永生化人軟骨終板干細(xì)胞系的制備方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及永生化人軟骨終板干細(xì)胞系的制備方法及其用途。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為構(gòu)建永生化人軟骨終板干細(xì)胞系提供一種有效的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建永生化人軟骨終板干細(xì)胞系的制備方法，包括如下步驟：a、構(gòu)建SV40T抗原病毒載體；b、SV40T抗原基因轉(zhuǎn)染人終板干細(xì)胞；c、傳代并篩選得到永生化軟骨終板干細(xì)胞。本發(fā)明還提供了由上述方法得到的永生化人軟骨終板干細(xì)胞系在制備骨組織工程材料中的用途。本發(fā)明可應(yīng)用于組織工程骨的制備，為臨床上一系列長骨缺損、骨不連病人提供一種價格低廉、成骨能力強的骨組織工程的種子細(xì)胞。
【專利說明】永生化人軟骨終板干細(xì)胞系的制備方法及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及永生化人軟骨終板干細(xì)胞系的制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]臨床上常由于某些原因如外傷、感染、腫瘤等造成開放性骨折、骨不連以及骨缺損，是運動系統(tǒng)疾病中常見和處理困難的疾患，也是患者喪失勞動力的重要原因。解決長骨缺損、骨不連等需要大量具有良好符合人體生物學(xué)、生物力學(xué)特性的骨移植材料。為此，許多學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)的研究，取得了一些成績，但是對于長骨缺損，仍然是運動系統(tǒng)疾病中的難題。隨著近年來組織工程技術(shù)的興起，骨缺損的修復(fù)研究進(jìn)入組織工程的時代。目前的組織工程理論認(rèn)為，種子細(xì)胞、支架材料、生長因子是組織工程的三要素。傳統(tǒng)上一般選用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨組織工程的種子細(xì)胞，但其面臨諸多的局限性，包括手術(shù)病人抽取骨髓面臨二次創(chuàng)傷，細(xì)胞數(shù)量受限，是否具備最佳的成骨能力等。比較而言，人軟骨終板干細(xì)胞(Cartilage Endplate Stem Cells, CESCs)具有取材方便,不會給病人帶來二次創(chuàng)傷，易于分離培養(yǎng)，體外增殖能力強，同時具有較強的成骨能力。而且CESCs作為其他非組織工程的種子細(xì)胞也具有廣闊前景，許多研究證實CESCs具有成體干細(xì)胞特性，表現(xiàn)為較強的增殖能力和向多種間充質(zhì)細(xì)胞分化的潛能。由于臨床上對骨移植材料的需求量巨大，同時組織工程技術(shù)的發(fā)展有望實現(xiàn)骨缺損的理想修復(fù)。但是分離原代培養(yǎng)的CESCs隨著傳代次數(shù)的提高，其活力越來越差，最終發(fā)生凋亡，難以存活，因此構(gòu)建永生化人退變軟骨終板干細(xì)胞系具有較強的實用價值，同時為研究人終板干細(xì)胞的生物學(xué)行為提供標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，為組織工程基礎(chǔ)研究提供平臺，為臨床應(yīng)用提供足量種子細(xì)胞，并為建立人退變軟骨終板干細(xì)胞系提供一種有效、可靠的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為構(gòu)建永生化人軟骨終板干細(xì)胞系提供一種新選擇。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是永生化人退變軟骨終板干細(xì)胞系的制備方法，包括如下步驟:
[0005]將外源性猴腎病毒SV40T抗原基因轉(zhuǎn)染人終板軟骨干細(xì)胞而誘導(dǎo)獲得永生化人終板軟骨干細(xì)胞系；其中，外源性SV40T抗原基因通過構(gòu)建成慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人終板軟骨干細(xì)胞；所述外源性SV40T抗原的核苷酸序列如序列21所示；包括如下步驟:
[0006]a、構(gòu)建SV40T抗原病毒載體:將表達(dá)SV40T抗原基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝載體共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞系HEK293，包裝出表達(dá)SV40T抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒；
