本發(fā)明屬于生物學(xué)和組織工程學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進間充質(zhì)干細胞軟骨組織分化的方法。

背景技術(shù)：

為了維持3D打印精確的打印分辨率，在生物墨水中接種的細胞密度不宜過大，然而高密度細胞是組織工程中間充質(zhì)干細胞生成細胞外基質(zhì)的必要條件。間充質(zhì)干細胞是具有多種功能的前體細胞，具有軟骨、成骨及脂肪分化的能力，同時還能分泌多種細胞因子，在細胞凋亡、分化及免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用。間充質(zhì)干細胞易于分離和收集，在生物打印過程中應(yīng)用廣泛。然而，在軟骨分化過程中間充質(zhì)干細胞過度增生依然是無法攻克的難題。研究發(fā)現(xiàn)NR2F2在調(diào)控肌肉和脂肪功能中具有重要作用，且NR2F2的激活與間充質(zhì)干細胞成成骨分化以及肌肉生成相關(guān)。進一步實驗發(fā)現(xiàn)NR2F2基因過低表達的內(nèi)皮細胞有向間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化的趨勢，然而NR2F2基因過高表達則呈現(xiàn)相反的結(jié)果。因此構(gòu)建間充質(zhì)干細胞NR2F2基因過高表達誘導(dǎo)軟骨分化具有可行性和應(yīng)用前景。

組織工程的出現(xiàn)為軟骨損傷的修復(fù)提供了一種新的、有效的治療手段。通過生物3D打印并種植人間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)分化構(gòu)建功能關(guān)節(jié)軟骨是一種極具科學(xué)研究和臨床治療意義的方法。同時，探討NR2F2在間充質(zhì)干細胞二維培養(yǎng)、三維細胞球培養(yǎng)以及生物打印軟骨組織培養(yǎng)過程中對軟骨分化及生成的作用。而NR2F2介導(dǎo)間充質(zhì)干細胞軟骨分化的機制可能與間充質(zhì)干細胞缺氧通路有關(guān)。

綜上所述，軟骨組織工程領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種新的構(gòu)建功能軟骨的方法，在能夠有效達到促進軟骨組織分化生長目的的同時，還能有效緩解間充質(zhì)干細胞過度增長的缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，現(xiàn)提供一種能夠極大促進間充質(zhì)干細胞分化促進關(guān)節(jié)軟骨組織生長的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種促進間充質(zhì)干細胞軟骨組織分化的方法，其創(chuàng)新點在于：包括以下步驟：a）分離人間充質(zhì)干細胞，b）在間充質(zhì)干細胞中利用慢病毒穩(wěn)定過表達NR2F2基因以及小RNA干擾技術(shù)下調(diào)NR2F2基因表達，c）間充質(zhì)干細胞NR2F2基因過表達以及下調(diào)表達后3D細胞微球的培養(yǎng)，d）將人間充質(zhì)干細胞、聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯肽和2959光引發(fā)劑以及PBS混合制備生物墨水，e）使用生物打印機在生物打印紙上打印過表達NR2F2基因的3D水凝膠軟骨組織，f）在軟骨形成培養(yǎng)基及小鼠皮下培養(yǎng)3D水凝膠軟骨組織21天以形成關(guān)節(jié)軟骨組織。

進一步的，所述步驟a）中間充質(zhì)干細胞來源于22歲男性骨髓捐獻者，所有實驗均使用第三代細胞。

進一步的，所述步驟b）中使用轉(zhuǎn)染試劑將慢病毒pCDH-EF1-Nr2f2-T2A-GFP 或pCDH-EF1-T2A-GFP序列與pCMV-VSVG 及 pCMV-dvpr共同轉(zhuǎn)入293FT細胞中擴增培養(yǎng)，2-3天后離心收集上清液，慢病毒使用濃度為10MOI同時給予2mg/mL嘌呤霉素，其中NR2F2基因過表達效率達到初始含量的40倍以上。

