專利名稱：胰腺β細(xì)胞增殖的刺激的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種與胰腺P細(xì)胞增殖和/或胰島素分泌相關(guān)的 新型蛋白、編碼該蛋白的核酸和構(gòu)建體以及包含該核酸和構(gòu)建體的
細(xì)月包。本發(fā)明還^是供了 TMEM27蛋白的診斷學(xué)和治療學(xué)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
為了維持生理性生長和肥胖過程中的血糖量正常，胰腺P細(xì)胞 增殖是一種重要的適應(yīng)機(jī)制。越來越多的證據(jù)表明(3細(xì)胞質(zhì)量是動(dòng) 態(tài)的，并且在胰島素4氐抗和妊娠過程中對(duì)胰島素分泌的要求有所增 加，這可能引起p細(xì)胞質(zhì)量迅速而明顯的變化。p細(xì)胞質(zhì)量由p細(xì) 胞生長(復(fù)制)和(3細(xì)胞死亡(凋亡)之間的平衡來控制，然而， 控制p細(xì)胞質(zhì)量的因素的分子基礎(chǔ)仍有待闡明。理解P細(xì)胞質(zhì)量是 如何調(diào)控的，對(duì)于設(shè)計(jì)合理途徑以在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下防止胰腺(3 細(xì)胞損失以及擴(kuò)充用于1型糖尿病中的移植的p細(xì)胞非常重要。
在發(fā)育過程中，(3細(xì)胞由月夷l^f且細(xì)胞群產(chǎn)生。由一且細(xì)月包分4匕的 P細(xì)胞是有絲分裂期后的，直接譜系示蹤研究表明祖細(xì)胞群在胚胎 形成的整個(gè)過程中持續(xù)存在，以允許新P細(xì)胞的分化。在新生兒期， 新p細(xì)胞通過分化的|3細(xì)胞復(fù)制而形成，引起(3細(xì)胞質(zhì)量的巨大增 加。除了在需求增加的條件下，成人期(3細(xì)力包lt量幾乎沒有增加。 在妊娠過程中，在嚙齒動(dòng)物和人類中，均)現(xiàn)察到(3細(xì)胞顯著增殖。 這是由于暴露于胎盤催乳素(PL )、催乳素(PRL )和生長激素(GH )的|3細(xì)胞減數(shù)分裂活性增加。人們對(duì)病理性胰島素一氏抗?fàn)顟B(tài)下的生 長刺激信號(hào)則理解得比專交少。
幾種胰島素抵抗和糖尿病的小鼠模型，例如和JM傷小 鼠或者通過胰島素受體底物-1 (IRS-1)基因失活或力夷島素受體和 IRS-1的雙雜合(DH)敲除產(chǎn)生的突變小鼠，表現(xiàn)出顯著的胰島增 殖。相反，IRS2功能的喪失則引起(3細(xì)胞顯著減少和糖尿病。已知 葡萄糖本身刺激P細(xì)胞復(fù)制，然而，多種上述小鼠模型在出現(xiàn)可沖企 測(cè)的高血糖癥之前，其總胰島質(zhì)量已經(jīng)增加了。而且，大多數(shù)情況 下，所述增殖反應(yīng)與高血糖癥水平?jīng)]有關(guān)系，暗示可能有不依賴于 葡萄糖的因素促進(jìn)胰島生長。
發(fā)育過程中的內(nèi)分泌胰腺生長依賴于多種轉(zhuǎn)錄因子，所述轉(zhuǎn)錄 因子表現(xiàn)出高度特異的時(shí)空表達(dá)模式，其控制細(xì)胞分化機(jī)制。在早 期月夷A泉發(fā)育過程中，內(nèi)分泌一且細(xì)胞的細(xì)月包命運(yùn)決策和分泌祖細(xì)月包分 化成產(chǎn)生激素的胰島細(xì)胞，受到特異性轉(zhuǎn)錄因子順序表達(dá)的嚴(yán)密調(diào) 控。這些因子的表達(dá)對(duì)于維持成人(成體)生命中的正常胰腺p細(xì) 胞功能也非常重要。例如，幾種轉(zhuǎn)錄因子的突變導(dǎo)致2型糖尿病的 一個(gè)亞型，稱為青春晚期糖尿病(MODY)，其特征在于常染色體顯 性遺傳、發(fā)病年齡早，且形成具有胰島素分泌累積性障礙的顯著高 血糖癥。MODY最常見的形式由編碼肝細(xì)胞核因子(Tcfl)的基因 突變引起。Tcfl功能喪失的突變小鼠以及轉(zhuǎn)基因小鼠(其表達(dá)膽A泉 P細(xì)胞中天然存在的顯性失活形式的人HNF-1 (P291fsinsC)),由 于葡萄糖剌激的胰島素分泌障礙，表現(xiàn)出隨年齡累積的高血糖癥。 這些小鼠表現(xiàn)出P細(xì)胞數(shù)量、增殖速率和胰腺胰島素含量的累積性 減少。這些數(shù)據(jù)表明Tcf-l耙基因?qū)τ诰S持正常p細(xì)胞質(zhì)量也是必 需的，盡管其身份仍然未知。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種分離的核酸，其包含
編碼TMEM27蛋白的基因的調(diào)控區(qū)，其中所述調(diào)控區(qū)包含至少一 個(gè)Tcfl蛋白的高親和力結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述調(diào) 控區(qū)具有對(duì)應(yīng)于或同源于SEQIDNO:10或11的核酸序列。在另一 個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述結(jié)合4立點(diǎn)包含只f應(yīng)于或同源于SEQ ID NO:12、 13、 14或15的核酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本 發(fā)明提供一種細(xì)胞，或者在另外一個(gè)具體實(shí)施方式
中，提供包含本 發(fā)明核酸的載體。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種分離的多肽，其包 含TMEM27蛋白的分泌形式，其中所述多肽大小約25 kDa，且包 含對(duì)應(yīng)于或同源于SEQ ID NO:16的序列的N-末端片^:。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種增加胰腺P細(xì)胞質(zhì) 量的方法，所述方法包4舌用TMEM27多月太4妻觸膽J^ (3細(xì)月包或可經(jīng) i秀導(dǎo)變成力夷〗泉P細(xì)力包的細(xì)胞，且一是供有利于P細(xì)胞增殖的條件。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種增加胰腺(3細(xì)胞質(zhì) 量的方法，所述方法包括用編碼TMEM27多肽的核酸4婁觸月臭&， p 細(xì)胞或可經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺P細(xì)胞的細(xì)胞，且提供有利于所述核酸表 達(dá)的條件。
在另 一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種改變患者新陳代謝 的方法，所述方法包4舌用TMEM27多肽或編石馬所述TMEM27多肽 的核酸接觸胰腺P細(xì)胞或可經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺卩纟田月包的纟田月包。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種抑制、遏制或治療 患者^f唐尿病的方法，所述方法包4舌用TMEM27多肽或編碼所述TMEM27多肽的核酸接觸胰腺P細(xì)胞或可經(jīng)i秀導(dǎo)變成月夷&泉|3細(xì)胞的 纟田月包。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種估計(jì)患者胰島質(zhì)量 的方法，所述方法包4舌確定所述患者血清中TMEM27 ;農(nóng)度的步-驟 以及將所述濃度與對(duì)照濃度進(jìn)行比#交的步驟。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種用于鑒定與 TMEM27蛋白或其分泌形式相互作用的蛋白的方法，所述方法包括 在足以^足進(jìn)所述多肽與所述感興趣分子之間特異性相互作用的條 件下，用感興趣分子4妻觸TMEM27多肽一革殳時(shí)間，以及鑒定所述 感興趣分子的步-驟。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種增加胰腺(3細(xì)胞質(zhì) 量的方法，所述方法包括用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑4妾觸減J泉(3 細(xì)胞或可經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺p纟田月包的纟田月包，并才是供利于所述核酸表達(dá) 的條件。
在另 一 個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供 一 種改變患者新陳代謝 的方法，所述方法包括用用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑4妻觸膽Ji (3 細(xì)胞或可經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺p纟田月包的纟田月包。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明—提供一種抑制、遏制或治療 患者糖尿病的方法，所述方法包括用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑接 觸胰&i (3細(xì)月包或可經(jīng)i秀導(dǎo)變成月夷i^卩纟田月包的細(xì)月包。


圖l表明TMEM27的表達(dá)受Tcfl調(diào)控。(A)相比野生型小鼠 對(duì)照，7b/,-小鼠胰島中的TMEM27表達(dá)降低。用RT-PCR測(cè)定表達(dá)水平，GAPDH用作對(duì)照。(B)啟動(dòng)子分析在人類調(diào)控區(qū)(SEQID NO: 10)和小鼠調(diào)，控區(qū)(SEQ ID NO: 11 ) TMEM27基因上游預(yù) 測(cè)了兩種保守的Tcf結(jié)合位點(diǎn)，位于相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-60和-117的堿基對(duì)。將人類和小鼠啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)，并將Tcf結(jié)合 位點(diǎn)用藍(lán)色框起來。第二位點(diǎn)(紅框)表示推定的Pdx-l結(jié)合位點(diǎn)。 力口亮的序歹'J (綠色)表示突變Tcf結(jié)合位點(diǎn)的位置。(C ) HepG2細(xì) 胞中的轉(zhuǎn)錄激活分析，該細(xì)胞用pcDNA3或pTcfl、 pCMV-(3-半乳 沖唐芬酶和利用815 bp TMEM27小鼠啟動(dòng)子的螢光素酶才艮告子基因 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Tcf結(jié)合位點(diǎn)在所述才艮告載體的啟動(dòng)子序列中單獨(dú)發(fā)生 突變，而MIN6纟田月包用載體pT271uc-wt、 pT271uc—ml或pT271uc—m2 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將螢光素酶活性相對(duì)于卩半乳糖苷酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 每一個(gè)數(shù)值均代表8次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。(D )利用針對(duì)Tcf結(jié)合 位點(diǎn)1和2的寡核普酸以及MIN6的總細(xì)胞^是耳又物進(jìn)^亍的EMSA分 析。竟?fàn)幬锉硎?0倍過剩、針對(duì)結(jié)合位點(diǎn)1和2的未標(biāo)記雙鏈寡 核香酸。暗色(深色)楔子表示Tcfl與標(biāo)記32P標(biāo)記的探針之間的 相互作用，亮色(淺色)楔子表示加入a-Tcfl抗體后該相互作用的 抗體月交移動(dòng)。Pdxl也結(jié)合于位點(diǎn)2,因?yàn)樵撓嗷プ饔每梢酝ㄟ^抗 -Pdxl 4元體而變動(dòng)。(E) MIN6細(xì)月包中的ChIP分沖斤i正實(shí)了 Tcfl與 TMEM27啟動(dòng)子的體內(nèi)相互作用。通過PCR擴(kuò)增跨越結(jié)合位點(diǎn)1 和2的150 bp區(qū)域。該相互作用在不表達(dá)TMEM27的原4氣肝細(xì)胞 中不存在。用于Tcfl的ChIP通過擴(kuò)增ApoM啟動(dòng)子內(nèi)^爭越Tcfl 結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域而進(jìn)行驗(yàn)證。
圖2表明TMEM27在發(fā)育過程中的小鼠胰腺中表達(dá)。用抗 Col-4、抗胰島素和抗胰高血糖素抗體對(duì)來自小鼠發(fā)育過程指定時(shí)間 點(diǎn)的石蠟包i里"夷"泉組織進(jìn)4于免疫熒光。
圖3表明TMEM27是N-糖基化蛋白且形成二聚體。(A)將 MIN6細(xì)胞與量不斷增加的衣霉素一起孵育，衣霉素在天(門)冬酰胺殘基抑制4唐基化作用。^又向細(xì)月包加7、 DMSO則無效應(yīng)。(B) 將MIN6細(xì)胞的上清與N-聚并唐酶一起孵育。Western印跡中的分子 量變動(dòng)表示所述酶乂人分泌的TMEM27去除了壽唐部分。分泌蛋白用 抗Col-3抗體進(jìn)行4企測(cè)。(C )將MIN6細(xì)胞裂解物與PBS或交耳關(guān)劑 DTBP和BMH —起孵育。非還原條4牛下的SDS-PAGE和利用抗 Col—4抗體的免疫印跡顯示有一個(gè)條帶的分子量為全長TMEM27分 子量的2倍。在還原條件下，在PBS和DTBP處理的細(xì)刀包裂解物中 則4又才企測(cè)到單體。相反，由于BMH交耳關(guān)不可逆，所以在BMH處 理的樣品中，二聚體持續(xù)存在。
