一種新型高靈敏度呼吸道病毒核酸nasba擴增引物及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種呼吸道病毒檢測的基因擴增技術(shù)，更具體的建立一種高靈敏度的呼吸道病毒核酸NASBA擴增技術(shù)。具體包括一對呼吸道病毒特異性擴增引物，NASBA擴增反應(yīng)體系及NASBA產(chǎn)物檢測體系。
【背景技術(shù)】
[0002]急性呼吸道感染是人類致病和死亡的最主要原因之一。引起感染的病原體種類多，包括細菌、病毒、支原體和衣原體等，尤以病毒多見。無論病因如何，呼吸道感染的臨床癥狀和體征都很相似，而不同種類病原體引起的感染，其治療方法截然不同，療效和病程也不盡相同。
[0003]呼吸道病毒作為最主要的致病病原體，種類繁多，需要快速進行鑒別。目前臨床上呼吸道病毒感染的檢測手段主要分為四類:第一類為最經(jīng)典的病毒培養(yǎng)，是呼吸道病毒感染檢測的金標準；但由于病毒繁殖有嚴格的嗜宿主性，需要根據(jù)不同的病毒選擇各自敏感的細胞株，造成操作上的繁瑣；且病毒培養(yǎng)周期長，不能很好的滿足臨床的需求。第二類為免疫學(xué)方法，也為目前最常用的方法。根據(jù)檢測目標物為抗原/抗體，可分為直接免疫熒光法/間接免疫熒光法或是酶聯(lián)免疫吸附實驗。間接免疫熒光法/酶聯(lián)免疫吸附實驗雖然檢測方法簡單，但靈敏度低，且受干擾因素較多。直接免疫熒光法主要檢測呼吸道病毒抗原，靈敏度較前兩者高，但樣本多取自病患咽拭子或肺泡灌洗液，增加了病患的痛苦，因此實用性比較低。第三類為核酸擴增技術(shù)，該方法包含多種基于病毒核酸的檢測方法如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、NASBA技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)等。由于PCR檢測時間短、靈敏度高，為目前最具有吸引力的方法。但該種方法需要首先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再進行特異核酸序列的擴增反應(yīng)，增加了污染的機會，限制了此類技術(shù)在臨床檢測中的廣泛應(yīng)用。第四類為基因芯片、下一代測序技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù)等，這些先進的檢測技術(shù)雖然大大提高了靈敏度，但耗時長或是價格昂貴，科研用途較多，目前尚未在臨床病原體檢測中得到大規(guī)模應(yīng)用。
[0004]呼吸道病毒中，除少數(shù)如腺病毒為DNA病毒外，其余大多數(shù)為RNA病毒。目前PCR技術(shù)整個過程耗時雖較傳統(tǒng)方法縮短，靈敏度必然有所下降。NASBA技術(shù)是直接以RNA為模板的核酸擴增技術(shù)，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶及RNaseH酶的作用下，短期內(nèi)可在恒溫條件下將模板RNA放大至101(]-1012拷貝量。該實驗過程可認為分為非循環(huán)相及循環(huán)相兩部分:在非循環(huán)相，引物1在其5’端人工加上了一段T7RNA聚合酶識別啟動子序列，引物1的3’端則與RNA模板序列互補。在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以病毒RNA為模板合成cDNA鏈；RnaseH識別RNA-DNA雜合雙鏈并水解其中的RNA鏈；引物2與剩下的DNA鏈互補，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，以DNA鏈為模板合成互補鏈，形成雙鏈DNA ；T7RNA聚合酶識別啟動子序列，催化合成大量的RNA。新合成的RNA進入循環(huán)相，成為新的模板，如此循環(huán)往復(fù)，使RNA拷貝數(shù)迅速擴大。綜上所述，NASBA技術(shù)與PCR技術(shù)的最大不同之處有三點:1)與PCR技術(shù)以DNA為模板不同，NASBA技術(shù)直接以RNA為模板，操作具有更簡潔性；2)PCR需要進行變性-復(fù)性-延伸過程，至少需要兩個溫度的變化，而NASBA技術(shù)為恒溫擴增，因此NASBA技術(shù)不需要特殊的設(shè)備；3)NASBA技術(shù)的靈敏度與PCR相比高1000倍左右，可顯著提高臨床核酸病毒的檢出率，能更好的臨床檢測需要。