[0007]b、慢病毒轉(zhuǎn)染:將人退變軟骨終板原代干細(xì)胞傳至第3代，使細(xì)胞密度為3 X IO3/ml,按0.5ml/cm2培養(yǎng)面積添加含4μ g/ml聚凝胺的逆轉(zhuǎn)錄病毒,病毒滴度為IX 108TU/ml,感染2天后，換液并添加2ml的0.4mg/ml的潮霉素B篩選14天，形成篩選后的干細(xì)胞集落；[0008]C、傳代:將篩選后的干細(xì)胞集落擴增并進(jìn)行連續(xù)傳至30代以上，即得到永生化的人退變軟骨終板干細(xì)胞系iCESCs，凍存?zhèn)溆谩?br> [0009]其中，步驟b中的人退變軟骨終板原代干細(xì)胞采用如下方法制備:將手術(shù)中遺棄的軟骨終板標(biāo)本，在無菌條件下去除棉絮狀的髓核組織和白色的纖維狀纖維環(huán)組織，得到透明狀的軟骨終板；機械-膠原酶法獲取軟骨終板原代細(xì)胞。
[0010]其中，步驟b中人退變軟骨終板原代干細(xì)胞傳至第3代的培養(yǎng)條件如下:培養(yǎng)基為90%DMEM/F12，含10%的FBS (胎牛血清)，細(xì)胞長滿接近培養(yǎng)皿80%后傳代。
[0011]本發(fā)明還提供了由上述方法得到的永生化的人退變軟骨終板干細(xì)胞系。
[0012]本發(fā)明還提供了由上述方法得到的永生化的人退變軟骨終板干細(xì)胞系在制備骨組織工程材料中的用途。
[0013]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明方法提供一種永生化的人椎間盤軟骨終板干細(xì)胞的制備方法。該方法得到的永生化干細(xì)胞與原代培養(yǎng)軟骨終板干細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特性，能向骨、軟骨及脂肪等方向誘導(dǎo)分化，而且較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強的成骨分化能力，且不具成瘤性。本發(fā)明提供了永生化人軟骨終板干細(xì)胞的制備方法以及在骨組織工程中的應(yīng)用，主要可應(yīng)用于組織工程骨的制備，為臨床上一系列長骨缺損、骨不連病人提供一種價格低廉、成骨能力強的骨組織工程的種子細(xì)胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1.瓊脂糖懸浮培養(yǎng)篩選CESCs。A.接種于瓊脂糖中的單個細(xì)胞。B.培養(yǎng)六周后的單細(xì)胞克隆(黑色箭頭)和單個細(xì)胞(紅色箭頭)。C.單細(xì)胞克隆的龍膽紫染色。D.經(jīng)擴增培養(yǎng)的CESCs。
[0015]圖2包裝的SV40T抗原慢病毒孔內(nèi)可見病毒空斑。
[0016]圖3轉(zhuǎn)染后形成的單克隆細(xì)胞。
[0017]圖4單克隆細(xì)胞擴大培養(yǎng)后。
[0018]圖5iCESCs的干細(xì)胞標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)檢測。A，B為細(xì)胞流式實驗的結(jié)果。A圖縱坐標(biāo)是對應(yīng)⑶標(biāo)志物的熒光強度。淺色線是實驗組，深色線是陰性對照組。
[0019]B圖的橫坐標(biāo)是標(biāo)志物的名稱，橫坐標(biāo)下面的stem cell markers為干細(xì)胞標(biāo)志物，Percentageof markers為標(biāo)志物百分比。
[0020]圖6iCESCs的體外成骨、成脂及成軟骨誘導(dǎo)的組織學(xué)及分化相關(guān)基因表達(dá)的檢測。A:正常培養(yǎng)基，茜素紅染色，陰性；B:誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基，茜素紅，陽性；C:PCR檢測成骨相關(guān)基因表達(dá)情況；D:正常培養(yǎng)基，油紅O染色，陰性；E:誘導(dǎo)成脂肪培養(yǎng)基，油紅O染色，陽性；F:PCR檢測成脂肪相關(guān)基因表達(dá)情況；G:成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，微球培養(yǎng)后成軟骨情況:成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，微球培養(yǎng)后經(jīng)阿爾新藍(lán)染色；1:PCR檢測成軟骨相關(guān)基因情況；J:第三代iCESCs倒置顯微鏡圖片；K:成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，微球培養(yǎng)后經(jīng)阿爾新藍(lán)染色后行石蠟包埋切片。