圖4表明TMEM27從胰島的|3細(xì)胞上切割并分泌。(A)在 MIN6細(xì)月包的Western印跡中，抗Col-4抗體沖企測(cè)到TMEM27的兩 個(gè)條帶。在過表達(dá)pTMEM27.V5-His的細(xì)胞中，25kDa條帶變4尋更 加豐富。(B)來自(A)的細(xì)胞裂解物的免疫印跡用抗a-V5抗體 進(jìn)行斗企觀'J。在pTMEM27.V5-His轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，抗V5抗原表位的 抗體也才全測(cè)到兩種條帶，在pcDNA3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中則未才僉測(cè)到。 (C)表示細(xì)月包系用pcDNA3或pTMEM27進(jìn)4亍轉(zhuǎn)染，用抗Col-4 在細(xì)月包裂解物的Western印跡中才全測(cè)到了全長蛋白。用抗Col-3則 僅在MIN6細(xì)胞的上清中才全測(cè)到分泌蛋白。全長蛋白表達(dá)增加僅引 起MIN6細(xì)胞中分泌蛋白的量增加。(D)分離小鼠胰島并孵育72 小時(shí)。收集上清并將力夷島轉(zhuǎn)移至裂解IC沖液中。在裂解物的Western 印跡中用抗Col-4檢測(cè)到全長蛋白，在用相同體積上清上樣的進(jìn)行 的Western印跡中則用抗Col-3 4全測(cè)到分泌蛋白。(E ) MIN6細(xì)月包用 4十對(duì)GFP或TMEM27的siRNA進(jìn)4亍電穿孔。在用si-TMEM27#l 和#2進(jìn)4亍電穿孔的細(xì)月包中，于電穿孔后48小時(shí)用抗Col-4 4企測(cè)到 TMEM27蛋白水平的降低。用來自相同細(xì)胞、體積相等的上清進(jìn)行 SDS-PAGE,用抗Col-3檢測(cè)到分泌蛋白的水平降低。(F ) MIN6細(xì) 月包用pcDNA3、 pTMEM27或pTMEM27-HA進(jìn)4亍電穿孑L。通過利用 抗Col-4抗體的細(xì)月包裂解物進(jìn)4亍Western印跡，4企測(cè)到TMEM27過200680020054.8
說明書第7/44頁
表達(dá)。來自相同細(xì)月包的上清用抗HA抗原表4立的抗體進(jìn)4亍Western 印跡。
圖5表明TMEM27定位于胰腺p細(xì)胞的小嚢泡中和細(xì)胞膜上。 (A )將MIN6細(xì)胞用0.01%皂角戒進(jìn)行透化并用抗Col-4抗體進(jìn)行 染色。利用抗Col-3抗體進(jìn)行免疫熒光顯微鏡檢查，給出了類似結(jié) 果。(B)用抗Col-4抗體對(duì)MIN6細(xì)胞進(jìn)行電子顯微鏡檢查，將 TMEM27定位于小嚢泡中。軛合于10 nm金顆粒的IgG用于4全測(cè)所 述抗體。(C)利用與(B)中相同的方法，在與細(xì)胞膜融合過程中 4企測(cè)到包含TMEM27的小囊泡。
圖6表明TMEM27 i曾力口 p纟田月包的體夕卜復(fù)命J。 ( A)在/人 小鼠和野生型小鼠對(duì)照分離的胰島中，用半定量RT-PCR測(cè)定 TMEM27的表達(dá)水平。GAPDH用作上才羊只于照。(B)在/人4爭基因 ^P-^e一/c小鼠及其野生型小鼠(同窩出生^f子)對(duì)照中，如上測(cè)定 TMEM27的表達(dá)水平。(C )從野生型和oM 6小鼠分離的胰島數(shù)量 和大小匹配，并在相同體積的培養(yǎng)基中孵育72小時(shí)。用抗Col-3 才全測(cè)分泌蛋白。(D) MIN6纟田胞用針對(duì)螢光素酶或TMEM27的 siRNA進(jìn)行電穿孔。攝制20倍放大的細(xì)胞代表圖像。電穿孔后48 小時(shí)，將細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行處理、用錐蟲藍(lán)染色并用血細(xì)胞計(jì)數(shù) 器進(jìn)行計(jì)數(shù)。每一個(gè)數(shù)值均代表6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。(E )MIN6 細(xì)胞用pcDNA3或pTMEM27進(jìn)4亍電穿孑L，如上重復(fù)實(shí)-驗(yàn)。(F) MIN6細(xì)胞如所指定的進(jìn)行電穿孔，通過["H]胸苷摻入來測(cè)量細(xì)胞的 復(fù)制。
圖7表明，響應(yīng)于月夷&泉卩細(xì)月包中TMEM27表達(dá)增加而出現(xiàn)胰 島質(zhì)量增加。(A)在從RIP-TMEM27轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠對(duì) 照分離的月夷島Western印跡中，用抗Col-4才企觀'J到TMEM27表達(dá)增 加。(B)將來自轉(zhuǎn)基因和對(duì)照動(dòng)物(n=3)的整個(gè)胰腺在石蠟中包 埋，并針對(duì)胰島素進(jìn)行染色。圖像代表每一種基因型在5倍放大的圖示。(C )利用Metamorph專欠件對(duì)7 pm切片中的月夷島素染色進(jìn)4亍 定量。對(duì)每一個(gè)胰腺，均在距離大于200 pm的切片中定量至少50 個(gè)胰島。(D)將整個(gè)胰腺從轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠(n二3)上分離， 并在酸/乙醇中均質(zhì)化。胰島素含量相對(duì)于每個(gè)胰腺重量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖8表明TMEM27可以是絲氨酸和/或金屬蛋白酶的底物。相 比于與佛波酯佛波(12-)-肉豆蔻酸(-13-)乙酸(PMA)或與BB94+PMA 一起孵育的MIN6細(xì)胞，與絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶抑制劑BB94 一起孵育的MIN6細(xì)胞具有較低水平抗體識(shí)別的已切割N末端。用 抗V5 (其標(biāo)記TMEM27的C末端)抗體一企測(cè)的細(xì)力包，在所有小組 中均表現(xiàn)出可比較的條帶。
具體實(shí)施例方式
在接下來的詳細(xì)描述中，為了提供對(duì)本發(fā)明的徹底理解，列出 了大量特殊細(xì)節(jié)。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解本發(fā)明可以在無 這些特殊細(xì)節(jié)的情況下實(shí)施。在其他實(shí)例中，為了使本發(fā)明清楚， 未對(duì)/>知的方法、步驟和組分進(jìn)行詳細(xì)描述。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種胰腺p細(xì)胞特異蛋白， 其參與p細(xì)力包增殖和力夷島素分泌。
如本文所述，MODY常見形式由編碼肝細(xì)月包核因子(Tcfl)的 基因突變引起。胰腺(3細(xì)胞中Tcfl功能喪失的突變小鼠，由于葡萄 糖刺激的胰島素分泌障礙，表現(xiàn)出隨年齡累積的高血糖癥。所述小 鼠表現(xiàn)出p細(xì)胞數(shù)量、增殖速率和胰腺胰島素含量的累積性減少， 表明Tcfl耙細(xì)胞對(duì)于維持正常p細(xì)胞質(zhì)量也是必需的。Tcfl是 TMEM27轉(zhuǎn)錄的直4姿激活劑，如本文中所i正實(shí)的。本文中顯示在胰 l泉發(fā)育過禾呈中TMEM27在激素陽性細(xì)胞中表達(dá)，在成熟膽J^中則限于胰腺卩細(xì)胞中表達(dá)。已表明TMEM27是一種糖蛋白，在胰腺 中特異性切割并由(3細(xì)胞釋放，且是體外和體內(nèi)(3細(xì)胞復(fù)制的刺激劑。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明^是供一種分離的核酸，其包含 編碼TMEM27蛋白的基因的調(diào)控區(qū)，其中所述調(diào)控區(qū)包含Tcfl蛋 白的至少 一個(gè)高親和力結(jié)合^i點(diǎn)。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，術(shù)語"調(diào)控區(qū)"指的是啟動(dòng)子，其是 一種DNA序列，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，其位于編碼序列的上游， 對(duì)于基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄和/或調(diào)控轉(zhuǎn)錄非常重要。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，該啟動(dòng)子是內(nèi)源性啟動(dòng)子，包含Tcfl 蛋白的至少一個(gè)高親和力結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，該啟 動(dòng)子是內(nèi)源性啟動(dòng)子的突變體，其包含至少一個(gè)Tcfl蛋白的高親和 力結(jié)合^立點(diǎn)。該啟動(dòng)子序列中的突變可以增強(qiáng)Tcfl結(jié)合，或者在另 一個(gè)具體實(shí)施方式
中延遲Tcfl解離，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，通過任何途徑改變Tcfl與TMEM27啟動(dòng)子的結(jié)合，從而影響 其轉(zhuǎn)錄。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，將根據(jù)得到的TMEM27表達(dá) 水平來評(píng)估這些突變體的啟動(dòng)子強(qiáng)度。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，該調(diào)控區(qū)具有對(duì)應(yīng)于或同源于SEQ ID NO: 10或11的牙亥酉臾序歹'J 。
用于本發(fā)明中的核酸可以通過本領(lǐng)域中^^知的任何合成或重 組方法而生成。核酸還可以利用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)經(jīng)^奮飾而改變 生物物理學(xué)或生物學(xué)特性。例如，該核酸可以經(jīng)〗f飾增加其對(duì)核酸 酶的穩(wěn)定性(例如，"末端加帽")，或改良其親油性、溶解度或?qū)?互補(bǔ)序列的結(jié)合親和力。這些核酸可以包含載體、表達(dá)盒、啟動(dòng)子 序列、感興趣基因或其任何組合。才艮據(jù)本發(fā)明所述的DNA也可以通過本領(lǐng)域中已知的方法化學(xué) 合成。例如，所述DNA可以通過本領(lǐng)域中已知的方法全部或部分 /人四種核香酸化學(xué)合成。這些方法包4舌Camthers(1985)中描述的方 法。DNA也可以通過制備重疊的雙鏈寡核苷酸、填補(bǔ)空缺并將末 端連才妄在一起而合成(通常參見Sambrook et al.(1989)禾口 Glover et al.(1995))。表達(dá)該蛋白功能性同系物的DNA可以通過位點(diǎn)指導(dǎo) (Site-directed )的i秀變4乍用由里予生型DNA制備而4尋到(見例如 Zoller et al.(1982); Zoller(1983);和Zoller(1984); McPherson(1991))。 得到的DNA可以通過本領(lǐng)域中已知的方法而擴(kuò)增。 一個(gè)恰當(dāng)?shù)姆?法是在Saiki et al.(1988)、 Mullis et al.、美國專利第1,683,195號(hào)和 Sambrook etal.(1989)中描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR )法。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，該結(jié)合4立點(diǎn)包含對(duì)應(yīng)于或同源 于SEQIDNO:12、 13、 14或15的核酉史序列。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明核酸的 細(xì)刀包，或者在另外一個(gè)具體實(shí)施方式
中，4是供包含本發(fā)明核酸的載體。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，術(shù)語"載體"指的是包含感興趣序列 (其已經(jīng)在該載體內(nèi)亞克隆)的核酸構(gòu)建體。
為了產(chǎn)生才艮據(jù)本發(fā)明所述的載體，編碼TMEM27調(diào)控區(qū)的多 核苷酸，(在一些具體實(shí)施方式
中，為TMEM27的編碼區(qū)，而在一 些具體實(shí)施方式
中為其^f也感興趣序列)可以連^妻入市售的表達(dá)載體
系統(tǒng)中，所述表達(dá)載體系統(tǒng)適于轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)化真核或原核細(xì)月包以指導(dǎo)被 轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)重組產(chǎn)物的表達(dá)。應(yīng)該理解，為了取代、復(fù)制或 突變5見存的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列和/或？ 1入^H可其〗也多核苷S交序列，
容易通過通常4吏用的重組4支術(shù)而改良這些市售載體系統(tǒng)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，才艮據(jù)本發(fā)明所述的載體可以進(jìn)一步 包括恰當(dāng)?shù)目蛇x々奪標(biāo)記物。該載體可以進(jìn)一步包括復(fù)制起始點(diǎn)，而 且可以是穿梭載體，其既可以在原核細(xì)胞又可以在真核細(xì)J包中繁 殖，或者該載體可以經(jīng)構(gòu)建促進(jìn)其在選拷^鼓生物基因組內(nèi)整合。在 其他具體實(shí)施方式
中，該載體可以為例如質(zhì)粒、桿粒、噬菌if立、粘 粒、噬菌體、病毒或人工染色體。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā) 明沖是供包含本發(fā)明所述核酸和載體的脂質(zhì)體。用于制備這種脂質(zhì)體