[0005]根據(jù)NASBA的技術(shù)原理，其最終產(chǎn)物為大量與RNA模板學(xué)列一致的片段，為使產(chǎn)物片段可視化，之前曾采用瓊脂糖凝膠顯像技術(shù)，但由于瓊脂糖凝膠所用染料為溴化乙錠，具有一定的毒性，目前多采用NASBA技術(shù)偶聯(lián)酶標(熒光)探針雜交的方式進行產(chǎn)物量的檢測。由于呼吸道病毒大多數(shù)為單鏈RNA病毒，現(xiàn)有檢測方法引物設(shè)計原則多采用與RNA模板相反的單條引物的5’端引入T7RNA聚合酶啟動子區(qū)域，最后大量擴增而成的是與病毒RNA模板序列一致的RNA分子，并以此為基礎(chǔ)達到病毒檢測的目的。由此可知，經(jīng)典NASBA技術(shù)偶聯(lián)酶標(熒光)探針雜交法僅能識別與模板鏈相一致的RNA序列，且檢測過程中須通過酶標(熒光)探針偶聯(lián)的顯色技術(shù)，增加了該方法的操作繁瑣性及需要用到顯色設(shè)備等。同時，由于呼吸道病毒大多數(shù)為RNA病毒，在病人樣本保存過程中極易降解，故進一步提高NASBA技術(shù)的檢測靈敏度、降低技術(shù)操作繁瑣程度已成為臨床RNA病毒檢測中急待解決的問題。
[0006]一直以來，研究人員致力于開發(fā)一種靈敏度更高、操作更簡便、設(shè)備要求更簡單的呼吸道病毒核酸檢測方法。經(jīng)典的NASBA技術(shù)僅在引物1的5’端添加一段T7RNA聚合酶啟動子識別序列，以保證能合成與模板序列一致的RNA復(fù)制子，方便后續(xù)探針進行雜交檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明首先要解決的技術(shù)問題是提供新型高靈敏度呼吸道病毒核酸NASBA擴增引物。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案:
[0008]本發(fā)明公開了一對針對呼吸道病毒基因的特異性擴增引物，其設(shè)計原則為通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫及利用序列比對軟件，選擇呼吸道病毒保守區(qū)域，并在該區(qū)域設(shè)計擴增引物；其所設(shè)計的引物在合成是引物5’端均帶有T7RNA聚合酶識別的啟動子序列，如SEQ所不ο
[0009]本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種新型高靈敏度呼吸道病毒核酸NASBA擴增檢測方法，該方法包括以下步驟:
[0010](1)制備權(quán)利要求1或2所述的擴增引物，
[0011](2)制備擴增試劑盒，所述擴增試劑盒由以下檢測試劑組成:
[0012]本發(fā)明進一步公開了針對呼吸道病毒的NASBA檢測試劑盒，由如下成分組成:
[0013]1)引物
[0014]引物FP:0.25ul
[0015]引物RP:0.25ul
[0016]所述引物序列如SEQ所示。
[0017]2) NASBA 擴增試劑
[0018]BA (緩沖液):2ul
[0019]DA:dNTP0.25ul
[0020]ΝΑ:NTP0.5ul
[0021]DMSO:0.25ul
[0022]EM(酶混合物):AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶，RNAseH, T7RNA 聚合酶，BSA 5.5ul
[0023]3) NASBA產(chǎn)物檢測試劑
[0024]1%瓊脂糖凝膠
[0025]本發(fā)明進一步公開了針對呼吸道病毒NASBA檢測試劑盒的使用方法，其特征包括如下步驟:
[0026]1)擴增反應(yīng)體系:
[0027]lul 待檢樣本 RNA，0.25ul FP，0.25ul RP，2ul ΒΑ,Ο.25ul DA，0.5ul NA，0.25ulDMSO。
[0028]2) NASBA 擴增過程:
[0029]65。加熱 5min，42。降溫 5min 后加入 5.5ul EM, 42° 反應(yīng) 60min。
[0030]3) NASBA產(chǎn)物檢測過程:
[0031]①稱取0.6g瓊脂糖凝膠，置于100ml錐形瓶中，加入60ml TAE，微波爐加熱至沸，冷卻至70°左右加入GelRed染料，倒入凝膠模塊中，待冷卻凝固；
[0032]②將NASBA擴增產(chǎn)物加入2ul上樣緩沖液終止反應(yīng)后，分別加入到凝膠上樣孔中；
[0033]③100V進行電泳lOmin，觀察目的條帶有誤，判斷結(jié)果。
[0034]本發(fā)明更加詳細的制備方法如下(以呼吸道合胞病毒為例):
[0035]1、試劑組成
[0036]1.1 引物
[0037]針對呼吸道合胞病毒的N基因保守區(qū)設(shè)計合成引物，由上海生物工程有限公司合成，序列如下:
[0038]FP:AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGX ；
[0039]RP:AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGY ；
