茲海默癥基因診斷試劑盒能一次性檢測出致病基因蛋白編碼區(qū)（CDS）不同的致病突變位點(diǎn)，具有簡便快速，準(zhǔn)備可靠，特異性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種阿爾茲海默癥的基因診斷試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 發(fā)明涉及一種遺傳性疾病的基因診斷試劑盒，更具體的說是一種阿爾茨海默癥 (又稱為老年癡呆癥)的基因診斷試劑盒，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
[0002]
【背景技術(shù)】 阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)，又稱為老年癡呆癥，是一種多發(fā)于老年人 群的神經(jīng)退行性疾病。該病由德國醫(yī)生Alois Alzheimer于1906年首先記錄和描述，表現(xiàn)為 (1)其特征性病理改變?yōu)榈矸蹣拥鞍壮练e和Tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原 纖維纏結(jié)，神經(jīng)元丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生，為神經(jīng)退行性病變。該病早期表現(xiàn)為輕微記憶障 礙，隨著病情的發(fā)展，患者的認(rèn)知能力(如記憶力、計(jì)算力、思維判斷力等)逐漸衰退、智力減 退、出現(xiàn)情感以及語言障礙，最終神經(jīng)系統(tǒng)功能遭到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致死亡；（2)在美國AD及其 相關(guān)疾病成為國家公共健康問題，其患病率在65歲及以上為3~11%，年齡超過85歲為25% ~47%。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國65周歲以上人口約為1.3億，占總?cè)丝诘?0.1%，患病多發(fā)生于 65歲以上老人，約占4%-5%，且隨著年齡增長，患病率增加，阿爾茨海默癥后期生活不能自 理，已嚴(yán)重影響到老年人的身心健康和生活質(zhì)量，給患者.家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù) 擔(dān)。
[0003]阿爾茲海默癥起病隱匿，進(jìn)展緩慢。在早期階段，AD很難鑒定是由于正常老化認(rèn)知 功能障礙還是輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment)，后者往往預(yù)示著AD的可 能。其認(rèn)知功能障礙是全面的，大致分為早、中、晚期，其中早期主要表現(xiàn)為記憶力減退，尤 其以近記憶力障礙為主，在這期間患者能夠自理日常生活，故多被忽視。隨著病情的發(fā)展， 癥狀往往表現(xiàn)為語言障礙更持久，人格方面出現(xiàn)興趣和始動性喪失，情緒遲鈍或難以控制， 邏輯思維，運(yùn)動協(xié)調(diào)能力，記憶功能逐級到全部喪失，因吞咽困難而不主動進(jìn)食，終年臥床， 最后因身體瘦弱，多繼發(fā)感染肺炎，壓瘡和心腎功能衰竭而死亡。
[0004] AD的診斷是根據(jù)美國國立神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所-阿爾茲海默及相 關(guān)疾病學(xué)會（National Institute of Neurological Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer Disease and Related Disorders Association，NINCDS-ADRDA)的標(biāo) 準(zhǔn)。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)分類"確診"（臨床診斷與病理確認(rèn)）、"很可能"（典型的臨床綜合癥而無組 織學(xué)證實(shí)）或"可能"（非典型臨床特點(diǎn)，沒有可選擇的診斷，沒有病理證實(shí)）。根據(jù)NINCDS-ADRDA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，一個(gè)確診的AD是有經(jīng)過臨床診斷并有病例證實(shí)。臨床診斷"很可能"的病 例86%~90%得到尸檢的支持。隨著對疾病過程的認(rèn)識增長，AD的臨床表型不再是有排他性 條款。對其確診還必須結(jié)合磁共振成像的廣泛顳葉內(nèi)側(cè)腦部結(jié)構(gòu)影像學(xué)改變，正電子發(fā)射 體層掃描（positron emission tomography，PET)的分子影像學(xué)異常和腦脊液 (cerebrospinal fluid，CSF)分析、β-淀粉樣蛋白的生物標(biāo)記物等。