的方法在本領(lǐng)域中是7^知的，正如在例如WO 96/18372、 WO 93/24640 、 Mannino 和 Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7):682-691、 Rose美國專利第5,279,833號(hào);WO 91/06309,以及 Feigner et al.(1987)Proc. Natl. Acid. Sci. USA 84:7413-7414)中所描述的。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供分離的多肽，包含 TMEM27蛋白的分泌形式，其中所述多肽大小約25 kDa,且包含 對(duì)應(yīng)于或同源于下述序列的N末端片革殳
QIDNO:16)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，該分泌形式包含142個(gè)氨基 酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中該分泌形式包含N末端的100個(gè)氨基 酸，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中包含N末端的105個(gè)氨基酸，或 者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中包含N末端的110個(gè)氨基酸，或者在另 一個(gè)具體實(shí)施方式
中包含N末端的115個(gè)氨基酸，或者在另一個(gè)具 體實(shí)施方式中包含N末端的120個(gè)氨基酸，或者在另一個(gè)具體實(shí)施 方式中包含N末端的125個(gè)氨基酸，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中 包含N末端的130個(gè)氨基酸，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中包含N 末端的135個(gè)氨基酸，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中包含N末端的140個(gè)氨基酸，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中包含N末端的122個(gè) 氨基酸，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中包含N末端的127個(gè)氨基酸， 或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中包含N末端的117個(gè)氨基酸，或者在 另一個(gè)具體實(shí)施方式
中包含N末端的108個(gè)氨基酸。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，TMEM27蛋白具有的序列對(duì)應(yīng)于或同 源于一個(gè)NCBI，s Entrez蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中4皮露的序列，具有下列登 陸號(hào)NP—065651、 AAH50606、 AAH15099、 XP_416821、 AAH49912 或者AAH14317。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明所述的多肽包含 的氨基酸對(duì)應(yīng)于TMEM27蛋白1-142位置的氨基酸，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中對(duì)應(yīng)于其N末端片H或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，對(duì)應(yīng)于其同系物。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，任何情況下，術(shù)語"同源性"、"同系 物"或"同源的"均表示所-提到的序列，無論是氨基酸序列還是核 酸序列，均表現(xiàn)出與指定序列至少70%的一致性。在另一個(gè)具體實(shí) 施方式中，所述氨基酸序列或核酸序列表現(xiàn)出與指定序列至少72% 的一致性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列 表現(xiàn)出與指定序列至少75%的一致性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中， 所述氨基酸序列或核酸序列表現(xiàn)出與指定序列至少77%的 一致性。 在另 一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現(xiàn)出與指 定序列至少80%的一至丈性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述氨基酸 序列或核酸序列表現(xiàn)出與指定序列至少82%的一致性。在另一個(gè)具 體實(shí)施方式中，所述氨基酸序列或核酸序列表現(xiàn)出與指定序列至少 85%的一致性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述氨基酸序列或核酸 序列表現(xiàn)出與指定序列至少87%的一致性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現(xiàn)出與指定序列至少90%的一致 性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現(xiàn)出 與指定序列至少92%的一致性。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現(xiàn)出與指定序列至少95%的一致性。在另一 個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述氨基酸序列或核酸序列表現(xiàn)出與指定序列
95%-100%的一致性。類似地，如在本文中4吏用的，才是到與一個(gè)特 定序列的 一致性既包括直接對(duì)應(yīng)，也包括與該序列的同源性，如在 本文中所定義的。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，術(shù)語"多肽"指的是蛋白，在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中指的是蛋白片段，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中指 的是一串氨基酸。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，在提到本發(fā)明的任何多 肽時(shí)，提到"肽"或"多肽，，，其意思既包括天然肽(降解產(chǎn)物、 合成肽或重組肽)以及擬肽(通常是合成肽)，例如類肽和半類肽， 其為肽類似物，可能含有(例如)修飾使得所述肽在體內(nèi)更加穩(wěn)定 或者更易于滲入細(xì)胞內(nèi)。這種修飾包括但不限于N末端、C末端或 肽鍵修飾，后者包括但不限于主鏈修飾和殘基修飾，每一種均代表 本發(fā)明 一個(gè)另外的具體實(shí)施方式
。用于制備擬肽化合物的方法是本 4貞；或中公歲口， 且在侈'H口 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd.， Chapter 17.2， F. Choplin Pergamon Press(1992)中進(jìn)4亍了 i,纟田i兌明。
應(yīng)該理解，通過任何途徑得到的天然或合成的任何氨基酸序 列，只要表現(xiàn)出與本文中所描述多肽的序列、結(jié)構(gòu)或功能同源性， 均i人為是本發(fā)明的 一部分。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，在l是到^f壬何核酸序列時(shí)，術(shù)語"同源 性"均表示候選序列中的核苷酸與相應(yīng)的天然核酸序列核苷酸一致 的百分比。
同源性可以利用本領(lǐng)域中詳細(xì)描述的方法通過用于序列比對(duì) 的計(jì)算才幾算法來確定。例如，核酉殳或氨基酉吏序列同源'l"生的計(jì)算才幾算 法分析可以包括利用任何數(shù)量的可用軟件包，如BLAST 、 DOMAIN、BEAUTY (BLAST Enhanced Alignment Utility), GENPEPT和 TREMBL包。
另 一種確定核酸同源性的方法是通過確定候選序列的雜交作 用，其方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)詳細(xì)描述過(見例如"Nucleic Acid Hybridization" Hames， B.D., and Higgins S ., Eds.(1985); Sambrook et al., 1989， Molecular Cloning, A Laboratory Manual,(Volumesl-3)Cold Spring Harbor Press, N.Y.; 以及 Ausubel et al" 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.)。例如，對(duì)編碼天然半月光天冬酶肽的DNA的互補(bǔ) 物，雜交方法可以在中度到嚴(yán)4各條件下實(shí)施。雜交條件為例如在一 種溶液中42。C孵育過^艾，該溶液中含有10-20%甲酰胺、5xSSC
(150 mM NaCl、 15 mM枸片緣酸鈉)、50 mM石粦酸鈉(PH 7.6)、 5xDenhardt，s液、10%碌u酸葡聚糖以及20 |ig/ml變性的剪切鮭精 DNA。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明沖是供特異性識(shí)別本發(fā)明所述 多肽的抗體。這樣一種抗體的生產(chǎn)在本領(lǐng)域中是公知的，可以包括 如Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988中描述的方法。在一個(gè)具體實(shí)施 方式中，這種抗體可以包含功能片段，其為本領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟 知，且可以通過抗體的蛋白水解或者通過編碼該片,殳的DNA在 E.coli或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如中華倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物或其他蛋白 表達(dá)系統(tǒng))內(nèi)表達(dá)而制備。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明所述細(xì)胞、 多肽、抗體、核g臾和載體的組合物。特定組合物制劑的有效劑量和 纟合藥方法可以才艮才居凈爭定應(yīng)用而不同。劑量可以作為(例如)所采用 載體類型和纟合藥途徑的函凄t而變動(dòng)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明所述核酸、 載體或多肽的細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，該細(xì)胞為原核細(xì)胞， 或在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞為真核細(xì)胞。細(xì)胞可以為任 何能夠表達(dá)本發(fā)明所述分離的核酸和/或載體的細(xì)胞，如本領(lǐng)域中技 術(shù)人員已知的。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞可以過表達(dá)本發(fā)明所 述的多月太。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞響應(yīng)本發(fā)明所述的多肽。在一
個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞是胰腺(3細(xì)胞或可能分化為胰腺(3細(xì) 胞的細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞一旦暴露于TMEM27 (在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，其為全長蛋白，或者在另一個(gè)具體實(shí)施
方式中，其為已切割的分泌形式)就出現(xiàn)增殖，或者在另一個(gè)具體 實(shí)施方式中分泌月夷島素，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，既增殖又 分泌月夷島素。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)月包是終末分化的，或 者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中為不分裂的。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞是分裂的。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明^是供核酸、載體、多肽、細(xì)月包 以及包含上述物質(zhì)的組合物，在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，其可能經(jīng) 配制用于口月l給藥，在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中經(jīng)配制用于局部給 藥，例如通過氣霧劑、肌內(nèi)或經(jīng)皮膚給藥或者通過腸胃外應(yīng)用。根 據(jù)纟會(huì)藥方法的不同，組合物可以以多種單^f立劑量形式鄉(xiāng)會(huì)藥。恰當(dāng)?shù)?單位劑量形式包括但不限于粉劑、片劑、丸劑、膠嚢、錠劑、栓劑 等。經(jīng)皮膚給藥可以通過應(yīng)用能夠允許活性化合物滲入皮膚的膏狀 物、沖洗劑、凝膠等而實(shí)現(xiàn)。腸胃外給藥途徑包括但不限于電注射 或直接注射例如直接注射入中樞靜脈輸血導(dǎo)管、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹 月莫內(nèi)、皮內(nèi)或皮下注射。
