一種可用于臨床治療的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可供臨床使用的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，包括以下步驟：對患者的離體軟骨進行分離提取，獲得軟骨細胞；將所述軟骨細胞接種至培養(yǎng)基中進行細胞原代培養(yǎng)；待所述細胞原代培養(yǎng)中的所述軟骨細胞的匯合度為70～80%時進行細胞傳代培養(yǎng);其中，所述細胞原代培養(yǎng)和所述細胞傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基均含有體積分數(shù)5～20%的患者離體血清、20～40ng/mlFGF和20～40ng/mlPDGF。上述方法安全可靠，培養(yǎng)獲得的軟骨細胞適于臨床使用。
【專利說明】一種可用于臨床治療的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療領(lǐng)域的細胞體外培養(yǎng)技術(shù)，適用于骨科對關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療，特別涉及一種可供臨床使用的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法。
【背景技術(shù)】
[0002]軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)唯一的細胞類型，是終末細胞，在關(guān)節(jié)滑膜液的內(nèi)環(huán)境下缺乏增殖能力，加上關(guān)節(jié)軟骨沒有血液供應(yīng)，一旦破壞，缺乏再生修復(fù)能力。目前，治療人體軟骨疾病的方法，包括將從自體其他部位采集軟骨組織移植到缺損部位進行治療的方法，該方法存在采集部位選擇和采集量有限的問題，不能有效適用。為此，本領(lǐng)域技術(shù)人員進行新的構(gòu)思，希望通過采集少量軟骨，進行體外分離、培養(yǎng)擴增軟骨細胞后，再將軟骨細胞回植到患處關(guān)節(jié)的方式來實現(xiàn)軟骨的修復(fù)。
[0003]但是，現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)擴增方法是通過含動物源性血清的培養(yǎng)基進行軟骨細胞的體外擴增，由于異種蛋白可能引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，所以不能應(yīng)用于臨床，若從患者近親取血清，又需血型配對，會增加患者的經(jīng)濟負擔(dān)。而且現(xiàn)有的軟骨細胞培養(yǎng)基和生長因子的內(nèi)毒素含量高于0.5EU/ml，嚴重影響了軟骨細胞的增殖和生長速度。再者，現(xiàn)有的軟骨細胞培養(yǎng)方法，雖能在最大程度上避免細菌和真菌污染，但杜絕不了支原體(支原體直徑在
0.2-2 μ m，可以輕松地通過濾膜，混入培養(yǎng)系統(tǒng))的污染，導(dǎo)致軟骨細胞缺乏安全性，這進一步阻礙了軟骨細胞的臨床應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種可供臨床使用的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中體外軟骨細胞不能適用于臨床，且體外軟骨細胞擴增速度較慢、缺乏安全性的技術(shù)問題。`
[0005]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種可供臨床使用的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，包括以下步驟:
[0007]對患者的離體軟骨進行分離提取，獲得軟骨細胞；
[0008]將所述軟骨細胞接種至培養(yǎng)基中進行細胞原代培養(yǎng)；
[0009]待所述細胞原代培養(yǎng)中的所述軟骨細胞的匯合度為70~80%時進行細胞傳代培養(yǎng)；
[0010]其中，所述細胞原代培養(yǎng)和所述細胞傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基均含有體積分數(shù)5~20%的患者離體血清、20~40ng/mlFGF和20~40ng/mlPDGF。