[0005] 在全面性AD出現(xiàn)之前的早期階段進(jìn)行診斷是臨床的一個(gè)挑戰(zhàn)，目前主要采用詳細(xì) 的認(rèn)知和功能評估方法進(jìn)行篩選。美國精神病學(xué)協(xié)會的精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊公布的阿 爾茲海默病的診斷標(biāo)準(zhǔn)包括記憶、語言、感知能力等8個(gè)認(rèn)知領(lǐng)域，被廣泛用于簡易精神狀 態(tài)檢查與評估。但由于阿爾茲海默病癥狀具有隱匿性和可逆性，使得早期識別該綜合癥成 為困難。
[0006] 根據(jù)上述心理測試的全面評估和正式診斷并結(jié)合相關(guān)影像學(xué)變化等，典型的AD并 不難判斷，然而用于臨床上卻過于嚴(yán)格。有些疾病(如抑郁癥、甲狀腺功能減退)和阿爾茲海 默癥臨床表現(xiàn)很相似）。診斷AD還必須考慮和鑒別與記憶障礙及相關(guān)癥狀有關(guān)的內(nèi)科.神經(jīng) 科或精神科疾病，如血管性癡呆、進(jìn)行性核上性麻痹、腦淀粉樣血管病等，以防止誤診。此 外，由于主治醫(yī)生的延誤和患者不認(rèn)識AD的早期癥象，存在一定程度的漏診。早期診斷AD患 者會讓他們家人朋友制定和參與照顧計(jì)劃，以便更好地應(yīng)對未來出現(xiàn)的神經(jīng)退化過程。現(xiàn) 有的藥物在改善疾病病情發(fā)展方面有可能給患者提供有益的幫助。研究證據(jù)也表明，早期 治療會給患者和照料者以及整個(gè)社會節(jié)約經(jīng)濟(jì)效益。鑒于及時(shí)和準(zhǔn)確診斷AD的挑戰(zhàn)和效 益，目前急需有助于阿爾茲海默癥早期診斷工具的出現(xiàn)。
[0007] 阿爾茲海默癥的病因復(fù)雜，涉及遺傳環(huán)境等多種因素相互協(xié)同作用。隨著分子生 物學(xué)的飛速發(fā)展，遺傳因素越來越得到關(guān)注。越來越多與阿爾茲海默癥相關(guān)的致病基因被 發(fā)現(xiàn)，包括APP、PSENl、PSEN2、GSK3β等。特別是APP基因和位于l號、14號上的PSENl和PSEN2 基因，在離體和在體實(shí)驗(yàn)中證明了基因突變與發(fā)病密切相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)的致病基因的致病 突變也有多種，如PSEN1已報(bào)道100多個(gè)突變位點(diǎn)，基因 APP致病突變多達(dá)60多個(gè)。這些突變 包括堿基置換、缺失、移碼、插入突變等，分布在各外顯子上。
[0008] 針對阿爾茲海默癥早期隱匿性強(qiáng)，臨床癥狀不明顯，由于基因突變是阿爾茲海默 癥發(fā)病關(guān)鍵因素之一，利用基因診斷將是早期診斷的有效手段。在該技術(shù)幫助下，醫(yī)生能夠 在病人未發(fā)病之前就能篩查出高危人群。它直接檢測被檢者某一特定基因的結(jié)構(gòu)或者功能 是否異常，相對于常規(guī)診斷，更注重個(gè)體基因狀態(tài)，不僅可以對患者所患疾病做出判斷，也 可以對表型正常但攜帶某種特定疾病基因或者特定疾病的易感性做出判斷。聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(polymerase chain reaction，簡稱PCR技術(shù))是體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，具有快 速，靈敏和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。
[0009] 傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR結(jié)果直觀可靠，但是一次只能鑒別一個(gè)突變位點(diǎn)。由于 阿爾茲海默癥致病基因多，各基因內(nèi)又可表現(xiàn)為不同的突變位點(diǎn)，且多發(fā)生在蛋白編碼區(qū)， 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)結(jié)合現(xiàn)在快速發(fā)展的基因測序技術(shù)，將引物設(shè)計(jì)在蛋白編碼區(qū)（CDS)兩側(cè) 附近，可一次性檢測出AD-個(gè)致病基因內(nèi)所有外顯子的不同位點(diǎn)突變，具有更強(qiáng)的適用性。 目前尚未見到這一技術(shù)對AD疾病分子診斷的專利和報(bào)道，本專利方法的建立為AD的快速診 斷和早期篩查提供技術(shù)支撐。