本文中i正實(shí)TMEM27在新生兒和成人月爽&，的月夷島(3細(xì)月包內(nèi)表 達(dá)(圖2 ),且發(fā)現(xiàn)TMEM27蛋白的N末端切割產(chǎn)物被分泌(圖4 )。卩細(xì)胞系響應(yīng)于TMEM27而增殖(圖6)，由于所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)， 過表達(dá)該蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為P細(xì)胞質(zhì)量增加(圖7 )。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明^是供一種增加"夷〗漆(3細(xì)胞質(zhì)量 的方法，其中所述方法包4舌用TMEM27多肽4妻觸細(xì)月包。才艮據(jù)本發(fā) 明所述的這個(gè)方面，且在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞是"夷&泉(3 纟田月包，或者所述細(xì)月包可以經(jīng)i秀導(dǎo)變成月夷&， |3纟田月包，并才是供利于P細(xì) 月包增殖的條件。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，術(shù)語"接觸細(xì)胞"指的是細(xì)胞暴露于 本發(fā)明所述的肽、核酸或組合物。細(xì)胞可以與本發(fā)明所述的化合物 和組合物直接接觸，或者通過本領(lǐng)域中已詳細(xì)描述的方法間接暴 露。例如，在體外培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基用本發(fā)明 所述的多肽、核酸、載體或組合物加以補(bǔ)充，為一種4妾觸細(xì)力包方法 的實(shí)例，且認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，接 觸細(xì)胞可以包括任何對(duì)患者的給藥途徑，例如將本發(fā)明所述的肽、 核酸、載體或組合物通過口服或腸胃外給予患者，其中給藥4吏得體 內(nèi)特定部位中的體內(nèi)細(xì)月包暴露于這些物質(zhì)。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述^^接觸細(xì)月包是原^i咅養(yǎng)物。在一 個(gè)具體實(shí)施方式
中，"原代培養(yǎng)物"表示允許從組織中分離的多種
不同細(xì)胞類型相互作用的混合細(xì)胞群。例如，胰腺導(dǎo)管細(xì)胞的原代 培養(yǎng)物可以允許間充質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的相互作用。
在另 一個(gè)具體實(shí)施方式
中，原^培養(yǎng)物可以為,人組織中分離的 純化細(xì)胞群。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述原代培養(yǎng)物可以對(duì)一種 特殊(細(xì)胞)群進(jìn)行富集。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，富集可以包括 通過本領(lǐng)i或中7>知的方式進(jìn)4亍細(xì)月包分選，例如熒光〖敫活細(xì)月包分類術(shù) (FACS),用于例如表達(dá)特定細(xì)胞表面標(biāo)記物的細(xì)胞群，或者在另 一個(gè)具體實(shí)施方式
中，用于無特定標(biāo)記物的細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)月包群。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可以采用磁分離法，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可采用密度離心法如聚蔗糖-泛影葡胺或蔗糖梯度 分離法。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，根據(jù)本發(fā)明方法所述的被接觸細(xì)胞是
干細(xì)月包或-且細(xì)月包。術(shù)i吾"一且細(xì)月包"作為"干細(xì)月包"的同義詞4吏用， 在一些具體實(shí)施方式
中指的是能夠增殖并產(chǎn)生更多^且細(xì)月包的未分 化細(xì)胞，所述祖細(xì)胞具有產(chǎn)生大量母細(xì)胞的能力，母細(xì)胞又能產(chǎn)生 分化的或可分化的子細(xì)月包。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，術(shù)語-且細(xì)月包或 干細(xì)胞指的是無顯著特點(diǎn)的母細(xì)胞，其后代(子代)常?？梢酝ㄟ^
在胚胎細(xì)胞和組織的漸進(jìn)性多樣化中所發(fā)生的。細(xì)胞分化是一種復(fù) 雜過程，通常通過多次細(xì)胞分裂而發(fā)生。分化的細(xì)胞可以起源于多 潛能細(xì)胞，其本身來自多潛能細(xì)月包，等等。應(yīng)該理解任何這種細(xì)胞 均可用于本發(fā)明所述的方法，或者包含本發(fā)明所述的細(xì)胞。這種能 力可以是天生的，或者可以在用多種因子治療后人工i秀導(dǎo)，兩種方 案之一均可認(rèn)為是所述細(xì)胞的具體實(shí)施方式
，其可才艮據(jù)本發(fā)明所述 的方法而使用，或者包含本發(fā)明所述的細(xì)胞。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明所述的細(xì)胞以及用于本發(fā)明所 述方法的細(xì)胞來源于胰腺，或者可分化為胰腺細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí) 施方式中，術(shù)語"胰腺"通常指的是橫向位于胃后、脾和十二指腸 之間的大、伸長、總狀分枝的腺體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，才艮據(jù) 本發(fā)明所述的細(xì)胞可以包括組織切片或整個(gè)組織，其包括本文中所 述的多肽、核酸、載體或組合物。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，才艮才居 本發(fā)明所述的方法包括器官培養(yǎng)物，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，包括組織切片或組織片段，其包含感興趣細(xì)胞群。在一個(gè)具體 實(shí)施方式中，使用胰島作為該細(xì)胞并用于本發(fā)明的方法中。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞是卩細(xì)胞，可構(gòu)成胰島細(xì)胞的60-80%,
和/或可用于本發(fā)明所述的方法中。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞是胰腺祖細(xì)胞。在一個(gè)具體
實(shí)施方式中，術(shù)語"胰腺祖細(xì)胞"指的是可以分化為胰腺i普系細(xì)胞 的細(xì)月包，例如能產(chǎn)生通常由胰腺細(xì)胞產(chǎn)生的激素或酶的細(xì)胞。例如， 可以引起胰腺祖細(xì)胞至少部分分化為a、 p、 y或5胰島細(xì)胞或者具 外分泌命運(yùn)的纟田月包。本發(fā)明所述的胰腺祖細(xì)胞也可以在給予患者前 在能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的條件下培養(yǎng)。這些條件包括培養(yǎng)細(xì)胞 允許體外增殖和融合，這時(shí)，所述細(xì)胞可以經(jīng)制備形成々U夷島狀聚
集體或簇，并分泌胰島素、胰高血糖素和/或生長抑素。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明所述的細(xì)胞以及用于本發(fā)明所 述方法的細(xì)胞，可以為基本純化的細(xì)胞群。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中， 術(shù)語"基本純化的"指的是一群細(xì)胞，相對(duì)于整個(gè)細(xì)胞群，其至少 約65%,或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中至少約70%,或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中至少約75%，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中至少約 85%,或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中至少約90%,或者在另一個(gè)具 體實(shí)施方式中至少約95%為純4匕的。
可以采用多種技術(shù)從組織獲得細(xì)胞(分化和未分化的)懸浮液， 構(gòu)成本發(fā)明所述細(xì)胞和/或用于本發(fā)明所述方法。在一些具體實(shí)施方 式中，分離操作是那些盡可能少地引起細(xì)胞死亡的操作。例如，所 述細(xì)月包可以通過積4成方式,人分離塊才羊品中耳又出，例如用移'液管積4成 剝離。在其他情況下，可能從整個(gè)分離塊或其一部分解離祖細(xì)胞， 例如通過酶消化該分離塊，隨后沖艮據(jù)特定細(xì)月包標(biāo)i己物分離激活的對(duì)且 細(xì)胞群，例如利用親和力分離4支術(shù)或熒光激活細(xì)胞術(shù)(FACS)。細(xì) 月包可以通過離心乂人'液體才羊品例^口血、液中獲《尋。通常，所述組織可利用<壬4可恰當(dāng)方法制備，例如通過輕柔湘匕撥 離體組織或通過用膠原酶(例如膠原酶A)消化離體組織，借助于 (為了闡明)通過導(dǎo)管滲透或例如將剝離組織在含有恰當(dāng)pH和張 力強(qiáng)度的緩沖液的膠原酶中的簡單孵育。可選地，隨后所述制備的 組織可以利用恰當(dāng)?shù)姆椒ê筒臎_牛濃縮，例如通過聚蔗糖梯度離心來 濃縮(或者部分純化)。濃縮的組織隨后重懸于任何恰當(dāng)?shù)娜萜髦校?例如3皮璃或塑料組織培養(yǎng)器皿中。在某些具體實(shí)施方式
中，所述樣
品月夷&i組織可允許形成融合的單層培養(yǎng)物，NACs可形成自該培養(yǎng) 物。在其他優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞懸浮液置于非黏附的 培養(yǎng)容器中，且形成祖細(xì)胞球。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)月包起源的纟且織可以為成人《且織 或胎兒組織或任何發(fā)育階段的組織。而且，所述方法可以用相對(duì)小 量的初始材料實(shí)施。因此，無需處死或嚴(yán)重傷害供體，即可獲得供 體的小組織樣品。本發(fā)明的祖細(xì)胞可以擴(kuò)增，且隨后從組織沖羊品分離。
在某些具體實(shí)施方式
中，可以用生長因子或包含生長因子(例 如有絲分裂生長因子)的組合物接觸培養(yǎng)物，例如，所述生長因子 選自由IGF-1、 IGF-II、 LIF、 TGFa、 TGF(3、 bFGF、 aFGF、 HGF 或Hedgehog組成的組。在其4也具體實(shí)施方式
中，所述生長因子是 TGFP超家族的成員。在一些具體實(shí)施方式
中，才艮據(jù)本發(fā)明所述的 方法包含如本文所述將組合物給予患者，其中所述組合物可以包含 本發(fā)明的細(xì)胞、多肽、核酸和/或載體，還包括本文所述的任何添加 劑，包含例如糖尿病療法、生長因子、cAMP增強(qiáng)劑等。
在一些具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)月包或i咅養(yǎng)物中的細(xì)月包用cAMP 增強(qiáng)劑(或者包含cAMP增強(qiáng)劑的組合物)接觸，例如8-(4-氯苯 石克代)-阿沖唐腺普-3，:5，-環(huán)-一石粦酸(鹽)(CPT-cAMP)(參見例如Koike Prog. Neuro-Psychopharmacol, and Biol. Psychiat.16 95-106(1992》、CPT-cAMP、福斯高林、丁酸鈉、3-異丁基-l-曱基黃嘌呤(IBMX)和 霍舌L毒素(見Martinetal.J. Neurobiol.23 1205-1220(1992))以及8-溴-cAMP、 二丁酰cAMP和二辛酰cAMP(例力口，見Rydel et al. PNAS 85:1257(1988))。
在一些具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞或培養(yǎng)物中的細(xì)胞用類固醇 或皮質(zhì)類固醇(或者包含類固醇或皮質(zhì)類固醇的組合物)4妄觸，例
如氫^^可的枉\脫氧氫^b可的+乂氟氫可的杠\ 去氫氫^b可的+〉、 曱基去氫氫化可的松、去氫可的松、氟羥潑尼松龍、地塞米松、倍
他米松和對(duì)氟米松。 一般參見，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed.,pp.l239-1267和2497-2506, Berkow et al" eds., Rahway N丄，1987)。
現(xiàn)在存在多種組織培養(yǎng)基適于培養(yǎng)來自動(dòng)物包括人的組織。在 一些具體實(shí)施方式
中，組織培養(yǎng)基可以為簡單培養(yǎng)基，例如 Dulbecco，s必需基本培養(yǎng)基(DMEM )。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中， 纟田月包、組織等在含有5% FBS的Isobecco，s改良MEM細(xì)月包i咅養(yǎng)基 中培養(yǎng)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，纟田月包、組織等在無血清的情況 下長期維持。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