進一步的，所述步驟b）小RNA干擾人骨髓間充質(zhì)干細胞NR2F2基因的表達中使用的是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑及OMEM，RNA使用終濃度調(diào)整為10nM，其中作用時間為72小時，轉(zhuǎn)染效率達到80-90%。

進一步的，所述步驟c）中分別將NR2F2基因過表達組及其對照組和NR2F2基因下調(diào)表達組及其對照組的間充質(zhì)干細胞的細胞數(shù)目調(diào)整為5×10⁵個，離心機300g離心5分鐘后繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，待球型顆粒形成后轉(zhuǎn)移至低粘附的24孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)21天。

進一步的，所述步驟d）中先取一定量的聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于PBS中形成終濃度為10%(w/v)的溶液，然后加入丙烯酸酯肽使終濃度為1mM，最后加入光引發(fā)劑2959并調(diào)整溶液濃度為0.05%(w/v)，然后過濾除菌，將培養(yǎng)狀態(tài)良好的NR2F2基因過表達人間充質(zhì)干細胞以及對照組人間充質(zhì)干細胞在以上溶液中混合均勻，并調(diào)整細胞密度為6×10⁶cells/ml。

進一步的，所述步驟e）中生物打印機在生物打印紙上打印構(gòu)建NR2F2基因過表達的3D水凝膠軟骨組織的具體步驟包括：生物打印機打印前準(zhǔn)備工作；將制備好的生物墨水裝入打印筆內(nèi)并用錫箔紙包??；使用打印軟件設(shè)計目標(biāo)模型及模型尺寸；在3D生物打印紙上層層打印以及同時光聚反應(yīng)構(gòu)建NR2F2基因過表達的3D水凝膠軟骨組織以及其對照組的3D水凝膠軟骨組織。

進一步的，所述步驟f）中將NR2F2基因過表達的3D打印軟骨組織及其對照組的3D打印軟骨組織分別轉(zhuǎn)移24孔板，在體積為1ml和10ng/mL TGFβ的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)21天，培養(yǎng)溫度均為37℃，培養(yǎng)環(huán)境為含5%(v/v) CO₂的濕潤空氣，每3天更換培養(yǎng)基一次，或者將NR2F2基因過表達的3D打印軟骨組織及其對照組3D打印軟骨組織分別植入小鼠皮下繼續(xù)培養(yǎng)21天。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供的一種促進間充質(zhì)干細胞軟骨組織分化的方法可靠、操作簡便、可重復(fù)性強，能夠有效促進間充質(zhì)干細胞軟骨組織分化，能夠為軟骨組織工程的科學(xué)研究以及軟骨損傷的臨床治療提供有益的參考，為生物打印技術(shù)的臨床化提供有效的方法及技術(shù)支撐。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一種促進間充質(zhì)干細胞軟骨組織分化的方法中由間充質(zhì)干細胞NR2F2穩(wěn)定過表達及干擾表達第7天及第21天后的情況。

圖2為本發(fā)明一種促進間充質(zhì)干細胞軟骨組織分化的方法中由間充質(zhì)干細胞第21天NR2F2過表達及干擾后細胞微球3D培養(yǎng)過程中軟骨分化及生成基因的表達情況。

圖3為本發(fā)明一種促進間充質(zhì)干細胞軟骨組織分化的方法中由間充質(zhì)干細胞第7天及21天NR2F2過表達及干擾后細胞微球3D培養(yǎng)過程中軟骨組織相關(guān)蛋白及DNA表達情況。

圖4為本發(fā)明一種促進間充質(zhì)干細胞軟骨組織分化的方法中由間充質(zhì)干細胞第21天NR2F2過表達后3D生物打印體內(nèi)培養(yǎng)過程中新生軟骨組織生成情況。

具體實施方式

以下由特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，熟悉此技術(shù)的人士可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點及功效。