[0010] 參考文獻(xiàn)： (1) Berchtold NC，Cotman Cff. Evolution in the conceptualization of dementia and Alzheimer's disease: Greco-Roman period to the 1960s. Neurobiol Aging, 1998， 19(3): 173-89 (2) Selkoe DJ. Alzheimer's disease: genes?proteins?and therapy. Physiol Rev， 2001， 81(2): 741-66

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 鑒于阿爾茲海默癥致病基因多，且各致病基因可表現(xiàn)為不同的突變位點(diǎn)，多數(shù)都 分布在蛋白編碼區(qū)，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)結(jié)合現(xiàn)在快速發(fā)展的基因測序技術(shù)，可方便檢測出阿 爾茲海默癥一個(gè)致病基因內(nèi)所有外顯子的多個(gè)突變。綜合試劑盒所列所有致病基因的突變 情況，可以獲得測試樣本與阿爾茲海默癥相關(guān)致病基因的全面信息。本專利方法的建立為 阿爾茲海默癥的快速診斷和早期篩查提供技術(shù)支撐。
[0012] 本發(fā)明的目的是提供一種阿爾茲海默癥的基因診斷試劑盒及檢測方法，該試劑盒 操作簡便快速、準(zhǔn)確可靠、特異性好，可應(yīng)用于患者、表型正常的攜帶者及產(chǎn)前基因診斷，從 而為臨床診斷和早期的預(yù)防治療提供參考。
[0013] 本發(fā)明依據(jù)國內(nèi)外對阿爾茲海默癥(AD)的分子遺傳學(xué)研究的成果，針對多個(gè)與AD 相關(guān)的致病基因，包括APP、APOE、PSENl、PSEN2、GSK30、DYRKlA、Tomm4O、CLU、PICALM、TAUjSJ 爾茲海默發(fā)病與上述基因的蛋白編碼區(qū)（CDS)基因突變密切相關(guān)。利用RT-PCR方法結(jié)合基 因測序技術(shù)，達(dá)到全面檢測該疾病患病風(fēng)險(xiǎn)的目的。
[0014] 具體的技術(shù)方案是： 根據(jù)發(fā)明的一個(gè)方面，一種阿爾茲海默癥的基因診斷試劑盒，包括有用于擴(kuò)增如下基 因的引物組:APP、ΑΡ0Ε、PSEN1、PSEN2、GSK30、DYRK1A、Tomm40、CLU、PI CALM、TAU。
[0015]所述的引物組是由如下的引物對所組成，每個(gè)引物對中分別是由一條正向引物和 一條反向引物所組成，其引物序列如下所示： 用于擴(kuò)增APP基因的引物對:SEQ ID N0.1~2; 用于擴(kuò)增AP0E基因的引物對:SEQIDN0.3~4; 用于擴(kuò)增PSEN1基因的引物對:SEQIDN0.5~6; 用于擴(kuò)增PSEN2基因的引物對:SEQIDN0.7~8; 用于擴(kuò)增GSK3β基因的引物對:SEQIDN0.9~10; 用于擴(kuò)增DYRK1A基因的引物對:SEQIDN0.11~12; 用于擴(kuò)增Tomm40基因的引物對:SEQIDN0.13~14; 用于擴(kuò)增CLU基因的引物對:SEQIDN0.15~16; 用于擴(kuò)增PICALM基因的引物對:SEQIDN0.17~18; 用于擴(kuò)增TAU基因的引物對:SEQIDN0.19~20。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，包括有上述引物組的阿爾茲海默癥的基因診斷試劑 盒。
[0017] 所述的基因診斷試劑盒，每個(gè)引物對所在的擴(kuò)增體系的組成是:cDNA模板2.0 μL、 反應(yīng)混合物25.0 μL、正向引物2.0 μL、反向引物2.0 yl、dd Η20補(bǔ)足至50 μL。
[0018] 所述的基因診斷試劑盒，還包括有RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑。
[0019]試劑盒的使用方法，包括如下步驟:⑴樣品組織RNA的提取;⑵將所得RNA反轉(zhuǎn)錄 成cDNA; (3)通過所述的引物組對cDNA樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)；（4)將所得擴(kuò)增DNA片段測序；（5) 測序結(jié)果與各基因的CDS區(qū)域堿基進(jìn)行比對，判斷有無突變。