中，所述生長因子或其 他有絲分裂劑未包括在用于體外維持培養(yǎng)物的原代培養(yǎng)基中，但隨 后可用來引起不同細(xì)胞(例如祖細(xì)胞)群增殖。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，干細(xì)胞由于其在缺乏對(duì)培養(yǎng)表面的 黏附時(shí)仍能夠生長的能力，因而可以直4妻或間4妻富集。在一些具體 實(shí)施方式中，干細(xì)胞在懸浮液中自由浮動(dòng)，而不與培養(yǎng)容器表面或 相4妄觸的其他細(xì)月包或材詩牛形成固定或半固定4妻觸。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，4艮據(jù)本發(fā)明所述的細(xì)月包用于(且本發(fā) 明所述方法4是供可移植細(xì)胞源)其分化子代的祖細(xì)胞群形式中，或 者在另 一個(gè)具體實(shí)施方式
中，受體細(xì)胞可用來產(chǎn)生胰腺細(xì)胞培養(yǎng)物以4尋到并純4匕分泌因子，例如TMEM27的分泌形式。在另一個(gè)具 體實(shí)施方式中，培養(yǎng)的細(xì)胞可以作為胰島素源而提供。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明4是供一種增加膽J泉p細(xì)月包質(zhì) 量的方法，所述方法包含用編石馬TMEM27多肽的沖亥S臾，接觸細(xì)月包， 所述細(xì)胞是胰腺(3細(xì)胞或者可以經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺p細(xì)胞的細(xì)胞，以 及沖是供有利于所述核酸表達(dá)的條件。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，p細(xì)月包質(zhì)量增力口通過增力口 p細(xì)月包增殖 而實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，卩細(xì)月包質(zhì)量增加是由于^且細(xì)月包分 化成(3細(xì)胞系增力口。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，(3細(xì)胞質(zhì)量增加指的 是細(xì)胞轉(zhuǎn)換或死亡減少。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，p細(xì)胞質(zhì)量增 加指的是上述具體實(shí)施方式
的^H可組合。
細(xì)胞增殖可以通過本領(lǐng)域中公知的任何數(shù)量的方法來確定，如 本文中所例示的，例力口通過測(cè)定吸4t標(biāo)i己的底物，例力口氚標(biāo)i己胸普, 正如本領(lǐng)域中才支術(shù)人員已知的。
在另 一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明4是供一種改變患者體內(nèi)新陳 代謝的方法，所述方法包括用TMEM27多肽或編碼所述TMEM27
月夷&泉(3纟田月包的纟田月包。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，改變新陳代i射指的是增加新陳代i射， 而在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，其指的是減少新陳代謝。在一個(gè)具體 實(shí)施方式中，葡萄糖代"i射,皮改變。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì) 胞在體外或離體進(jìn)行接觸。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞在 體內(nèi)接觸。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞是干細(xì)胞或祖細(xì)胞。 在另 一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞從患糖尿病或易患糖尿病的患
者中分離。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述方法包括將接觸過的細(xì)胞給予所 述患者的步驟，例如離體細(xì)胞治療。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，給予 患者的細(xì)胞相對(duì)所述患者是自體同源的，或者在另 一個(gè)具體實(shí)施方 式中，相對(duì)所述患者是同種異體的。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)月包用TMEM27多肽進(jìn)4亍沖妻觸， 所述多肽包括全長蛋白或其片段。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述片 段包含TMEM27蛋白的分泌形式。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所 述分泌形式大小約25 kDa，包含TMEM27蛋白的氨基酸1-142，或
其片革殳，或其同源的序列。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞還可以用蛋白酶抑制劑進(jìn)行 4妄觸。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，蛋白酶抑制劑是遏制、防止、減少、 延纟爰，或以任何方式改變蛋白酶活性或表達(dá)或二者的分子。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑 制劑(Serpin)、金屬蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、硫代 蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑、蘇氨酸蛋白酶抑制劑、門冬氨酸 蛋白酶抑制劑或其組合。
在 一 個(gè)具體實(shí)施方式
中，蛋白酶抑制劑是 (HONH-COCH2CH2CO-FA-NH2) 、 (OA-Hy;順式-9-油酸?；?N-羥 酰胺；油酰-N-氫化環(huán)酰胺),、(N-[[(4,5-二氫-5-碌u代-l，3,4-噻二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸曱酯)、U-[[[4，5-二氫-5-硫代-l,3,4-噻二 唑-2-基)氨基]羰基]氨基]-((2-吡啶基)哌嗪基-(S)-苯丙烷酰胺)、 { (2R)-2-[(4-二苯磺酰)氨基]-3-苯丙酸}、 { (2R)-[(4-二苯磺酰)氨 基 ]_N- 羥 基 -3- 苯 丙 酰 胺 } 、 H-Cysl-Thr陽Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-CyslO-OH 、 (SB-3CT)、 (Ac-RCGVPD-NH2;基質(zhì)溶解素-1抑制劑)、[N-異丁基-N-(4-甲氧 苯石黃酰)-甘氨酰異羥肟酸;NNGH](N-[[4，5-二氫-5 J克代-1,3,4-p塞二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸}、 (a-[[[4,5-二氫-5-硫代-1，3，4-噻二唑 -2-基)氨基]-羰基]氨基]-N-(環(huán)己基甲基)-(S)-苯丙酰胺}、 4-二苯呋喃 -2q>-基-4-肟基-丁酸、[4- (4cp-聯(lián)苯)-4-肟基-丁酸]、{ ( 3R ) - ( + ) -[2-(4-曱氧基苯磺酰)-1，2,3，4-四氫異喹啉-3-異羥肟酸鹽]}、 { (3S) —(_) —[2— (4-曱氧基苯磺酰)-1,2,3,4-四氫異喹啉3-異羥肟酸酯])、 [N-羥基—1- (4-甲氧苯基)磺酰-4- (4-二苯羰基)哌嗪-2-羧酰胺]、 [N-羥基-l— (4-曱氧苯基)磺酰-4千氧羰基哌嗪-2-羧酰胺]、(1,10-二氮菲一水合物)、馬馬司他、普啉司他、坦諾司他、新伐司他、唑 來膦酸或其組合。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述抑制劑是al-抗胰蛋白酶、a1-抗 胰凝乳蛋白酶、a2-抗血纖維蛋白酶(在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，其為 纖維蛋白溶解作用的抑制劑)、抗纖維蛋白酶(在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，其為血液凝固抑制劑，特別是因子X、因子IX和凝血酵素)、 補(bǔ)體1抑制劑、神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑(Neuroserpin，在一個(gè)具 體實(shí)施方式中，其在一些家族形式的癡呆中發(fā)生突變)、纖溶酶原 激活劑抑制劑1和2 (在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，其為纖維蛋白溶解 作用抑制劑)、蛋白Z相關(guān)的蛋白酶抑制劑(ZPI,在一個(gè)具體實(shí)施 方式中是滅活因子Xa和因子XIa)或其組合。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是亮肽酶素、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟化氫氯化物(AEBSF)、抑酞酶、抑糜酶素、 抗纖維蛋白酶m、 3,4-二氯異香豆素、L-1-氯-3-[4-曱苯磺酰基-氨 基]-7-氨基-2-庚酮-HCl(TLCK)、 TPCK、氟磷酸異丙酉旨(DIFP)、抗痛 素、4-脒基苯曱基磺酰-氟-HCl(APMSF)、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)、 3，4-二氯異香豆素(DCI)、 a-對(duì)曱苯碌酰氟、BB94、 a2-巨球蛋白或 其組合。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是EDTA、釩、鉬 酸鹽、1,10-二氮菲、磷酸阿米酮、抑氨肽酶素、抑氨肽酶素b、放 線酰胺素、抑二肽素、BB94、 a2-巨5束蛋白或其組合。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是N -己基順丁烯二 酰亞胺、亮肽酶素、L-反式環(huán)氧-琥珀酰-亮氨酰-氨基-(4-胍基)-丁烷 (E-64)、抑糜酶素、抗痛素、a2-巨球蛋白、PMSF、 PEFABLOC或
其組合。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是胃蛋白酶抑制劑 A、 a2-巨球蛋白、或其組合。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述蛋白 酶抑制劑是BB94或巴馬司他，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，其為絲氨 酸或金屬蛋白酶抑制劑。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述蛋白酶抑制 劑是可逆的，而在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述蛋白酶抑制劑是不 可逆的。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述細(xì)胞可以用PKC抑制劑進(jìn)行 接觸，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，其為沙芬戈(L-蘇-二氫(神經(jīng))鞘氨 醇)、Ro-l、 Ro32-0432 (雙吲咮馬來酰亞胺4又胺)、UCN-01 ( 7-OH-十字孢石威)、Flavopiridol (L86-8275,—種黃酮類抗癌新藥)、苔蘚抑 素l(大環(huán)內(nèi)酯)、雙吲咮馬來酰亞胺I、 InSolutionTM雙吲哚馬來酰
亞胺i、氫氯^f匕物、乂又吲p呆馬來酰亞胺n、 ^又吲。朱馬來酰亞胺m、
氫氯化物、雙吲。朵馬來酰亞胺抑制劑Set、雙吲"呆馬來酰亞胺IV、雙 口引咮馬來酰亞胺V、 4丐感光蛋白C、支孢樣支孢霉(C/"Jo^o〃'ww c/"A入s7^r/o/We力、心月莊毒素、黑頸目艮4竟蟲它(A^/a w'gr/co〃&)、氯4匕 白屈菜紅石咸、地J奎氯4妄、逆'沒食子酸、二7K4匕物、G6976、 InSolutionTMG6976、 G6983 、 G7874 、氬IU匕物、H-7 、氟安定、Iso-H-7 、 氟安定、HBDDE、 Hispidin、金絲沖兆蒽酮、K-252a、 i若卡(氏)土i裏 菌屬0Vo"〃'^7o戸/s w.)、 InSolution K-252a、諾卡(氏)土i裏菌屬 (;Vocora7o戸:v平)、K-252b、 諾卡(氏)土壤菌屬(iVoc"Wo戸's 5"/ .)、K-252c、 *奪毒素、NGIC-I、才艮皮素、云杉鞣酚、PKCbn/EGFR抑 制劑、星孑包菌素(staurosprorine )、 N-苯甲酰PKCb抑制劑、石克酸多 粘菌素B、蛋白激酶C抑制劑20-28、細(xì)胞可滲透的、豆蔻?；?蛋白激酶C抑制劑肽19-31、蛋白激酶C抑制劑肽19-36、蛋白激 酶C抑制劑組合、蛋白激酶C抑制劑、EGF-R片段651-658、豆蔻 酰化、蛋白激酶Ce易位抑制劑肽、蛋白激酶Ce易位抑制劑肽、陰 性對(duì)照、蛋白激酶Cz假底物抑制劑肽、蛋白激酶C,假底物抑制劑 肽、豆蔻?；?、蛋白激酶Ch假底物抑制劑肽、豆蔻?；⒌鞍准っ?br> Cq假底物抑制劑肽、蛋白激酶Cq假底物抑制劑肽、豆蔻?；?、假