[0011 ] 上述人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法所采用的離體軟骨來源于患者自身的非負重區(qū)軟骨，這樣不會影響患者的運動功能，且與傳統(tǒng)移植方法相比，效果顯著并減少了患者痛苦，一般的臨床醫(yī)生均能夠單獨操作。所述細胞培養(yǎng)基不添加任何動物血清，而利用生長因子和少量的患者自身血清作為細胞營養(yǎng)添加物，有效地避免了異種病毒的傳染，減小了細胞移植的風(fēng)險，提高了細胞移植的安全性，而且避免了免疫排斥和倫理問題。通過生長因子的生物學(xué)誘導(dǎo)效應(yīng)，刺激軟骨細胞增殖，達到軟骨細胞的數(shù)量級擴增，解決了細胞數(shù)量問題。擴增培養(yǎng)獲得的軟骨細胞能夠適用于臨床使用，將其移植到軟骨缺損部位后，可以分泌大量的細胞外基質(zhì)，從而促使缺損部位再生，治療效果顯著。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中:
[0013]圖1為細胞匯合度達70~80%時的軟骨細胞10倍放大圖；
[0014]圖2為細胞匯合度達70~80%時的軟骨細胞20倍放大圖。
【具體實施方式】
[0015]為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實施例與附圖，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0016]本發(fā)明實施例提供一種可供臨床使用的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，包括以下步驟:
[0017]S01、對患者的離體軟骨進行分離提取，獲得軟骨細胞；
[0018]S02、將所述軟骨細胞接種至培養(yǎng)基中進行細胞原代培養(yǎng)；待所述細胞原代培養(yǎng)中的所述軟骨細胞的匯合度為70~80%時進行細胞傳代培養(yǎng)；
[0019]具體地，上述SOl步驟中，所述離體軟骨來源于患者自體軟骨，優(yōu)選采集患者自身的非負重區(qū)軟骨100~200mg即可，這樣既能滿足細胞擴增的需要，又能在減少患者痛苦的條件下實現(xiàn)軟骨的修復(fù)和治療。進一步地，優(yōu)選在所述分離提取的步驟之前，將所述離體軟骨切成0.8~1.2mm3大小的軟骨組織塊，以便于消化處理，然后將切好的軟骨組織塊進行消化處理12~16小時，制得單個形式的懸浮軟骨細胞，這樣可以使得后續(xù)的分離有效進行。而且在所述消化處理步驟中，所使用的消化介質(zhì)優(yōu)選包括I~2mg/ml的II型膠原酶，消化處理的溫度優(yōu)選為37°C。具體可以這樣操作:以第一培養(yǎng)介質(zhì)沖洗所述軟骨組織塊3次后，放入8~IOmL第二培養(yǎng)介質(zhì)(即消化介質(zhì))中于37°C條件下進行消化，最后利用40微米的細胞濾器制成單個的懸浮細胞。其中，第一培養(yǎng)介質(zhì)為Ham’ sF12介質(zhì),包括IOmmol/LHEPES緩沖液、70 μ mol/L硫酸慶大霉素、22 μ mo I/L 二性霉素B、300 μ mol/L抗壞血酸。第二培養(yǎng)介質(zhì)含有I~2mg/ml的II型膠原酶。在所述分離提取步驟中，采用離心分離，離心速度優(yōu)選為1200~1500轉(zhuǎn)/分，棄上清液后收集細胞沉淀，這樣可以有效分離出所需的軟骨細胞。在采集的軟骨量為100~200mg時，一般可以得到I~2X IO5個軟骨細胞。
[0020]上述S02步驟中，一般按照2000~4000個/cm2的細胞密度將所述軟骨細胞接種在培養(yǎng)基上進行細胞原代培養(yǎng)，且所述細胞原代培養(yǎng)和細胞傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基均包含體積分數(shù)5~20%的患者離體血清、20~40ng/mlFGF和20~40ng/mlPDGF，其中，采集的離體血清為少量，這樣既不影響患者自身的身體健康和正常運動，又能避免擴增培養(yǎng)形成的軟骨細胞的免疫排斥現(xiàn)象，可以在臨床使用。20~40ng/mlFGF和20~40ng/mlPDGF為生長因子，均能促進軟骨細胞的增殖，保持軟骨細胞的表型，抑制軟骨細胞去分化，誘導(dǎo)軟骨細胞實現(xiàn)數(shù)量級擴增。
[0021]優(yōu)選地，所述患者自體血清可以通過以下方式獲得:抽取患者靜脈血40~50ml,置于含10u/ml肝素的40~50ml生理鹽水中，3000~3500轉(zhuǎn)/分鐘離心10~20分鐘，提取上層血清，于溫度4°C保存，這樣可以更好地滿足細胞培養(yǎng)基所需的基本用量和要求。在一優(yōu)選實施例中，所述細胞原代培養(yǎng)和細胞傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基都還包括10-12mmol/LHEPES緩沖液、70-75 μ mol/L硫酸慶大霉素、22-25 μ mol/L 二性霉素B以及300-310 μ mol/L抗壞血酸，形成完全培養(yǎng)基，可以有效地實現(xiàn)軟骨細胞的數(shù)量級擴增。
