一種通過Notch通路調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞EGFR表達(dá)的方法
【專利摘要】一個通過Notch通路調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞EGFR表達(dá)的方法，是通過Notchl?siRNA干擾胰腺癌細(xì)胞后，EGFR明顯下降。并經(jīng)過ChIP-seq發(fā)現(xiàn)Notch和CSL共同結(jié)合在EGFR的啟動子上。這說明Notch通路通過CSL來調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞中EGFR表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤生長。該方法首次在胰腺癌細(xì)胞中明確了Notch通路和EGFR表達(dá)的關(guān)系。可為腫瘤的靶向治療提供重要的靶點(diǎn)。
【專利說明】—種通過Notch通路調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞EGFR表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及通過Notch通路調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞EGFR表達(dá)的方法，屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)可啟動細(xì)胞核內(nèi)的有關(guān)基因，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在胃癌、乳腺癌、膀胱癌和頭頸部鱗癌中，EGFR表達(dá)增高，說明表皮生長因子受體是在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。
[0003]Notch信號通路是一個高度進(jìn)化并且保守的通路，介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞之間的相互作用。當(dāng)相鄰的細(xì)胞配體與受體相互作用時，會導(dǎo)致Notch蛋白連續(xù)裂解，釋放出受體的胞內(nèi)段(NICD)。NICD轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，并在細(xì)胞核中與DNA結(jié)合蛋白CSL(CBFi / RBP-J κ，Suppressor of Hairless, Lag-1的首字母縮寫)結(jié)合,啟動目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。我們的研究證明EGFR的表達(dá)受Notch-1的調(diào)控，通過調(diào)控Notch-1可以降低EGFR的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為控制腫瘤細(xì)胞的增殖與生長，如何阻斷EGFR所介導(dǎo)的信號通路。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)解決方案為使用NotchlsiRNA來干擾胰腺癌細(xì)胞后，可使EGFR表達(dá)明顯下降。
[0006]本方法具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0007]1.本方法可使EGFR表達(dá)明顯下降。
[0008]2.本方法，具有穩(wěn)定性好，作用明顯的特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1ChIP樣品驗(yàn)證的PCR電泳結(jié)果(M: IOObp DNA Marker ； 1:用RNA pol II抗體做的陽性對照組；2:Flag抗體沉淀Notchl的樣品組；3:Flag抗體沉淀CSL的樣品組；4:非特異性IgG抗體做的陰性對照組)；
[0010]圖2測序片段中CSL結(jié)合位點(diǎn)示意圖(在我們所測序片段之中比對CSL結(jié)合位點(diǎn)后，我們發(fā)現(xiàn)了有兩處是和CSL結(jié)合位點(diǎn)序列一致的)。
【具體實(shí)施方式】
[0011]1.合成干擾片段
[0012]合成特異性針對Notchl基因mRNA的siRNA和陰性對照siRNA。
[0013]2.轉(zhuǎn)染
[0014]在含有10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)BxPC3細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37°C、50mL / L C02飽和濕度下培養(yǎng)，試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染第一步中所獲得重組表達(dá)載體質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染PCDNA3空質(zhì)粒。細(xì)胞提前24小時傳代，六孔板中融合度至80%左右后，即按照Lipofectamine?2000說明書進(jìn)行陰性對照siRNA序列和Notchl siRNA的轉(zhuǎn)染。
[0015]3.WESTERN BLOT 檢測
[0016]在上述胰腺癌細(xì)胞中加入RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞后，我們按照試劑盒要求提取總蛋白，制作聚丙烯酰胺濃縮膠和分離膠，取不同組別的等量蛋白樣品進(jìn)行電泳，然后依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育和洗滌(其中一抗稀釋濃度為:1: 500;二抗稀釋濃度為:1: 3000)。最后，顯色曝光并通過X線膠片曝光洗片，經(jīng)自動電泳凝膠分析系統(tǒng)掃描井測定各組蛋白條帶的灰度值進(jìn)行比較，EGFR表達(dá)下降。