[0020] 有益效果 本發(fā)明的阿爾茲海默癥基因診斷試劑盒及檢測方法，是根據(jù)國內(nèi)外對阿爾茲海默癥的 分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的結(jié)果，檢測與阿爾茲海默癥相關(guān)的一系列致病基因，包括APP、 APOE、PSEN1、PSEN2、GSK30、DYRK1A、Tomm40、CLU、PI CALM、TAU，根據(jù)各基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物， 利用引物特異性擴(kuò)增各基因的全部CDS區(qū)，所建立優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)體系結(jié)合測序技術(shù)保 證了檢測結(jié)果的快速性、準(zhǔn)確性和靈敏性。使用本發(fā)明的基因診斷試劑盒，可以單管一次性 PCR同時(shí)檢測到一個(gè)基因的CDS區(qū)內(nèi)全部的致病突變位點(diǎn)，能夠覆蓋大多數(shù)患者和攜帶者的 診斷，具有簡便、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。該方法可運(yùn)用于患者、攜帶者及產(chǎn)前診斷，可為臨床疾 病診斷提供重要的參考依據(jù)，也有利于對該疾病的早期預(yù)防治療，具有巨大的普及和推廣 應(yīng)用價(jià)值。
[0021]
【附圖說明】
[0022]以下圖是根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)行RT-RCR檢測正常細(xì)胞株ND29194致病突變 位點(diǎn)電泳結(jié)果。
[0023] 圖1是CLU基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，泳道1是Marker，泳道2是CLU; 圖2是APP基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，泳道1是Marker，泳道2是APP; 圖3是ΑΡ0Ε基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，泳道1是ΑΡ0Ε，泳道2是Marker; 圖4是PSEN1基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，泳道1是PSEN1，泳道2是Marker; 圖5是PSEN2基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，泳道1是PSEN2,泳道2是Marker; 圖6是GSK30基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，泳道1是GSK30，泳道2是Marker; 圖7是DYRK1A基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，泳道1是Marker，泳道2是DYRK1A; 圖8是Tomm40基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，泳道1是Marker，泳道2是Tomm40; 圖9是PICALM基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，泳道1是PICALM，泳道2是Marker; 圖10是TAU基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，泳道1是Marker，泳道2是TAU; 圖11是Marker各條帶大小分布圖。
[0024]
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例在本發(fā) 明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體操作過程，但本發(fā)明的保護(hù) 范圍不限于下述實(shí)施例。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述 的技術(shù)或條件（例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三 版，科學(xué)出版社）或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以 通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0026] 實(shí)施例1基因的確定、引物設(shè)計(jì)以及試劑盒組成及擴(kuò)增程序 本發(fā)明涉及的10個(gè)基因與AD疾病相關(guān)，已有文獻(xiàn)報(bào)道了其相關(guān)性。10個(gè)基因的序列可 以通過如下途徑獲得。
[0027] 在網(wǎng)址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/根據(jù)如下基因 ID可檢索到基因序列。
[0028] 表1基因 ID
引物設(shè)計(jì)過程上，主要是根據(jù)各基因保守區(qū)進(jìn)行設(shè)計(jì)，利用引物特異性擴(kuò)增各基因的 全部CDS區(qū)。正向和反向引物分別設(shè)計(jì)在5'-UTR和3'-UTR區(qū)，確保擴(kuò)增產(chǎn)物能夠覆蓋全部的 CDS區(qū)，能夠使該試劑盒檢測各致病基因全部CDS區(qū)上的突變位點(diǎn)。