一種促進間充質(zhì)干細胞軟骨組織分化的方法，包括以下步驟：a）分離人間充質(zhì)干細胞，b）在間充質(zhì)干細胞中利用慢病毒穩(wěn)定過表達NR2F2基因以及小RNA干擾技術(shù)下調(diào)NR2F2基因表達，c）間充質(zhì)干細胞NR2F2基因過表達以及下調(diào)表達后3D細胞微球的培養(yǎng)，d）將人間充質(zhì)干細胞、聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯肽和2959光引發(fā)劑以及PBS混合制備生物墨水，e）使用生物打印機在生物打印紙上打印過表達NR2F2基因的3D水凝膠軟骨組織，f）在軟骨形成培養(yǎng)基及小鼠皮下培養(yǎng)3D水凝膠軟骨組織21天以形成關(guān)節(jié)軟骨組織。

優(yōu)選的，步驟a）中間充質(zhì)干細胞來源于22歲男性骨髓捐獻者，所有實驗均使用第三代細胞。

優(yōu)選的，步驟b）中使用轉(zhuǎn)染試劑將慢病毒pCDH-EF1-Nr2f2-T2A-GFP 或pCDH-EF1-T2A-GFP序列與pCMV-VSVG 及 pCMV-dvpr共同轉(zhuǎn)入293FT細胞中擴增培養(yǎng)，2-3天后離心收集上清液，慢病毒使用濃度為10MOI同時給予2mg/mL嘌呤霉素，其中NR2F2基因過表達效率達到初始含量的40倍以上。

優(yōu)選的，步驟b）小RNA干擾人骨髓間充質(zhì)干細胞NR2F2基因的表達中使用的是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑及OMEM，RNA使用終濃度調(diào)整為10nM，其中作用時間為72小時，轉(zhuǎn)染效率達到80-90%。

優(yōu)選的，步驟c）中分別將NR2F2基因過表達組及其對照組和NR2F2基因下調(diào)表達組及其對照組的間充質(zhì)干細胞的細胞數(shù)目調(diào)整為5×10⁵個，離心機300g離心5分鐘后繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，待球型顆粒形成后轉(zhuǎn)移至低粘附的24孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)21天。

優(yōu)選的，步驟d）中先取一定量的聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于PBS中形成終濃度為10%(w/v)的溶液，然后加入丙烯酸酯肽使終濃度為1mM，最后加入光引發(fā)劑2959并調(diào)整溶液濃度為0.05%(w/v)，然后過濾除菌，將培養(yǎng)狀態(tài)良好的NR2F2基因過表達人間充質(zhì)干細胞以及對照組人間充質(zhì)干細胞在以上溶液中混合均勻，并調(diào)整細胞密度為6×10⁶cells/ml。

優(yōu)選的，步驟e）中生物打印機在生物打印紙上打印構(gòu)建NR2F2基因過表達的3D水凝膠軟骨組織的具體步驟包括：生物打印機打印前準(zhǔn)備工作；將制備好的生物墨水裝入打印筆內(nèi)并用錫箔紙包??；使用打印軟件設(shè)計目標(biāo)模型及模型尺寸；在3D生物打印紙上層層打印以及同時光聚反應(yīng)構(gòu)建NR2F2基因過表達的3D水凝膠軟骨組織以及其對照組的3D水凝膠軟骨組織。

優(yōu)選的，步驟f）中將NR2F2基因過表達的3D打印軟骨組織及其對照組的3D打印軟骨組織分別轉(zhuǎn)移24孔板，在體積為1ml和10ng/mL TGFβ的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)21天，培養(yǎng)溫度均為37℃，培養(yǎng)環(huán)境為含5%(v/v) CO₂的濕潤空氣，每3天更換培養(yǎng)基一次，或者將NR2F2基因過表達的3D打印軟骨組織及其對照組3D打印軟骨組織分別植入小鼠皮下繼續(xù)培養(yǎng)21天。