[0022]上述S02步驟中，為提高細胞貼壁率，在所述細胞原代培養(yǎng)和細胞傳代培養(yǎng)中，所述軟骨細胞被接種后需靜置I~3天，且被接種后每2~4天換一次細胞培養(yǎng)基。一優(yōu)選實施例中，當(dāng)所述軟骨細胞的匯合度為70~80%、需進行細胞傳代培養(yǎng)之前，例如在所述細胞原代培養(yǎng)之后、細胞傳代培養(yǎng)之前，通過加入TrypLESelect消化液消化，中止消化后反復(fù)吹打細胞，洗滌、按照1:2-3的比例進行傳代培養(yǎng)，擴增細胞，可以很好地實現(xiàn)細胞傳代培養(yǎng)。上述培養(yǎng)基優(yōu)選置于25~75cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，所述細胞培養(yǎng)瓶放置在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。進一步地，在所述細胞原代培養(yǎng)和細胞傳代培養(yǎng)過程中，為避免支原體等的污染，保證無任何微生物和內(nèi)毒素污染以有效控制擴增軟骨細胞的質(zhì)量，按照GMP國際質(zhì)控技術(shù)標準，將所述軟骨細胞置于空氣潔凈度10000級，生物安全柜100級的條件下進行擴增培養(yǎng)，這樣就可以達到細菌培養(yǎng)陰性，支原體培養(yǎng)陰性，內(nèi)毒素含量低于0.25EU/ml (臨床細胞回植的內(nèi)毒素含量要求為低于0.5EU/ml)，提高了移植細胞的存活率，也進一步保證了細胞培養(yǎng)的安全性。
[0023]上述方法利用少量的來源于患者的軟骨細胞結(jié)合GMP生產(chǎn)技術(shù)治療關(guān)節(jié)軟骨缺損臨床病例，避免了免疫排斥，安全有效，而且一般從細胞原代培養(yǎng)開始共12-21天后可使軟骨細胞由I~2X105個擴增到I~2X IO7個(具體可依據(jù)實際細胞數(shù)量所需進行擴增培養(yǎng))，同時細胞均保持了軟骨細胞表型，沒有去分化為成纖維細胞，細胞的數(shù)量和質(zhì)量均符合臨床治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的要求。在臨床適用中，將擴增得到的I~2X107個自體軟骨細胞離心后收集細胞沉淀,利用自體血清制備成0.5~Iml的細胞懸液，通過注射器注射于關(guān)節(jié)軟骨缺損處，無免疫排斥現(xiàn)象，細胞可以分泌大量的細胞外基質(zhì)，促使缺損部位再生。
[0024]現(xiàn)以具體的一種可供臨床使用的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法為例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。`
[0025]實施例1
[0026]一、軟骨細胞提取分離、培養(yǎng)與鑒定
[0027]1.軟骨細胞提取、分離與培養(yǎng)
[0028](I)患者血清分離
[0029]采集患者靜脈血40~50ml，置于含10u/ml肝素的40~50ml生理鹽水中，3000~3500轉(zhuǎn)/分鐘離心10~20分鐘，提取上層血清，0.1微米濾器過濾，4°C保存。
[0030](2)患者非負重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨采集
[0031]采用關(guān)節(jié)鏡取患者關(guān)節(jié)非負重區(qū)軟骨100~200mg。常規(guī)消毒、鋪單，局部麻醉后，關(guān)節(jié)鏡下取軟骨，放入9g/L冷無菌生理鹽水中。
[0032](3)軟骨細胞的提取分離
[0033]將軟骨切碎成0.8~1.2mm3大小，以培養(yǎng)介質(zhì)(Ham’sF12介質(zhì)，內(nèi)含IOmmol/LHEPES緩沖液、70 μ mol/L硫酸慶大霉素、22 μ mol/L 二性霉素Β、300 μ mol/L抗壞血酸)沖洗3次，放入8~IOmL培養(yǎng)介質(zhì)(內(nèi)含I~2mg/ml的II型膠原酶)中于37°C條件下消化12~16小時,而后用直徑40 μ m的尼龍篩網(wǎng)濾過,1200~1500轉(zhuǎn)/分的速度進行離心,得到的細胞計數(shù)為1.0~2.0X 105。按照2000~4000個/cm2的細胞密度接種在25~75cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，細胞培養(yǎng)瓶放置在細胞培養(yǎng)箱(37°C，5.0%C02)，按照GMP國際質(zhì)控技術(shù)標準，將所述軟骨細胞置于空氣潔凈度10000級，生物安全柜100級的條件下進行擴增培養(yǎng)。為提高細胞貼壁率，接種后I~2天內(nèi)勿挪動培養(yǎng)瓶，接種后每2~4天換液一次。