金絲氺兆素、Ro 31—7549, 固定的，Ro-31—7549、 Ro-31—8220、 InSolutionTMRo-31-8220、 Ro-31-8425、 Ro-32-0432、楸毒素、沙芬 戈、桑吉瓦霉素、Scytonemin (—種色素)、4木氏〉菜(Lj^ gZ^" )、 絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑組合、D-紅-神經(jīng)鞘氨醇、二氫、D-紅-神 經(jīng)鞘氨醇、自由堿基、牛腦、D-紅-神經(jīng)鞘氨醇、自由堿基、高純度、 D-紅—神經(jīng)鞘氨醇、N,N-二甲基-、星孑包菌素(staurosprorine )、 4連霉 菌屬OSfm/〕to",)nv ,v/9.)、枸櫞酸他莫昔芬、他莫昔芬、4-羥基-、(Z- )、 TER14687、琥珀酸維生素E或者能夠抑制蛋白激酶C表達(dá)的反義 核香酸。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶 和彈性蛋白酵。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，半胱氨酸蛋白酶包括木瓜 蛋白酶、4丐蛋白酶和溶酶體組織蛋白酶。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中， 門冬氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶和凝乳酶。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中， 金屬蛋白酶包括嗜熱菌蛋白酶和羧肽酶A。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，#4居本發(fā)明所述的組合物和/或方法可 以包含4吏用如本文所述抑制劑的4壬何組合。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，還可以用Tcfl蛋白或編碼所述Tcfl 蛋白的核酸接觸所述細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述Tcfl蛋白可以具有氨基酸序列，
其同源于或就是NCBI，s基因庫中列出的序列，登陸號(hào)CAI59577、 P15257、 P22361、 P20823、 NP—033353、 NP—036801、 NP—739570 或NP 000536。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種增加胰腺f3細(xì)胞 質(zhì)量的方法，該方法包括用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑接觸卩細(xì)胞 或可經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺卩細(xì)胞的細(xì)月包，其中所述細(xì)胞表達(dá)或經(jīng)可誘導(dǎo) 表達(dá)TMEM27,并提供利于P細(xì)胞增殖的條件。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種改變患者體內(nèi)新 陳代謝的方法，所述方法包含用絲氨酸或金屬蛋白酶抑制劑接觸胰 月泉(3細(xì)胞或可經(jīng)i秀導(dǎo)變成月夷腺(3纟田月包的纟田月包，其中所述細(xì)胞表達(dá)或 可經(jīng)i秀導(dǎo)表達(dá)TMEM27。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種抑制、遏制或治 療患者#唐尿病的方法，所述方法包4舌用TMEM27多月太或編碼所迷 TMEM27多肽的核酸接觸細(xì)胞，所述細(xì)胞是胰腺卩細(xì)胞或者所述細(xì) 胞可以經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺(3細(xì)月包。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種抑制、遏制或治 療患者糖尿病的方法，所述方法包括用一種蛋白酶抑制劑(用絲氨 酸或金屬蛋白酶抑制劑)接觸胰腺|(zhì)3細(xì)胞或可經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺P細(xì) 月包的細(xì)月包，其中所述細(xì)月包表達(dá)或可經(jīng)i秀導(dǎo)表達(dá)TMEM27。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，"治療"既指治療性療法又指預(yù)防性 才晉施，其中目標(biāo)是預(yù)防或減輕如上文中所描述的輩巴病理疾患或病 癥。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，治療可以包4舌遏制、抑制、預(yù) 防、治療或其組合。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，"治療"指的 尤其是增加時(shí)間以持續(xù)進(jìn)展、加快緩解、i秀導(dǎo)緩解、促進(jìn)緩解、加快恢復(fù)、增加替代治療的效果或降低對(duì)替代治療的耐受性，或其組 合。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，"遏制"或"抑制"指的尤其是延緩 癥狀出現(xiàn)、預(yù)防疾病復(fù)發(fā)、減少復(fù)發(fā)發(fā)作的次數(shù)或頻率、延長癥狀 性發(fā)作之間的潛伏期、降低癥狀的嚴(yán)重程度、降低急性發(fā)作的嚴(yán)重 程度、減少癥狀的數(shù)目、減少疾病相關(guān)癥狀的發(fā)生率、減少癥狀潛 伏期、緩解癥狀、減少繼發(fā)癥狀、減少繼發(fā)感染、延長患者存活期， 或其組合。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，癥狀是原發(fā)的，而在另一個(gè)具體實(shí)施 方式中，癥狀是繼發(fā)的。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，"原發(fā)"指的是 作為糖尿病直接結(jié)果的癥狀，而在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，"繼發(fā)"
實(shí)施方式中，用于本發(fā)明中的化合物治療原發(fā)或繼發(fā)癥狀或者與糖 尿病相關(guān)的繼發(fā)并發(fā)癥。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，"癥狀"可以是疾病或病理狀態(tài)的 任何臨床表現(xiàn)，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，其是糖尿病，包括尿頻、 過度口渴、劇烈饑餓、不尋常體重減輕、疲勞加重、易激惹、視力 模糊、低胰島素水平、高血糖或高尿糖水平，或者其組合。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，術(shù)語"糖尿病"指的是一種原發(fā)性的 哺乳動(dòng)物患者的疾病，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中是指繼發(fā)性糖
尿病，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中是指1型NIDDM-暫時(shí)，或者 在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中是指1型IDDM,或者在另一個(gè)具體實(shí)施 方式中是指2型IDDM-暫時(shí)，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中是指2 型NIDDM,或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中是指2型MODY，其表 i見可能^口在Harrison's Internal Medicine, 14th ed. 1998中所述的。
才艮據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，且在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述患者 是胰島素抵抗的，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述患者是低胰島素血癥型。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述患者易患糖尿病。在
另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述患者患有青春晚期^f唐尿病(MODY)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，作為組合治療的一部分，沖艮據(jù)本發(fā) 明所述的方法可以進(jìn) 一 步包括將其他糖尿病藥劑纟會(huì)予所述患者的 步驟。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述糖尿病藥劑可以包括磺酰脲類、
瘦素(leptin,來普汀)、氯茴苯酸、雙胍、噢哇烷二酮類、a-糖苷 酶抑制劑或其組合。
在另 一個(gè)具體實(shí)施方式
中，才艮據(jù)本發(fā)明所述的方法可以進(jìn)一步 包括給予患者GLP-1受體拮抗劑，或者在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中， 用GLP-1受體拮抗劑接觸患者體內(nèi)的細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述GLP-1拮抗劑可以包4舌天然存在的肽例如GLP-1 、 exendin-3 和exendin-4(見例如美國專利第5,424,286號(hào);美國專利第5,705,483 號(hào)；美國專利第5,977,071號(hào)；美國專利第5,670,360號(hào)；美國專利第 5,614,492號(hào))、GLP-1類似、物或變異體(見例如美國專利第5,545,618 號(hào)和美國專利第5,981,488號(hào))和小分子類似物。GLP-1受體拮抗 劑可以如美國專利第5,981, 488號(hào)中所述一企測(cè)其活性。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法可以進(jìn)一步 包括PDX-1或PYY,或者編碼PDX-1或PYY的核酸。
應(yīng)該理解本文中描述的關(guān)于本發(fā)明所述細(xì)胞、組合物、多肽、 沖亥酸或載體的4壬<可具體實(shí)施方式
，均可以用于本發(fā)明所述的方法 中，均可認(rèn)為是本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明^是供一種估計(jì)患者體內(nèi)月夷島質(zhì) 量的方法，所述方法包4舌確定所述患者血清中TMEM27濃度的步 驟以及將該濃度與對(duì)照濃度進(jìn)行比較的步驟。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種用于估計(jì)高胰島素 血癥、血內(nèi)力夷島素不足、糖尿病或?qū)τ糜谏鲜霾“Y治療的療法的反
應(yīng)的診斷工具和/或方法。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，TMEM27作為 生物標(biāo)記物，其在特定體液(例如在血清、血漿或尿中)中的濃度 是高胰島素血癥、血內(nèi)胰島素不足或明顯(frank)糖尿病的函凄史。 在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，TMEM27的分泌形式是生物標(biāo)記物。才艮據(jù) 本發(fā)明的這個(gè)方面，且在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，診斷方法可以是通 過標(biāo)準(zhǔn);險(xiǎn)測(cè)法例如ELISA試驗(yàn)確定TMEM27蛋白或其片段、分泌 形式的水平。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，疾病嚴(yán)重性作為多肽表達(dá)的 函凌t而i貪斷。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，多肽表達(dá)的變化，無i侖是 蛋白質(zhì)還是RNA水平，可以是(在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中)對(duì)治 療(例如本文中提供的治療方法)反應(yīng)的函數(shù)。在另一個(gè)具體實(shí)施 方式中，表達(dá)的相對(duì)變化可以作為本發(fā)明所述核酸或載體遞送的函 數(shù)，其可以代表本發(fā)明的一種療法。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā) 明所述的方法可以利用本發(fā)明的抗體或抗體片段、或者包含該抗體 或抗體片段的組合物。 一種含有本發(fā)明所述抗體、核酸、載體、細(xì) 胞和/或組合物的試劑盒也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供一種用于鑒定與 TMEM27蛋白或其分泌形式相互作用的蛋白的方法，所述方法包含 一個(gè)步驟，即在足以促進(jìn)所述多肽與所述感興趣分子之間特異性相 互作用的條件下，用感興趣分子接觸TMEM27多肽一段時(shí)間以及 鑒定所述感興趣分子。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，TMEM27可以作為;敫素發(fā)4軍作用，一 個(gè)相互作用蛋白可以包含對(duì)激素發(fā)生反應(yīng)的未鑒定受體。在一個(gè)具 體實(shí)施方式中，所述相互作用蛋白可以包含與患者體內(nèi)新陳代謝途 徑有關(guān)的已知受體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，這些篩查方法在本々頁i或中是/>知的， 且可以包含在用于凝月交電泳的變性和非變性條件下、利用化學(xué)交聯(lián): 劑或其他分子方法例如利用酵母2雜交系統(tǒng)時(shí)，直4妄或間4妻-泮估例 如兩種分析之間的相互作用。
應(yīng)該J里解，確定本發(fā)明所述TMEM27蛋白的相互作用蛋白的 4壬何方法均可以實(shí)現(xiàn)，JU人為是本發(fā)明的一部分，包括鑒定相互作 用蛋白以及在本文描述的條件下鑒定這個(gè)相互作用蛋白的作用，例 如積極的新陳代謝效應(yīng)，例如其對(duì)于增強(qiáng)力夷腺(3細(xì)月包質(zhì)量的效應(yīng)， 或在另一種具體實(shí)施方式
中，有害的新陳^^射效應(yīng)，例如形成高減— 島素血癥。