[0029] 以CLU基因?yàn)槔?，其mRNA序列如下所示，其中下劃為設(shè)計(jì)引物所對應(yīng)的結(jié)合區(qū)，用 括號[]括起的部分為CDS區(qū)。設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物可以包含全部的CDS區(qū)長度。

采用的標(biāo)準(zhǔn)樣品是從Coriell Institute for Medical Research購買的人皮膚成纖 維細(xì)胞，其詳細(xì)信息如下，下述的信息經(jīng)過Coriell Institute for Medical Research的 確認(rèn)鑒定。
[0031]表2細(xì)胞樣本信息
該試劑盒在使用中，首先提取樣本的RNA，再將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，接著通過PCR對cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲知突變情況。每個(gè)基因都分別在單獨(dú)的擴(kuò)增體系中采用 相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對引物設(shè)計(jì)以及擴(kuò)增程序的循環(huán)往復(fù)的大量試驗(yàn)調(diào)整，并結(jié)合對 模版量、引物的Tm值的相應(yīng)的優(yōu)化后，較優(yōu)的引物及具體信息如下表3所示： 表3引物序列
在進(jìn)行基因擴(kuò)增時(shí)，各個(gè)基因所對應(yīng)的引物分別在一個(gè)單獨(dú)擴(kuò)增體系中進(jìn)行擴(kuò)增，較 優(yōu)地，經(jīng)過大量試驗(yàn)摸索得到的PCR擴(kuò)增程序是： 表4擴(kuò)增程序
實(shí)施例2阿爾茲海默癥的基因檢測 根據(jù)實(shí)施例1的試劑盒，進(jìn)行實(shí)施例2的應(yīng)用，具體分別按以下步驟進(jìn)行： 本發(fā)明提供的阿爾茲海默癥的基因診斷試劑盒，其檢測的樣品可以是待測個(gè)體的血 液、體液、毛發(fā)、骨骼、細(xì)胞或組織標(biāo)本等。本實(shí)施例中，采用同實(shí)施例1的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株。
[0032] -、待測個(gè)體人成纖維皮膚細(xì)胞RNA的提?。?1. 取待測樣品加入1 ml Trizol液在冰上混勾，搗碎勾衆(zhòng);冰上靜置10 min; 2. 在勻漿液中加入200 μL氯仿，用力振搖15s，室溫孵育10 min 3. 4°C，12000 g/min，l離心 15 min 4. 取水相(上層），加入500 μL異丙醇，輕輕晃動，室溫孵育10~15 min 5. 4°C，12000 g/min，l離心 10 min 6. 棄上清，用 1 ml 75%乙醇(v/v)洗滌一次，4°C，7500~10000g/min，離心5 min 7. 空氣干燥超凈工作臺處晾干，用20~30 μL DEPC水溶解(若不能完全溶解可于55~ 60°C孵育5~10 min)，得到RNA提取液。
[0033] 二、樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 取2 μL RNA提取液95°C預(yù)熱5~10 min，加入含RT反應(yīng)液的反應(yīng)管，在PCR儀或者恒溫 水浴鍋中按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng):25°C，5 min，42°C孵育60 min，最后70°C，15 min使反 轉(zhuǎn)錄酶滅活。最終得到RT-PCR反應(yīng)模板。
[0034] RT反應(yīng)液的組成是： 表5 RT反應(yīng)液組成(20 μL反應(yīng)體系）
三、 對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增 取2 μL RT-PCR反應(yīng)模板加入到48 μL擴(kuò)增體系中，每管中加入用于擴(kuò)增一個(gè)基因的 弓丨物對，10個(gè)基因分別在10個(gè)管中進(jìn)行反應(yīng)，引物如表3所示，混勻后在PCR儀中按照表5中 的程序進(jìn)行反應(yīng)。
[0035] PCR擴(kuò)增中的擴(kuò)增體系如表6所示。
[0036] 表6 PCR擴(kuò)增體系組成(50μ1反應(yīng)體系）
本發(fā)明中所述的反應(yīng)混合物是指PCR反應(yīng)過程中，所需要的DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+等 必需組合的混合物。