[0034](4)軟骨細胞的擴大培養(yǎng)
[0035]參見圖1和圖2，待I~2周后細胞的匯合度達70~80%時，加入TrypLESelect消化液消化，中止消化后反復(fù)吹打細胞，洗滌后按照1:2的比例分瓶接種，擴增細胞。根據(jù)患者關(guān)節(jié)軟骨缺損的面積決定細胞的需求量，不斷擴增細胞直至達到手術(shù)需求量。
[0036]2.常規(guī)的軟骨細胞的鑒定
[0037]將第1、2代軟骨細胞用TrypLESelect消化，PBS洗滌2次，制備106/ml單細胞懸液，接種于6孔板，分別進行甲苯胺藍染色、II型膠原免疫細胞化學(xué)檢測。實驗結(jié)果顯示兩代內(nèi)的軟骨細胞甲苯胺藍異染，II型膠原免疫細胞化學(xué)陽性。
[0038]二、軟骨細胞無外源動物血清的培養(yǎng)
[0039]為了有效避免動物血清可能存在的病毒對細胞造成污染，本發(fā)明在培養(yǎng)軟骨細胞過程中，所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Ham’ sF12介質(zhì)，內(nèi)含lOmmol/LHEPES緩沖液、70 μ mol/L硫酸慶大霉素、22 μ mol/L 二性霉素Β、300 μ mol/L抗壞血酸，添加5~20%患者自體血清，20~40ng/mlFGF和20~40ng/mlPDGF生長因子，制備成完全培養(yǎng)基。20~40ng/mlFGF，20~40ng/mlPDGF均能促進軟骨細胞的增殖，保持軟骨細胞的表型，抑制軟骨細胞去分化。
[0040]三、軟骨細胞生物安全性檢測
[0041]收集第I代至第2代的軟骨細胞。按照相關(guān)標準檢測細胞的成活率、支原體、內(nèi)毒素，主要參照的標準有:《中國藥典》2005版第三部附錄XIIA第73頁和《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第12部分:細胞、組織、器官的加工指南》相關(guān)規(guī)定；《中國藥典》2005版第三部附錄規(guī)定；人的體細胞治療申報臨床試驗指導(dǎo)原則。結(jié)果顯示:培養(yǎng)擴增的第I代到第2代的軟骨細胞未受到細菌、真菌和支原體的污染，內(nèi)毒素含量低于0.25EU/mL。
[0042]實施例2
[0043]一、軟骨細胞提取分離、培養(yǎng)與鑒定
[0044]1.軟骨細胞提取、分離與培養(yǎng)
[0045](I)患者血清分離
[0046]采集患者靜脈血40~50ml，置于含10u/ml肝素的40~50ml生理鹽水中，3000~3500轉(zhuǎn)/分鐘離心10~20分鐘，提取上層血清，0.1微米濾器過濾，4°C保存。
[0047](2)患者非負重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨采集
[0048]采用關(guān)節(jié)鏡取患者關(guān)節(jié)非負重區(qū)軟骨150mg。常規(guī)消毒、鋪單，局部麻醉后，關(guān)節(jié)鏡下取軟骨，放入9g/L冷無菌生理鹽水中。
[0049](3)軟骨細胞的提取分離
[0050]將軟骨切碎成0.8~1.2mm3大小，以培養(yǎng)介質(zhì)(Ham’sF12介質(zhì)，內(nèi)含IOmmol/LHEPES緩沖液、70 μ mol/L硫酸慶大霉素、22 μ mol/L 二性霉素Β、300 μ mol/L抗壞血酸)沖洗3次，放入8~IOmL培養(yǎng)介質(zhì)(內(nèi)含I~2mg/ml的II型膠原酶)中于37°C條件下消化12~16小時，而后用直徑40 μ m的細胞濾器濾過，1400轉(zhuǎn)/分的速度進行離心，得到的細胞計數(shù)為1.0~2.0X 105。按照3000個/cm2的細胞密度接種在25~75cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，細胞培養(yǎng)瓶放置在細胞培養(yǎng)箱(37°C，5.0%C02)，按照GMP國際質(zhì)控技術(shù)標準，將所述軟骨細胞置于空氣潔凈度10000級，生物安全柜100級的條件下進行擴增培養(yǎng)。為提高細胞貼壁率，接種后2天內(nèi)勿挪動培養(yǎng)瓶，接種后每3天換液(細胞培養(yǎng)基)一次。
[0051](4)軟骨細胞的擴大培養(yǎng)
[0052]參見圖1和圖2，待I~2周后細胞的匯合度達70~80%時，加入