為了進一步了解本發(fā)明方法的效果，對培養(yǎng)出來的軟骨組織進行了相應(yīng)的鑒定。

（1）實時定量PCR分析軟骨細胞基因表達

采用組織破碎儀將制備的細胞微球、3D打印軟骨物以及人軟骨組織于0.5mLTrizol破碎完全，提取上述樣品中RNA并采用Nanodrop 2000測定樣品中RNA的含量及純度，最后逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，采用TaqMan基因表達檢測探針利用RT-PCR檢測軟骨相關(guān)基因表達情況。如圖1、圖2所示，分別為以上基因在NR2F2過表達及干擾表達情況下的表達情況。結(jié)果表明NR2F2基因能夠?qū)?D細胞微球培養(yǎng)及打印軟骨的基因表達水平產(chǎn)生影響。

（2）生化檢測

樣品經(jīng)組織破碎儀破碎后，100μg/mL胃蛋白酶4℃消化7天或125mg/mL木瓜蛋白酶60℃消化16小時后，二甲基亞甲基藍染料測定粘多糖GAG含量，ELISA檢測試劑盒測定I型、II型膠原，CyQUANT試劑盒檢測得到樣品中DNA含量，檢測發(fā)現(xiàn)人間充質(zhì)干細胞3D微球培養(yǎng)第7天時堿性磷酸酶ALP水平隨著NR2F2基因過表達而減少，NR2F2表達減少而增多，結(jié)果如圖3所示。

（3）打印組織皮下植入

將過表達NR2F2基因的間質(zhì)干細胞打印組織及對照的間質(zhì)干細胞打印組織分別植入6周齡雄性小鼠皮下，異氟烷麻醉后沿著胃中線剪開約8mm的切口以創(chuàng)建皮下口袋，將打印組織放入離切口約1cm的口袋內(nèi)，切口3號線縫合，繼續(xù)觀察1-2小時待老鼠完全恢復(fù)，繼續(xù)飼養(yǎng)21天后觀察。

（4）組織學(xué)分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)檢測方法，收集細胞水凝膠結(jié)構(gòu)組織置于10%（v/v）福爾馬林中固定過夜，按照操作方案脫水完全后轉(zhuǎn)移至二甲苯透明直至包埋入石蠟中，然后進行石蠟切片，切片厚度為5微米。最后用番紅O或固綠對上述制備的切片進行染色，觀察樣品中的細胞及蛋白聚糖，結(jié)果如圖4所示。

（5）打印組織機械性能測試

采用步進式壓縮的方式，用測試速度為0.1mm/s的應(yīng)變荷載將水凝膠壓縮至最大壓縮張力的20%。結(jié)果表明所過表達NR2F2基因打印的軟骨組織機械強度于21天明顯強于正常打印的軟骨組織，表明過表達NR2F2基因打印的軟骨組織達到或優(yōu)于天然軟骨的生物力學(xué)特性。

（6）生物支架溶脹系數(shù)檢測

將打印的支架水凝膠在37℃的DMEM中放置48小時后稱重，得到溶脹后質(zhì)量Ws；將打印的支架水凝膠凍干48小時，稱重得到干重Wd。平衡溶脹比Q= Ws /Wd，水含量M=（Ws -Wd）/ Ws。結(jié)果表明所打印的關(guān)節(jié)軟骨組織和天然組織非常相似。

本發(fā)明提供的一種促進間充質(zhì)干細胞軟骨組織分化的方法可靠、操作簡便、可重復(fù)性強，能夠有效促進間充質(zhì)干細胞軟骨組織分化，能夠為軟骨組織工程的科學(xué)研究以及軟骨損傷的臨床治療提供有益的參考，為生物打印技術(shù)的臨床化提供有效的方法及技術(shù)支撐。

上述實施例只是本發(fā)明的較佳實施例，并不是對本發(fā)明技術(shù)方案的限制，只要是不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動即可在上述實施例的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的技術(shù)方案，均應(yīng)視為落入本發(fā)明專利的權(quán)利保護范圍內(nèi)。