4妄下來將纟是供材庫+、方法和實(shí)施例用于舉例說明目的，作為實(shí) 施本發(fā)明的方式，而非出于限制的目的。
實(shí)施例
材料和方法
動(dòng)浙
所有的動(dòng)物才莫型均在動(dòng)物研究中心實(shí)馬全室(Laboratory of Animal Research Center, LARC, Rockefeller大學(xué)的一個(gè)無病原體 動(dòng)物實(shí)-驗(yàn)室)中飼養(yǎng)。所述動(dòng)物均維持12小時(shí)的明/暗周期并用標(biāo) 準(zhǔn)的嚙齒類動(dòng)物食物飼養(yǎng)。在從3周齡的小鼠分離的DNA上通過 PCR進(jìn)4亍突變小鼠的基因型測(cè)定。
戎氛-
對(duì)兩種肽抗-Col-3:VQSAIRKNRNRINSAFFLD ( SEQ ID NO: 1 )和抗-Col-4:GIPCDPLDMKGGHINDGFLT ( SEQ ID NO: 2 )進(jìn)行合成并加工至純度>90%，軛合于KLH，用于兔的免疫(Betyl實(shí) 一驗(yàn)室，得克薩-斤)。將4元血清進(jìn)4亍親和力純4匕并通過western印i己和 免疫組織化進(jìn)行檢測(cè)。親和力純化抗血清用于所有研究。其他用于 免疫印記和免疫組織化的抗體從下列來源獲得抗胰島素(Linco)、 抗月夷高血灃唐素(Linco)、抗-V5 (Invitrogen )、羅丹明紅輒合的驢抗 幾內(nèi)亞豬(Jackson實(shí)-驗(yàn)室)、愛力生(Alexa)488驢#元兔(Molecular Probes )。
雄賴
將MIN6細(xì)月包用含有25 mM葡萄并唐、15%胎牛血清和5.5 mM 的2-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。INS-1細(xì)胞用含有25 mM 葡萄if唐、5%月臺(tái)牛血清禾口 10 mM Hepes pH7.4的RPMI 1640進(jìn)4亍i咅 養(yǎng)。將HepG2細(xì)胞用含有25 mM葡萄沖唐、10%胎牛血清的DMEM
培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
摔^辟糴一資^素錄為v,
在瞬時(shí)4爭染中，用于HepG2纟田月包的Fugene i式齊'J ( Roche )以及 用于MIN6纟田月包的Lipofectamine 2000(Invitrogen)才艮才居生產(chǎn)商的沖旨導(dǎo) 而〈吏用。每個(gè)35 mm平皿中加入0.5 pg的螢光素酶寺艮告子構(gòu)建體、 表達(dá)載體和CMV-LacZ。通過相應(yīng)的p半乳糖苷酶活性對(duì)螢光素酶 的專爭染歲文率進(jìn)4亍才示〉隹4匕[AlamJ"Cook, J丄.Reporter genes: Application to the study of mammalian gene transcription. Anal. Biochem. 188:245-254,1990]。
為了得到螢光素酶構(gòu)建體，將815 bp的啟動(dòng)子區(qū)域克隆于螢光 素酶啟動(dòng)子的上游，與Tcfl表達(dá)載體共表達(dá)。TMEM27啟動(dòng)子序列(小鼠)如下
atgtcattgcacccaa[gactttaacgctcagtecttggataccccacatgtgagacggttgtaaccactgtaaggatllgagaaataatcagggagcctagc
tcacagtaagtagttcttagtcattgtlaaatagttgcgctgaacaatgttgtcactagcactgtgtagcaacttaactaaatgacaggUcttagcagttctagc
cccttUaaagggttagcattcatttcU[Xtagtggcaccagga(;agag〔:actg〖tcagggaaggtatcaccatcaccatcaccatcaccatcgtcatcacc
atcaccatcgtcatcacccaatgatcatc:at〔:tccagcgtgaggctUatatcattaatgttgagttUagac;agtagccagatcttagagtttaaccmgccatc
ctctagttgggaattgttaaccaaccaacagtcUggaagLcUgttccctttactctccagaggtgaaaaaggagttataUtgtUcctaagt'd培gtagcctg
lctt[giiatcagattggtt'堪t;ctgiiaagggcacaaagatta^ccaaagaaaactccatgc〖ctccacgtttagcUiiaccaaacaactaciiggaggcagg
tgggaggcUGtgattgtgtcagetcaggaaacaUcUatgaggtagagutgaggaagaaoxaciaacagcttctcaaatagaUUCgtaaataactga
caggggatgg(tcgcttctatggacgmttaaecx^aclga[gggcgumttattaaaccttttagatggtggctcgctgattt (SEQ JD NO: 17),
此外，TMEM27啟動(dòng)子的Tcfl位點(diǎn)選擇性突變，分別稱為Ml 禾口M2啟^力子序列，如下
TMEM27-M1啟^力子序歹'J (小鼠)
atgtcattgcacccaatgacUtaacgctcagtccttggataccccacatgigagacggttgtaaccactgtaaggaUtgagaaataatcagggagcctagc tcacagtaagtagttcttagtcattgttaaatagt(:gcgctgaacaatgttgtcactagcactgLgUigcaa(:ttaactaaatgacaggUctl;agcagUctagc cccttUaaagggUagcattcatUcttcctagtggcaccagg:icagagcactgttcagggaaggtatcaccatcaccatcac;catcaccatcgtcatcacc atcacuaLcgtcatcacxcaatgatLiatcaLctccagcgtgaggcUtatatcaUaatgttgagtUtagacagtagccagatcUagagtttaacctagccatc
tctUgaatcagattggttagcctgaaagggcacaaagattatgccatiagaaaactccatgctctcc'dCgUtagctoaccaaacaactiicaggagg"腿 CgggaggcttctgaUgtgtcagctcaggaaacattcUatgaggtagagtUgaggaagaacccactaacctgcttctcaaatagattttcgtaa'jLtaacact gaggggatggttcgcU"'dtggiiegtiau'dtxca'dc:igiUgggcgUaaUauaaaccUUagatggtggctcgctgattt (SEQ R) NO: 18)
TMEM27-M2啟動(dòng)子序列(小鼠)
atgtcaUgcacccaatgactttaacgctcagtccUggataccccacatgtgagacggUgtaaccactgtaaggatttgagaatUaatcagggagccmgc
cccUtmaagggUagcattcaUtc[tcctagtggcaccaggacagagcaclgf.U:agggaaggta[caccatcaccat:caccatcaccatcglcatcacc atcaccatcgtcatcacccaatgatcatcatctceagcgtgaggcutatatcattaatgttgagmtagacagtagccagatcttagagtttaacctagccatc ctctagttgggaattgttaaccaaccaacagtctaggaagtcUgttccctttactctccagaggtgaaaaaggagUatatttgtttcctaagtatggtagcctg tctttgaatcagattggttagcctgaaagggcacaaagaUatgccaaagaaaactccatgctctccacgtttagcttaaccaaacaactecaggaggciigg tgggaggcttGtgattgtgtcagctcaggciaacattcttatgaggt'dgagtttgaggaagaacccaaaiuxtgcUctcaa'cUagauticgtaaataactga caggggatggttcgcttctatggacgta"aacccaaclgatgggccaatattaLLaaaa:ttttagatggtggctcgctga[tt (SEQ ID NO: 19).細(xì)應(yīng)襲席浙中的蛋冷Jt^
當(dāng)MIN6細(xì)月包在6孑L—反中生長至90%融合時(shí)，收集MIN6細(xì)月包 并重懸于反應(yīng)緩沖液和試劑中，體積50pl， 4。C孵育2小時(shí)。通過 加入50 niM Tris pH 7.4置于冰上10分鐘而終止反應(yīng)。然后用PBS 洗滌細(xì)胞，并在蛋白酶抑制劑存在的情況下在RIPA緩沖液中4°C 裂解15分鐘。細(xì)胞裂解物以10,000 xg離心5分鐘，對(duì)上清進(jìn)行還 原和非還原的SDS-PAGE隨后進(jìn)4于免疫印跡。交耳關(guān)試劑和緩沖液 BMH( Pierce )〉容解于DMSO中，并在PBS中孵育，而DTBP( Pierce ) 5容角竿于水中，并在0.2M三乙醇胺(pH 8.0)中孵育。
W-4^差化的抻刺^^雄勿
將表達(dá)pV5-TMEM27的MIN6細(xì)胞用溶解于DMSO的指定濃 度的衣霉素(Sigma)以及單獨(dú)的DMSO在37。C孵育12小時(shí)。隨后 細(xì)月包裂解物進(jìn)行SDS-PAGE并用抗V5抗體進(jìn)行免疫印跡。
用重組酶N耳關(guān)聚#唐酶(Prozyme,San Leandro， CA )將完整的N 聯(lián)聚糖從TMEM27的分泌部分除去。MIN6細(xì)胞和胰島的上清在 20 mM石粦酸鈉pH 7.5 、 0.1 %SDS和50 mM的|3-巰基乙醇中通過100 。C加熱5分鐘而變性。將NP-40加至終濃度0.75%,將反應(yīng)混合物 與N聯(lián)聚糖酶37。C孵育3小時(shí)。
電泳if移,艾動(dòng)為N^TEM5^)和染^^"名瘦共沉淀("C7///^
在結(jié)合纟爰沖液(20 mM Hepes pH7.9、 150 mM NaCl、 1 mM DTT ) 中，對(duì)10 fig總細(xì)胞提取物進(jìn)行EMSA分析?？偧?xì)胞^是取物與32P 標(biāo)記的雙鏈寡核香酸探針一起孵育，所述探針在TMEM27啟動(dòng)子 上含有野生型或突變型HNF-1結(jié)合位點(diǎn)(序歹'J分別為 5'-GGAGATTTTCGTAAATAACTGACA-3，(SEQIDNO: 3)、5，-GGGCGTTAATTATTAAACCTTTTA-3,(SEQ ID NO:4) 和 5，-GGGCAGAGATTATTAAACCTTTTA-3，(SEQ ID NO:5))。利用抗 Tcf-1抗體(Geneka Biotechnology Inc., Montreal, Canada )實(shí)施抗體 月交移動(dòng)(supershift )。利用來自C57/B6小鼠或MIN6細(xì)胞的分離的 原^肝細(xì)月包和CMP分才斤試劑盒(Upstate Cell Signaling Solutions, Lake Placid, NY)， 4姿照生產(chǎn)商的流程進(jìn)4亍ChIP分析。Tcfl與抗 HNF—la 4元體一起;咒;定，且DNA矛j用引4勿x禾口 y (序歹寸 5，-ACAGGAGGCAGGTGGGAGGCTTCT-3， ) (SEQ ID NO:6)和 (5，-CCCGGATTAGGGTATCGGAGAA-3， ) (SEQ ID NO:7)來擴(kuò) 增。用于apoM的引物是5，-GGGCTCAGCTTTCCTCCTA-3' (SEQ ID NO:8)和5,-CTCCGCCTTAACTGTTCTCTGATG-3' (SEQ ID NO:9)。
,悉細(xì)應(yīng)炎取浙浙備
MIN6纟田月包在150 mm組織i咅養(yǎng)皿中生長至90%融合。將纟田胞 在;水;令卻的PBS中;先';條一次，并刮進(jìn)3 ml PBS中。^!尋纟田月包4000 x g 離心4分鐘并重懸于2倍體積的高鹽提耳又緩沖液(400 mM KCl、 20 mM Tris pH 7.5 、 20%甘油、2 mM DTT、 1 x完全TM蛋白酶4中制 劑(Boehringer Mannheim )禾口 20 jag/ml 4中敞酵)中。纟田月包裂角罕通過 凍融而實(shí)現(xiàn)，通過16,000 xg于4。C離心10分鐘而除去細(xì)月包石卒片。
浚素辦定
利用酸乙醇(10%冰醋酸溶于無水乙醇中)從胰腺中4是取胰島 素和胰高血糖素，聲波處理10分鐘、12,000 x g于4°C離心2次， 每次10分鐘。收集上清并儲(chǔ)存于-20。C以便通過每文感的胰島素或胰 高血4唐素RIA試劑盒(Linco Research )測(cè)定月夷島素。應(yīng)^和及7VJ的》岸
胰島從6-8周齡的小鼠上分離。我們利用膠原酶消化并通過葡 聚糖梯度進(jìn)行差速離心。隨后利用TRIzol試劑(Gibco-BRL )根據(jù) 生產(chǎn)商的il明才是耳又總RNA。污染的基因組DNA才艮據(jù)每5 jil的RNA 利用 1 (il無RNA酶的DNase- I (即，月夷脫氧核辟唐核酸酶) (Boehringer )而除去。
腐房形在承y定法
將胰腺在低聚曱醛中固定，并如上所示進(jìn)行胰島素和胰高血糖 素的染色。切耳又貫穿整個(gè)月夷^ll的切片(7 pm)，每第六張切片用作 形態(tài)學(xué)分析。利用共聚焦激光掃描顯^H竟(Zeiss LSM 510, Germany)掃描至少288張不重疊的圖^象H象素尺寸為0.88 pm )。 在本研究中測(cè)定的參凄t利用Metamorph衫d牛包(Universal Imaging Corporation,PA )中的整合的形態(tài)學(xué)測(cè)定分析工具進(jìn)4亍測(cè)定。由用胰 島素或胰高血糖素染色的細(xì)胞所覆蓋的區(qū)域可利用大小大于3倍像 素的著色物體進(jìn)行整合。