[0037] 四、 電泳，PCR產(chǎn)物判斷及測序 反應(yīng)結(jié)束后，對產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，對目的產(chǎn)物進(jìn)行切膠后做T-A克隆，直接進(jìn)行測序， 委托南京金斯瑞生物科技公司。圖1所示的是CLU基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，從圖中可以 看出，擴(kuò)增產(chǎn)物呈清晰、單一的條帶，可見其擴(kuò)增效率高，無特異性產(chǎn)物出現(xiàn)，公開序列經(jīng)過 擴(kuò)增后其產(chǎn)物大小預(yù)計(jì)在1571 bp，其實(shí)際大小為1571 bp，其大小與預(yù)期相符。經(jīng)過測序， 該細(xì)胞株樣本的測序結(jié)果與其已知序列一致，證明了該引物組的可靠性。
[0038]其它基因的擴(kuò)增結(jié)果如圖2~10所示，從圖中可以看出，對于其它基因的擴(kuò)增產(chǎn)物 大小也與預(yù)期的大小一致，且呈現(xiàn)單一、清晰的條帶;將各個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物切膠后進(jìn)行測序，測 序結(jié)果與該樣本的已知序列一致，同樣證實(shí)了該試劑盒能夠?qū)ι鲜龅钠渌蜻M(jìn)行可靠地 擴(kuò)增。
[0039]結(jié)果： 應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對分析。將測序得到的序列與NCBI檢索到的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn) 行比對，確定是否存在致病突變位點(diǎn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種阿爾茲海默癥的基因診斷試劑盒，其特征在于，包括有用于擴(kuò)增如下基因的引 物組：APP、APOE、PSEN1、PSEN2、GSK30、DYRK1A、Tomm40、CLU、PI CALM、TAU 〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿爾茲海默癥的基因診斷試劑盒，其特征在于:所述的引物組 是由如下的引物對所組成，每個(gè)引物對中分別是由一條正向引物和一條反向引物所組成， 其引物序列如下所示：用于擴(kuò)增APP基因的引物對:SEQ ID N0.1~2;用于擴(kuò)增APOE基因的 引物對：SEQIDN0.3~4;用于擴(kuò)增PSEN1基因的引物對 ：SEQIDN0.5~6;用于擴(kuò)增PSEN2 基因的引物對：SEQIDN0.7~8 ;用于擴(kuò)增GSK3β基因的引物對:SEQIDN0.9~10;用于擴(kuò) 增DYRKlA基因的引物對 :SEQIDN0.11~12;用于擴(kuò)增To_40基因的引物對:SEQIDN0.13 ~14;用于擴(kuò)增CLU基因的引物對:SEQ ID NO. 15~16;用于擴(kuò)增PICALM基因的引物對：SEQ ID NO. 17~18;用于擴(kuò)增TAU基因的引物對:SEQ ID NO. 19~20。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述的基因診斷試劑盒，每個(gè)引物對所 在的擴(kuò)增體系的組成是:cDNA模板2.0 μL、反應(yīng)混合物25.0 μL、正向引物2.0 μL、反向引物 2.0 μ1、(Μ Η20補(bǔ)足至50 μL。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于:還包括有RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑。5. 權(quán)利要求3所述的試劑盒的使用方法，其特征在于:包括如下步驟：（1)樣品組織RNA 的提取；（2)將所得RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;(3)通過所述的引物組對cDNA樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)；（4) 將所得擴(kuò)增DNA片段測序;（5)測序結(jié)果與各基因的CDS區(qū)域堿基進(jìn)行比對，判斷有無突變。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969885SQ201610473965
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】陳實(shí), 黎寒
【申請人】江蘇雄鳴醫(yī)藥科技有限公司