[0053]TrypLESelect消化液消化，中止消化后反復(fù)吹打細胞，洗滌后按照1:2的比例分瓶接種，擴增細胞。根據(jù)患者關(guān)節(jié)軟骨缺損的面積決定細胞的需求量，不斷擴增細胞直至達到手術(shù)需求量。
[0054]2.常規(guī)的軟骨細胞的鑒定[0055]將第1、2代軟骨細胞用TrypLESelect消化，PBS洗滌2次，制備106/ml單細胞懸液，接種于6孔板，分別進行甲苯胺藍染色、II型膠原免疫細胞化學(xué)檢測。實驗結(jié)果顯示兩代內(nèi)的軟骨細胞甲苯胺藍異染，II型膠原免疫細胞化學(xué)陽性。
[0056]二、軟骨細胞無外源動物血清的培養(yǎng)方法
[0057]為了有效避免動物血清可能存在的病毒對細胞造成污染，本發(fā)明在培養(yǎng)軟骨細胞過程中，所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Ham’ sF12介質(zhì)，內(nèi)含lOmmol/LHEPES緩沖液、70 μ mol/L硫酸慶大霉素、22 μ mol/L 二性霉素Β、300 μ mol/L抗壞血酸，添加18%患者自體血清，30ng/mlFGF和30ng/mlPDGF生長因子，制備成完全培養(yǎng)基。30ng/mlFGF，30ng/mlPDGF均能促進軟骨細胞的增殖，保持軟骨細胞的表型，抑制軟骨細胞去分化。
[0058]三、軟骨細胞生物安全性檢測
[0059]收集第I代至第2代的軟骨細胞。按照相關(guān)標準檢測細胞的成活率、支原體、內(nèi)毒素，主要參照的標準有:《中國藥典》2005版第三部附錄XIIA第73頁和《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第12部分:細胞、組織、器官的加工指南》相關(guān)規(guī)定；《中國藥典》2005版第三部附錄規(guī)定；人的體細胞治療申報臨床試驗指導(dǎo)原則。結(jié)果顯示:培養(yǎng)擴增的第I代到第2代的軟骨細胞未受到細菌、真菌和支原體的污染，內(nèi)毒素含量低于0.25EU/mL。
[0060]自體軟骨細胞移植治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的臨床實驗
[0061]1.病例選擇:
[0062]患者無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，無骨性關(guān)節(jié)炎，并無感染性關(guān)節(jié)病，患側(cè)關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性、力線無異常。
[0063]2.治療方法:
[0064]關(guān)節(jié)鏡下檢查并收集自體軟骨。首先進行關(guān)節(jié)鏡檢查，評估韌帶、半月板情況，觀察軟骨缺損的位置、大小及缺損周圍組織的情況，從內(nèi)側(cè)或外側(cè)髁非負重區(qū)收集100~200mg軟骨。獲取離體軟骨后，提取分離軟骨細胞，體外擴增培養(yǎng)鑒定軟骨細胞，同時按照上述方法對擴增培養(yǎng)的軟骨細胞進行安全性檢測。2~3周后，患者再次入院，行內(nèi)側(cè)或外側(cè)髕旁切口，將軟骨缺損區(qū)修整，避免軟骨下出血，缺損區(qū)大小用鋁片測量，在脛骨近端或股骨近端取稍大于缺損面積形狀相宜的骨膜片，骨膜覆蓋缺損區(qū)，再用6-0的可吸收線縫合固定，骨膜周圍用纖維蛋白膠封閉按照病患缺損面積大小計算細胞懸液體積，用離體血清將體外擴增的軟骨細胞制成細胞懸液，并注射至缺損區(qū)，注射部位再次用纖維蛋白膠進行封閉。置引流條，肌肉皮膚分層縫合，包扎固定患側(cè)關(guān)節(jié)。[0065]3.效果分析
[0066]患者接受手術(shù)后的第I周、第4周、第6周、第8周、第24周來院復(fù)診，觀察骨關(guān)節(jié)軟骨缺損部位癥狀變化情況。并于24周對移植部位進行MRI觀察。結(jié)果顯示:通過自體軟骨細胞移植治療后，患者日常生活逐漸得到恢復(fù)，運動時的疼痛感有顯著緩解。通過MRI觀察發(fā)現(xiàn)通過自體軟骨細胞與骨膜復(fù)合的治療，不但有效阻止了軟骨缺損的發(fā)展趨勢，同時原有軟骨缺損部位也得到了一定程度的修復(fù)。
[0067]通過本發(fā)明，使人膝關(guān)節(jié)非負重區(qū)軟骨細胞在體外增殖，不但能數(shù)量級擴增人軟骨細胞，并按照臨床應(yīng)用的細胞培養(yǎng)規(guī)范進行體外擴增，所得到的軟骨細胞進行移植，并與骨膜復(fù)合后，用于治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。