[0021]圖7.A圖為永生化后第I代。B圖為永生化后第10代。C圖為永生化后第30代。D圖為永生化后第50代。
[0022]圖8植入3個月后動物體內(nèi)L2-L3橫突間干細(xì)胞-羥基灰石復(fù)合物，箭頭所示為BM-MSCs-羥基灰石復(fù)合物，三角所示為iCESCs-羥基灰石復(fù)合物。A:解剖標(biāo)本，B:標(biāo)本固定后O
[0023]圖9通過Micro-CT分別選取BM-MSCs組和iCESCs組對應(yīng)解剖位置的相同大小組織塊。Micro-CT照片顯示如圖，圖A為MSC成骨，圖B為iCESC成骨。其中藍(lán)色代表羥基灰石支架，橙黃色代表新生骨。
[0024]圖1OBM-MSCs 組和 iCESCs 組的 TMD 值。(*:P<0.05)
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明永生化人終板軟骨干細(xì)胞體系制備方法及體內(nèi)植骨實驗的實施例，通過目的基因克隆、真核表達(dá)質(zhì)粒中目的基因序列測定、目的基因慢病毒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染SV40T抗原基因(SV40TAg)，成功轉(zhuǎn)然軟骨終板干細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)SV40T抗原基因，從而獲得永生化軟骨終板干細(xì)胞體系，并通過體內(nèi)植骨實驗證實其具有較強的成骨能力。
[0026]外源性SV40T抗原的核苷酸序列(SEQ ID N0.21):
【權(quán)利要求】
1.永生化人退變軟骨終板干細(xì)胞系的制備方法，其特征在于:將外源性猴腎病毒SV40T抗原基因轉(zhuǎn)染人終板軟骨干細(xì)胞而誘導(dǎo)獲得永生化人終板軟骨干細(xì)胞系；其中，外源性SV40T抗原基因通過構(gòu)建成慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人終板軟骨干細(xì)胞；所述外源性SV40T抗原的核苷酸序列如序列21所示；包括如下步驟: a、構(gòu)建SV40T抗原病毒載體:將表達(dá)SV40T抗原基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝載體共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞系HEK293，包裝出表達(dá)SV40T抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒； b、慢病毒轉(zhuǎn)染:將人退變軟骨終板原代干細(xì)胞傳至第3代，使細(xì)胞密度為3X103/ml，按0.5ml/cm2培養(yǎng)面積添加含4 μ g/ml聚凝胺的逆轉(zhuǎn)錄病毒，病毒滴度為I X 108TU/ml，感染2天后，換液并添加2ml的0.4mg/ml的潮霉素B篩選14天，形成篩選后的干細(xì)胞集落； C、傳代:將篩選后的干細(xì)胞集落擴增并進(jìn)行連續(xù)傳至30代以上，即得到永生化的人退變軟骨終板干細(xì)胞系，凍存?zhèn)溆谩?br> 2.如權(quán)利要求1所述的永生化人退變軟骨終板干細(xì)胞系的制備方法，其特征在于:步驟b中的人退變軟骨終板原代干細(xì)胞采用如下方法制備:將手術(shù)中遺棄的軟骨終板標(biāo)本，在無菌條件下去除棉絮狀的髓核組織和白色的纖維狀纖維環(huán)組織，得到透明狀的軟骨終板；機械-膠原酶法獲取軟骨終板原代細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1或2所述的永生化人退變軟骨終板干細(xì)胞系的制備方法，其特征在于:步驟b中人退變軟骨終板原代干細(xì)胞傳至第3代的培養(yǎng)條件如下:培養(yǎng)基為90%DMEM/F12，含10%的胎牛血清，細(xì)胞長滿接近培養(yǎng)皿80%后傳代。
4.由權(quán)利要求1~3任一項所述的方法得到的永生化的人退變軟骨終板干細(xì)胞系。
5.由權(quán)利要求1~3任一項所述的方法得到的永生化的人退變軟骨終板干細(xì)胞系在制備骨組織工程材料中的用`途。
【文檔編號】C12N15/867GK103865877SQ201410088040
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】黃博, 劉銘漢, 王海, 劉蘭濤, 周躍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院