一種同時(shí)檢測(cè)rna病毒、dna病毒、支原體和衣原體的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，公開(kāi)了一種在同一臺(tái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上同時(shí)檢測(cè)RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體的上機(jī)反應(yīng)程序，通過(guò)與相應(yīng)的RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體在不同的熒光定量PCR儀器上、以不同的反應(yīng)程序進(jìn)行檢測(cè)相比較，具有較高的特異性、穩(wěn)定性以及統(tǒng)一性。
【專利說(shuō)明】【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是用于常見(jiàn)的RNA病毒、DNA病毒、支原體和 衣原體的同時(shí)檢測(cè)與鑒定。 -種同時(shí)檢測(cè)RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體的方法 【背景技術(shù)】
[0002] 目前，國(guó)內(nèi)外新興的檢測(cè)病原微生物的方法是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time fluorescent quantitative PCR)，這是一種在PCR反應(yīng)體系中加入突光基團(tuán)，利用突光信 號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定性和定量，而且具有靈敏度 高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染性、具有實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性 等特點(diǎn)。因而，在呼吸道病原體檢測(cè)中具有巨大應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。
[0003] 但目前對(duì)于RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體的檢測(cè)都是分別進(jìn)行，由于基因 組的特性、長(zhǎng)度以及復(fù)雜度不同，不易于同時(shí)在同一個(gè)PCR儀上同時(shí)檢測(cè)，假陽(yáng)性高，不穩(wěn) 定，效率低。
[0004] 本專利成功建立的在同一臺(tái)熒光定量PCR儀上、同時(shí)檢測(cè)RNA病毒（以甲型H1N1 流感病毒為例、簡(jiǎn)寫(xiě)HI)、DNA病毒（以人腺病毒為例、簡(jiǎn)寫(xiě)ADV)、支原體（以人肺炎支原體 為例、簡(jiǎn)寫(xiě)MP)和衣原體（以人肺炎衣原體為例、簡(jiǎn)寫(xiě)CP)的方法，該方法具有特異性強(qiáng)、靈 敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)且操作簡(jiǎn)便快速，在急性呼吸道病毒的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、衛(wèi)生評(píng)價(jià)、臨床 診斷等方面顯示出良好的應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是由國(guó)家"十二五"科技重大專項(xiàng)2012ZX10004206-002支持的。在本發(fā)明 中，我們成功建立了在同一臺(tái)熒光定量PCR儀上、應(yīng)用同樣的反應(yīng)程序檢測(cè)RNA病毒、DNA病 毒、支原體和衣原體的方法。通過(guò)與各自病原體在不同的PCR儀上、以不同的反應(yīng)程序進(jìn)行 檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較，說(shuō)明該方法具有較高的特異性、靈敏度、高效性和穩(wěn)定性。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種同時(shí)檢測(cè)RNA病毒（以甲型H1N1流感病毒為例）、 DNA病毒（以人腺病毒為例）、支原體（以人肺炎支原體為例）和衣原體（以人肺炎衣原體 為例）的配制體系，該方法使用針對(duì)各自病原體設(shè)計(jì)及合成的引物和探針進(jìn)行配制。
[0007] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下配制成份：
[0008] a)反應(yīng)緩沖液；
[0009] b)反應(yīng)酶；
[0010] c)針對(duì)各自病原體的上、下游引物；
[0011] d)針對(duì)各自病原體的探針；
[0012] e)無(wú) RNA酶的水補(bǔ)足體系要求的體積。
[0013] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法為熒光定量PCR/RT-PCR配制體系。
[0014] 在本發(fā)明的第二方面，提供一種在同一臺(tái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上、同時(shí)檢測(cè)RNA病 毒、DNA病毒、支原體和衣原體（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原體和人肺炎 衣原體為例）的上機(jī)反應(yīng)程序，該方法使用第一方面所述的配制體系。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下程序：
[0016] a)熒光通道的設(shè)置；
[0017] b)反轉(zhuǎn)錄的溫度與時(shí)間；
[0018] c)預(yù)熱的溫度與時(shí)間；
[0019] d)預(yù)循環(huán)（預(yù)熱溫度與時(shí)間、退火溫度與時(shí)間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù)）；
[0020] e)熱循環(huán)（預(yù)熱溫度與時(shí)間、退火溫度與時(shí)間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù)）；
[0021] f)以界定的Ct值來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果。
[0022] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法為熒光定量PCR/RT PCR擴(kuò)增程序，并使用所述 配制體系作為反應(yīng)體系。