[0068]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的 任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種可供臨床使用的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，其特征在于，包括以下步驟: 對患者的離體軟骨進行分離提取，獲得軟骨細胞； 將所述軟骨細胞接種至培養(yǎng)基中進行細胞原代培養(yǎng)； 待所述細胞原代培養(yǎng)中的所述軟骨細胞的匯合度為70~80%時進行細胞傳代培養(yǎng)； 其中，所述細胞原代培養(yǎng)和所述細胞傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基均含有體積分數(shù)5~20%的患者離體血清、20 ~40ng/mlFGF 和 20 ~40ng/mlPDGF。
2.如權(quán)利要求1所述的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，其特征在于，在所述細胞原代培養(yǎng)和細胞傳代培養(yǎng)過程中，按照GMP國際質(zhì)控技術(shù)標準，將所述軟骨細胞置于空氣潔凈度10000級，生物安全柜100級的條件下進行培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，其特征在于，所述患者離體血清通過以下方式獲得:抽取患者靜脈血40~50ml，置于含10u/ml肝素的40~50ml生理鹽水中，3000~3500轉(zhuǎn)/分鐘離心10~20分鐘，提取上層血清，于溫度4°C保存。
4.如權(quán)利要求1所述的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，其特征在于，在所述分離提取的步驟之前，將所述離體軟骨切成0.8~1.2mm3大小的軟骨組織塊，進行消化處理12~16小時，制得單個形式的懸浮軟骨細胞。
5.如權(quán)利要求4所述的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，其特征在于，所述消化處理步驟中，所使用的消化介質(zhì)包括I~2mg/ml的II型膠原酶，消化處理的溫度為37°C。
6.如權(quán)利要求1或2或4所述的人`膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，其特征在于，在所述細胞原代培養(yǎng)和細胞傳代培養(yǎng)步驟中，所述軟骨細胞被接種后需靜置I~3天，且被接種后每2~4天換一次細胞培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求1所述的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，其特征在于，在所述分離提取步驟中，采用離心分離，離心速度為1200~1500轉(zhuǎn)/分。
8.如權(quán)利要求1或2或4所述的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，其特征在于，所述細胞原代培養(yǎng)和所述細胞傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基都還包括10-12mmol/LHEPES緩沖液、70-75 μ mo I/L硫酸慶大霉素、22-25 μ mo I/L 二性霉素B以及300-310 μ mo I/L抗壞血酸。
9.如權(quán)利要求1或2或4或5所述的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，其特征在于，在所述細胞原代培養(yǎng)之后、細胞傳代培養(yǎng)之前，加入TrypLESelect消化液消化，中止消化后反復(fù)吹打軟骨細胞，洗滌、分開接種，進行所述細胞傳代培養(yǎng)以擴增細胞。
10.如權(quán)利要求1所述的人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞體外擴增方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基置于25~75cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，所述細胞培養(yǎng)瓶放置在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。
【文檔編號】C12N5/077GK103881969SQ201310753473
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】段莉, 王大平, 朱偉民, 陳潔琳, 熊建義, 陸偉, 彭亮權(quán) 申請人:深圳市第二人民醫(yī)院