[0040]前段序列為T7RNA聚合酶識別的啟動子序列“X、Y”代表呼吸道病毒(如呼吸道合胞病毒、Β型流感病毒、副流感病毒1型及副流感病毒3型)的保守序列或互補序列。
[0041 ]1.2NASBA 擴增試劑
[0042]ΒΑ (緩沖液):購自TAKARA公司
[0043]DA: 10mM dNTP，購自生工生物工程(上海)股份有限公司
[0044]NA: 10mM NTP，購自生工生物工程(上海)股份有限公司
[0045]DMS0:購自 S i gma 公司
[0046]EM (酶混合物):10U AMV，0.2 ?0.6U RNAseH, 38 ?63U T7RNA 聚合酶，2.5ug BSA,均購自TAKARA公司
[0047]1.3NASBA產(chǎn)物檢測試劑
[0048]瓊脂糖粉，購自生工生物工程(上海)股份有限公司
[0049]2、NASBA 檢測過程
[0050]2.1擴增體系
[0051]取lul 樣本 RNA 模板、2ul ΒΑ、0.25ul ΝΑ、0.5ul DA、0.25ul DMSO 及 0.25ulFP、
0.25ulRP加入0.2ml PCR擴增管中。
[0052]2.2擴增過程
[0053]將上述PCR擴增管放置擴增儀上65°加熱5min后進入42°降溫5min;隨后加入
5.5ul EM,繼續(xù) 42。反應(yīng) 60min。
[0054]2.3NASBA擴增產(chǎn)物的檢測
[0055]2.3.1稱取0.6g瓊脂糖粉末加入到60ml TAE緩沖液中，微波爐加熱至溶解后加入GelRed染料，倒入凝膠模塊中，插入孔梳。
[0056]2.3.2取2ul上樣緩沖液加入到擴增產(chǎn)物中終止反應(yīng)。
[0057]2.3.3待上述凝膠凝固后，取下孔梳，在一個加樣孔中加入點泳標準品，其他孔中分別加入擴增產(chǎn)物，100V電壓電泳lOmin。
[0058]2.3.4在電泳顯像儀中觀察目的條帶的有無，判斷結(jié)果。
[0059]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明通過在與呼吸道病毒RNA序列兩端互補的兩條引物的5’端均添加T7RNA聚合酶啟動子識別序列，使其在進入循環(huán)相時能夠合成既與模板序列一致的RNA學(xué)列[RNA (+)]，又能合成與模板RNA序列互補的RNA序列[RNA㈠]。如此，在循環(huán)相反應(yīng)中，RNA(+)和RNA(-)可分別作為模板，經(jīng)過N次循環(huán)，RNA擴增效率能得到顯著提高(公式1)，從而大大提高病毒核酸的檢測靈敏度；可直接采用患者咽拭子標本進行擴增，而無需進行逆轉(zhuǎn)錄過程，節(jié)省操作時間；同時，結(jié)合近期瓊脂糖凝膠電泳所用燃料已更新?lián)Q代為無毒性的燃料，故其檢測成本將大幅度降低，消除有毒、有害染料對人體及環(huán)境的危害，且操作過程更簡便，雙引物設(shè)計增加了引物二聚體及發(fā)卡結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜等問題，在選擇引物時需要注意。
[0060]單側(cè)引物+T7 RNA聚合酶啟動子序列設(shè)計:
[0061]擴增產(chǎn)物量1=TXAn
[0062]雙側(cè)引物+T7 RNA聚合酶啟動子序列設(shè)計:
[0063]擴增產(chǎn)物量2= TXAnX2n
[0064]則:通過對雙側(cè)引物進行改進后，其產(chǎn)物量增加倍數(shù)為:
[0065]P =擴增產(chǎn)物量J擴增產(chǎn)物量1= 2 N
[0066]其中T為原始模板數(shù)，A為擴增效率，N為循環(huán)數(shù)。
[0067]公式1.雙側(cè)引物設(shè)計擴增效率比較
[0068]通過將該設(shè)計應(yīng)用于NASBA技術(shù)，可使檢測方法靈敏度更高、結(jié)果更準確、操作更方便。
【附圖說明】
[0069]圖1是本發(fā)明的技術(shù)原理圖。
[0070]圖2是本發(fā)明與PCR方法比對實驗圖。
[0071]圖3是本發(fā)明應(yīng)用于呼吸道合胞病毒引物單側(cè)及雙側(cè)設(shè)計比對圖。
[0072]圖4是本發(fā)明應(yīng)用于呼吸道合胞病毒特異性檢測。
[0073]圖5是本發(fā)明應(yīng)用于B型流感病毒引物單側(cè)及雙側(cè)設(shè)計比對圖。
[0074]圖6是本發(fā)明應(yīng)用于B型流感病毒特異性檢測圖。
[0075]圖7是本發(fā)明應(yīng)用于副流感病毒1型引物單側(cè)及雙側(cè)設(shè)計比對圖。
[0076]圖8是本發(fā)明應(yīng)用于副流感病毒1型特異性檢測圖。
[0077]圖9是本發(fā)明應(yīng)用于