[0017]4.染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)
[0018](I)所培養(yǎng)BxPC3細(xì)胞的匯合度為80%時(每盤約I X IO7個，用RPMI1640培養(yǎng)基)，開始準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。
[0019](2)用Roche公司的轉(zhuǎn)染試劑將5種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)BxPC3細(xì)胞中，每種質(zhì)粒至少轉(zhuǎn)染2盤細(xì)胞，37度恒溫箱培養(yǎng)48h后收獲細(xì)胞。
[0020](3)在試驗(yàn)開始前一天將蛋白G瓊脂糖球珠的封閉處理:取300 μ L溶脹好的蛋白G瓊脂糖球珠，短暫離心后棄上清，加入ImL雙蒸水，在混勻器上4°C旋轉(zhuǎn)3min洗去殘留的鹽和乙醇，重復(fù)洗3次。加入雙蒸水900 μ L、10mg / mL BSA100 μ L，在混勻器上4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜，備用。
[0021](4)向培養(yǎng)基 中加入4%甲醛溶液，使其終濃度為I %，混勻后在室溫下靜置交聯(lián)10分鐘。再加入1.25M甘氨酸，使其終濃度為0.125M，混勻后在室溫下靜置5分鐘終止交聯(lián)反應(yīng)。倒掉反應(yīng)液，將培養(yǎng)皿至于冰上。
[0022](5)用適量4 °C I XPBS將每盤細(xì)胞洗2次，吸干洗液。之后每盤加
1.2mL4°C 1XPBS，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，移至1.5mL EP管中。4°C 5000rpm離心5min，棄上清，得到細(xì)胞沉淀。
[0023](6)在每管細(xì)胞沉淀中加入300 μ L4 V Lysis buffer、終濃度為I X的25Xcocktail和終濃度為ImM的PMSF，吹打重懸混勻，渦旋振蕩3_5次，在冰上靜置裂解IOmin0之后4°C 8000rpm離心5min,棄上清,得到細(xì)胞核沉淀。
[0024](7)在每管細(xì)胞核沉淀中加入300μL^?細(xì)胞核裂解液、終濃度為IX的25 X cocktaiL和終濃度為ImM的PMSF，吹打重懸混勻，渦旋振蕩3_5次，在冰上靜置裂解IOmin0
[0025](8)冰上超聲3次，超聲強(qiáng)度50，每次5s，每次間隔lmin。之后4°C 12000rpm離心
IOmin,取上清。
[0026](9)每管取少量等體積上清，合并于I管中作為Input樣品，總體積50yL即可。再加入50 μ L雙蒸水，終濃度為0.2Μ的NaCL和2 μ L RNase Α,混勻后37°C孵育30min。之后加入2μ L蛋白酶K，65°C解交聯(lián)過夜。酚/氯仿抽提，I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定超聲片段大小，以200-500bp為宜。
[0027](10)于每管超聲上清液中加入等體積封閉好的均質(zhì)蛋白G瓊脂糖球珠懸液(總用量500 μ L)，終濃度為I X的25 X cocktail，在混勻器上4°C旋轉(zhuǎn)孵育2小時進(jìn)行預(yù)清洗，以除去體系中的非特異免疫球蛋白。之后4°C 5000rpm離心2min，收集上清。
[0028](11)每管加入終濃度為IX的25Xcocktail，再于其中一管中加入2μ g NormalRabbit IgG非特異性抗體作為陰性對照,其他每管中各加入2 μ g Notchl抗體,在混勻器上4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜。
[0029](12)將余下的另一半蛋白G瓊脂糖球珠懸液混勻后等量加入各管中，再加入終濃度為I X的25X cocktail，在混勻器上4°C旋轉(zhuǎn)孵育2小時進(jìn)行免疫沉淀。之后4°C 5000rpm離心2min，棄上清，得到結(jié)合有DNA-轉(zhuǎn)錄因子-轉(zhuǎn)錄因子抗體復(fù)合物的蛋白G瓊脂糖球珠沉淀。
[0030](13)于4°C環(huán)境下，在混勻器上將蛋白G瓊脂糖球珠沉淀分別用ImL低鹽緩沖液、高鹽緩沖液和LiCl緩沖液各洗I次，最后用TE (pH = 8.0)緩沖液洗兩次，每次5min，4°C 5000rpm 離心 2min,棄上清。
[0031](14)配好洗脫液。在每管蛋白G瓊脂糖球珠沉淀中加入300μ L洗脫液重懸，在加熱混勻器上65°C、1200rpm振蕩30min進(jìn)行洗脫。之后常溫5000rpm離心2min,收集上清。在每管上清中加入終濃度為0.2M的NaCL和2 μ L蛋白酶K，65°C解交聯(lián)過夜，苯酚/氯仿抽提，得到純化的目的DNA。
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一個通過Notch通路調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞EGFR表達(dá)的方法，其特征在于使用NotchlsiRNA干擾作用胰腺癌細(xì)胞后，EGFR表達(dá)明顯下降。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于使用的是NotchlsiRNA來干擾胰腺癌細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所 述的檢測方法。
【文檔編號】C12N5/10GK103992987SQ201410095644
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】張玉祥, 劉浩 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)