[0023] 在本發(fā)明的第三方面，提供第二方面所述的上機(jī)反應(yīng)程序的診斷試劑中的應(yīng)用。 【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為同時(shí)加入甲型H1N1型流感病毒（RNA病毒）、人腺病毒（DNA病毒）、人肺炎 支原體（支原體）、人肺炎衣原體（衣原體）陽(yáng)性模板的熒光擴(kuò)增圖。 【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明的技術(shù)途徑是首先利用已經(jīng)設(shè)計(jì)并合成的RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣 原體（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原體以及人肺炎衣原體為例）相應(yīng)基因 的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和探針序列，確定了最佳配制體系及上機(jī)擴(kuò)增程序，并且進(jìn)行特 異性、靈敏度及穩(wěn)定性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及臨床樣本的檢測(cè)應(yīng)用，成功建立了 RNA病毒、DNA病毒、 支原體和衣原體（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺炎支原體以及人肺炎衣原體為例） 一步法多重?zé)晒釸T-PCR同一臺(tái)PCR儀的上機(jī)反應(yīng)。
[0026] 同時(shí)，需要指出的是，本發(fā)明所述的檢測(cè)方法和試劑盒不僅應(yīng)用于對(duì)患者（人）的 樣品進(jìn)行檢測(cè)，也包括對(duì)環(huán)境中的水樣品、食物樣品、空氣樣品、微生物樣品、動(dòng)物樣品等多 種樣品的非診斷目的的檢測(cè)。其應(yīng)用也都是本領(lǐng)域技術(shù)的常用技術(shù)手段，并不需要進(jìn)行特 別的、富有創(chuàng)造性的改變。
[0027] 實(shí)施例1. RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、 人肺炎支原體以及人肺炎衣原體為例）各病原體特異性引物和探針一步法熒光定量PCR/ RT-PCR檢測(cè)程序的建立
[0028] 1. 1按照英杰公司的核酸提取試劑盒（QIAamp? viral RNA Mini Kit)來(lái)提取樣 本核酸。
[0029] 1. 2RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體（以甲型H1N1流感病毒、人腺病毒、人肺 炎支原體以及人肺炎衣原體為例）一步法多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)體系的配制
[0030] 配制試劑采用 Ambion 公司的 AgPath-IDTM One-st印 RT-PCR Kit (P/N :4387424), 體系為25 μ 1 :
[0031] 2xRT-PCR buffer 12.5μΙ 25 XRT-PCR Enzyme 1 μ? Detection Enhancer ] ·5μ1 引物、探針 0.5μ1 (引物終濃度為400nM、探針終濃度為ΙΟΟηΜ) 模板 5μ1 無(wú)RNA酶的水 4.5μ1
[0032] 1. 3RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體（以甲型Η1Ν1流感病毒、人腺病毒、人肺 炎支原體以及人肺炎衣原體為例）一步法熒光定量PCR/RT-PCR檢測(cè)方法的上機(jī)擴(kuò)增程序
[0033] 采用羅氏公司的Roche480儀進(jìn)行上機(jī)擴(kuò)增，其程序如下：
[0034] 先設(shè)置FAM熒光采集通道；
[0035] 反轉(zhuǎn)錄溫度與時(shí)間：48°C, 30 min; 預(yù)變性溫度與時(shí)間：95°C，lOmin;
【權(quán)利要求】
1. 一種非診斷目的的同時(shí)檢測(cè)RNA病毒、DNA病毒、支原體和衣原體的方法： 配制PCR反應(yīng)體系： a) 反應(yīng)緩沖液； b) 反應(yīng)酶； c) 針對(duì)各自病原體的上、下游引物； d) 針對(duì)各自病原體的探針； e) 無(wú) RNA酶的水補(bǔ)足體系要求的體積。 設(shè)置上機(jī)反應(yīng)程序， a) 熒光通道的設(shè)置； b) 反轉(zhuǎn)錄的溫度與時(shí)間； c) 預(yù)熱的溫度與時(shí)間； d) 預(yù)循環(huán)（預(yù)熱溫度與時(shí)間、退火溫度與時(shí)間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù)）； e) 熱循環(huán)（預(yù)熱溫度與時(shí)間、退火溫度與時(shí)間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù)）； f) 以界定的Ct值來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，PCR反應(yīng)體系中，采用Ambion公司的AgPath-IDTM One-st 印 RT-PCR Kit，P/N :4387424,體系為 25μ 1 : 2xRT-PCR buffer 12.5μ1 25 xRT-PCR Enzyme 1 μ? Detection Enhancer 1.5μ1 弓I物、探針 0.5μ1，引物終濃度為400nM、探針終濃度為ΙΟΟηΜ 模板 5μ1 無(wú) RNA酶的水 4.5μ1。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中上機(jī)反應(yīng)程序設(shè)置如下： 先設(shè)置FAM熒光采集通道； 反轉(zhuǎn)錄溫度與時(shí)間：48°C，30min; 預(yù)變性溫度與時(shí)間：95?，lOmin;
預(yù)熱溫度與時(shí)間·· 95°C，15 s; 熒光吸收溫度為60?，共10 退火溫度與時(shí)間： 60°C, 45s 預(yù)熱溫度與時(shí)間： 95°C，15 s; 熒光吸收溫度為60X：,共35 退火溫度與時(shí)間： 60°C, 45s 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：Ct值<34,判定為陽(yáng)性；Ct值>36,判斷為陰性；Ct值在34?36之 間為可疑。
4. 如權(quán)利要求1或2所述方法，其中所述引物序列為SEQ ID NO :1-12所示。
5. 如權(quán)利要求1所述方法在檢測(cè)食品及原料、環(huán)境樣本中病原微生物方面的用途。
6. 如權(quán)利要求1所述方法可以在基層或小型實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，同時(shí)也可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢 測(cè)、衛(wèi)生評(píng)價(jià)等方面。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104109721SQ201410083117
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】崔淑娟, 石偉先, 田麗麗, 張新, 于霞麗, 孫玉蘭, 王海濱, 張玉松 申請(qǐng)人:崔淑娟