利用TRIZOL試劑(Invitrogen )沖是耳又總RNA,并用5U無RNA 酶的DNase- I ( Ambion )處5里10 |ig的RNA。利用Moloney白血 病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，用dNTP和隨一幾六聚體引物(Invitrogen)合成 cDNA。 如前所述，在[a-32p]dCTP和Taq聚合酶存在的情況下， cDNA 4是供利用特異引物的PCR的才莫4反[Shih DQ, Screenan S， Munoz KN， Philipson L, Pontoglio M， Yaniv M， Polonsky KS， Stoffel M. (2001) Loss of HNF-1 alpha function in mice leads to abnormal expression of genes involved in pancreatic islet development and metabolism. Diabetes 50:2472-80]。A瘦伊跡^k^建iff織^;夢(mèng)
用SDS-PAGE (4-15%)分離細(xì)胞溶質(zhì)蛋白提耳又物并利用電印 跡將其轉(zhuǎn)移至硝基纖維膜(Schleicher & Schuell)上；用抗CoB和 抗Col4血清(1: 500 ) 4企測(cè)TMEM27。將膜與第一抗體于4。C孵 育過夜。含第二抗體的孵育液置于室溫1小時(shí)。通過從樣品緩沖液 中去除DTT而實(shí)施非還原的SDS-PAGE。
^夸MIN6細(xì)月包鋪于涂4隻載i皮片(Nalge Nunc Int.)上，并用4% 的低聚甲醛于4°C固定20分鐘。載玻片在含3%正常驢血清的0.01% 急香/PBS中室溫孵育30分鐘，加入抗Co13和抗Co14 (1: 20 )后，
4。C過夜。加入第二抗體后，置于室溫30分鐘。
將胰腺于4%低聚甲醛中4。C固定4小時(shí)，并在石蠟中包埋。切 取7)am切片，脫蠟后，通過將載玻片在0.01M枸櫞酸鈉pH6.0進(jìn) 4亍樣i波處理而暴露抗原。將切片在0.1%Triton-X-100中進(jìn)4亍透化處 理，并在3。/。正常驢血清/PBS中孵育30分鐘。如上，染色完成。
將Min6纟田月包在4%低聚甲醛和0.02。/o戊二醛/0.1M 二砷酸鹽緩 沖液pH7.4中固定2小時(shí)。所述細(xì)胞用PBS進(jìn)行洗滌并在10%明膠 中包埋，如上再次固定。細(xì)胞沉淀利用2.3M蔗糖J容液在PBS中進(jìn) 行冷凍保護(hù)，并將樣品儲(chǔ)存于液氮中直至4吏用(Tokuyasu, K.T. 1973. J. Cell. Bio. 57-551-565 )。在Reichert-Jung FC-4E ;水凍超薄切片沖幾中 利用玻璃刀切耳又冷凍超薄切片。切片在聚乙烯醇縮曱醛-石友 (Formvar-carbon )包謬皮的4臬才各上收集，用1%的BSA-PBS封閉并 用4元Co14 (1: 10稀釋'液)孵育。用PBS洗滌2次，每次15分4中 而終止孵育。隨后將切片與羊抗兔IgG—起孵育，所述IgG4厄合于 10 nm金顆粒(Amersham Life Science, Arlington Heights, IL )。對(duì)所述4臬才各進(jìn)4亍力口工處玉里并"l要照Griffiths et al. 1983. Methods Enzymol. 96:466-485進(jìn)行染色。
腐夯滲入^:
將[3H]胸苦摻入在24孑L培養(yǎng)才反(5 x io4纟田月包/孑L )中如下進(jìn)行 分析。電穿孔后48小時(shí),將細(xì)胞在生長抑制培養(yǎng)基(0.5%FCS)中 孵育24小時(shí)，隨后在正常生長培養(yǎng)基中再孵育24小時(shí)。在所述孵 育過程的最后4個(gè)小時(shí)，加入0.25 pCi/孔的[3H]曱基胸苷(Perkin Elmer )。孵育完成后，將細(xì)胞用冰預(yù)冷的PBS沖洗2次，并與10% 三氯醋酸(TCA)于)水上孵育20分4中。用10。/oTCA洗滌后，將細(xì) 胞在0.2M NaOH/1% SDS中室溫溶解10分鐘。TCA不溶性物質(zhì)用 0.2MHC1中和，并用液體閃爍計(jì)凄t器確定其反射性。
/ 崩f擾
人工siRNA由Dharmacon Research(Lafayette， CO)合成。siRNA 4十只于小鼠TMEM27 (NM一020626 )、 PCI/3 (NM_013628 )、 PC2 (NM_008792 )、 弗林蛋白酶(NM_011046 )和羧肽酶E (NM—013494 )序列而i殳計(jì)。將3 pg每一種siRNA/1 x 106細(xì)月包電 穿孑L入MIN6纟田月包內(nèi)。
銃奸分浙
結(jié)果以均值土SD給出。利用學(xué)生氏t檢驗(yàn)實(shí)施統(tǒng)計(jì)分析，在 0.05的7jc平才巨纟色零々支i殳。
實(shí)施例1:
Tcfl調(diào)控一種新蛋白在4^ P細(xì)胞中的表達(dá)為了鑒定胰腺P細(xì)胞中的促有絲分裂因子，利用Affymetrix 寡核苦酸表達(dá)試驗(yàn)比較分離的Tcf 1 ;野生型同胞小鼠胰島中的基因 表達(dá)。該試驗(yàn)鑒定出一種編碼經(jīng)膜^爭膜蛋白(TMEM27)的基因， 其表現(xiàn)出Tcfr 、鼠的表達(dá)水平相比于對(duì)照降低了 16倍。該結(jié)果在 獨(dú)立組動(dòng)物中通過RT-PCR得到了確認(rèn)(圖la)。為了研究Tcfl是 否為TMEM27轉(zhuǎn)錄的直4妄激活劑，對(duì)TMEM27啟動(dòng)子進(jìn)4亍了分才斤， 在其調(diào)控區(qū)鑒定了兩種保守的高親和力結(jié)合位點(diǎn)(圖lb)。人類上 游調(diào)控區(qū)(SEQIDNO: 10 )和小鼠上游調(diào)控區(qū)(SEQ ID NO: 11) 包含Tcf結(jié)合位點(diǎn)，起始于在人類和小鼠分別為約-117至約-102 (SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13 )和-62至約-47 ( SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15)。
一夸815 bp的啟動(dòng)子區(qū);或(SEQ ID NO: 17)克隆于螢光素酶啟 動(dòng)子的上游，與Tcfl表達(dá)載體共表達(dá)。Tcfl與TMEM27啟動(dòng)子的 瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染引起螢光素酶活性5倍以上的激活(圖lc)。如果將
TMEM27啟動(dòng)子中的每一個(gè)Tcfl位點(diǎn)選l奪性突變，則轉(zhuǎn)錄激活作 用降低70-80%(圖lc)。凝膠電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)檢測(cè)DNA/ 蛋白復(fù)合物，該分析利用包含Tcf結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈32P標(biāo)記的寡核 芬酸和MIN6細(xì)胞提取物(圖ld)。通過利用未標(biāo)記寡核苷酸的竟 爭性分析以及進(jìn)一步利用特異性抗Tcfl抗血清變動(dòng)所述DNA- Tcfl 復(fù)合物，而確定結(jié)合于這些位點(diǎn)的蛋白的特異性(圖ld)。為了確 定Tcfl是否直4姿增加TMEM27的表達(dá)，進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀 (ChIP )。 Tcfl結(jié)合于MIN6細(xì)月包的TMEM27啟動(dòng)子中的結(jié)合4立點(diǎn)， 但在不表達(dá)TMEM27的肝細(xì)胞內(nèi)則無結(jié)合(圖le)。這些數(shù)據(jù)確定 了體內(nèi)Tcfl結(jié)合位點(diǎn)的功能性，表明Tcfl對(duì)于胰腺p纟田胞中 TMEM27的表達(dá)是必需的。
實(shí)施例2:
TMEM27表ii^月iM^發(fā)育過程中受到調(diào)控
4免疫組織化學(xué)分析表示了小鼠胰腺發(fā)育過程中的TMEM27表 達(dá)才莫式。在新生兒和成人月爽&泉中，TMEM27表達(dá)限于月夷島的p細(xì)月包。 在胰腺發(fā)育過程中，當(dāng)激素(主要是胰高血糖素陽性細(xì)胞)表現(xiàn)出 陽性時(shí)，TMEM27在最早期表達(dá)。在胚胎期的E11.5和E12.5， TMEM27表達(dá)位于表達(dá)月夷高血糖素和胰島素的細(xì)l包中。在內(nèi)分泌細(xì) 胞擴(kuò)充的高峰期(乂人胚月臺(tái)期13.5-18.5 )， TMEM27主要與月夷高血斗唐 素共存，直至出生前(E18.5 ),此時(shí)其在月夷島素陽性細(xì)胞內(nèi)也可才全 測(cè)到。在新生兒和成人胰腺中，在胰島a細(xì)胞內(nèi)不再能4僉測(cè)到 TMEM27,其表達(dá)局限于(3細(xì)胞(圖2 )。
實(shí)施例3:
TMEM27是一種N聯(lián)糖蛋白，在體內(nèi)形成二聚體
TMEM27包含兩種預(yù)測(cè)的N-糖基化位點(diǎn)，分別在氨基酸殘基 76和93。用衣霉素處理MIN6纟田月包，衣霉素抑制N-斗唐基化。細(xì)月包 在衣霉素濃度不斷增高的條件下孵育，制備蛋白提取物并用 SDS-PAGE和免疫印跡進(jìn)行分析。用衣霉素處理后，出現(xiàn)兩條帶的 電泳遷移率增大，而高分子量蛋白消失(圖3a)。該結(jié)果在體外分 析中利用N-聚糖酶得到確認(rèn)，N-聚糖酶是一種釋力t完整N聯(lián)聚糖-的酶。用Western印跡分才斤與該酶一起孵育的MIN6細(xì)月包才是耳又物， 表現(xiàn)出類似于衣霉素處理的結(jié)果(圖3b)。
進(jìn)4亍化學(xué)交耳關(guān)試-瞼，4企測(cè)TMEM27蛋白是否以多聚體存在。 MIN6細(xì)胞提取物在兩種不同交聯(lián)劑存在的情況下進(jìn)行孵育BMH (雙馬來酰亞胺己烷)，其是一種能透過力莫的不可切割的化合物， 以及DTBP (二甲基3-3，二硫代丙酸鹽)，其是一種能透過膜、可在 SDS-PAGE分析(在還原和非還原條件下實(shí)施)前^皮切割的化合物。 非還原western印跡出i見一條帶，正好為還原條4牛下western印跡中 TMEM蛋白分子量的二倍。用BMH處理的細(xì)胞拔—取物在還原和非還原印跡中均表現(xiàn)為二聚體蛋白。然而，在DTBP存在時(shí)，還原條 件下所述蛋白二聚體消失(圖3b)。該結(jié)果與內(nèi)源性表達(dá)TMEM27 的MIN6細(xì)月包以及由TMEM27表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的N2A細(xì)月包中的 結(jié)果類似(凄t據(jù)未示出)。
綜上，這些數(shù)據(jù)表明所述TMEM27蛋白是N-糖基化的，且以 二聚體存在。
實(shí)施例4:
TMEM27在月ili^ p細(xì)胞中力口工并從其分泌、
人們預(yù)測(cè)TMEM27是跨膜蛋白，具有N末端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。 分別生成了兩種由該蛋白細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域識(shí)別肽的抗體 (a陽Col-3和a-Col-4 )。在western印跡"i式馬全中，a-Col-4在MIN6纟田 胞的總細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到兩條帶(圖4a)。分子量較高的條帶對(duì) 應(yīng)于糖基化全長蛋白的預(yù)測(cè)分子量。較低條帶(-25 kD)也是特 異性的，因?yàn)槠淇梢栽谟帽磉_(dá)C末端V5 -Tag融合蛋白和抗V5抗 體的載體(p-TMEM27.V5-His )轉(zhuǎn)染后在細(xì)月包裂解物中用western 印跡4全測(cè)到(圖4b)。
為了確定該25 kD條帶是否^R表TMEM27切割形式的C末端 部分，以及/或者其是否,皮分泌的，用a-Co1-3抗體對(duì)來自不同細(xì)月包 系(包括神經(jīng)元N2A纟田月包、HepG2細(xì)月包、Hek293細(xì)月包和起源于腎 收集管并表現(xiàn)出TMEM27的內(nèi)源性表達(dá)的M-l細(xì)月包)的上清進(jìn)4亍 了檢測(cè)。將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)，利用a-Col-3通過 western印跡進(jìn)4亍才全測(cè)，在同源(3細(xì)月包系MIN6和INS1E中沖全測(cè)到 一條對(duì)應(yīng)于-25 kD蛋白的條帶(圖4c,數(shù)據(jù)未示出)。在與分離 的d、鼠胰島 一起孵育的培養(yǎng)基中也檢測(cè)到公認(rèn)的切割和分泌蛋白 (圖4d)。有趣的是，盡管細(xì)胞裂解物中強(qiáng)表達(dá)全長蛋白，在用TMEM27表達(dá)載體(p-TMEM27)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的非p細(xì)胞系的培養(yǎng)基 中，卻無法在western印跡分片斤中才企測(cè)到該條帶。
相反，在MIN6和INS1E細(xì)月包中過表達(dá)TMEM27導(dǎo)致各自i咅 養(yǎng)基中分泌蛋白的量增加。siRNA介導(dǎo)的TMEM27蛋白水平降4氐 與MIN6細(xì)胞上清中TMEM27的分泌形式水平下降有關(guān)系(圖4e )。 最后，為了無可辯駁的i正實(shí)TMEM27的N末端部分乂人P細(xì)月包切割 并分泌，構(gòu)建了 一個(gè)表達(dá)載體(pHA-TMEM27 )，其中在TMEM27 蛋白的氨基酸殘基39和40之間插入9個(gè)氨基酸的HA-抗原表位標(biāo) 簽，用該載體轉(zhuǎn)染的MIN6細(xì)胞分泌一種蛋白，可用抗HA抗體才全 測(cè)，大小類似于上清中的蛋白。該蛋白在^t照細(xì)月包或在表達(dá)未加標(biāo) 簽蛋白的細(xì)胞中未被4金測(cè)到(圖4f)。綜上，這些數(shù)據(jù)表明TMEM27 是一種p細(xì)胞特異的、切割的和分泌的^,月莫蛋白。
實(shí)施例5:
TMEM27定位于力夷島素分泌顆津立和細(xì)胞膜中
采用抗Col-3和抗Col--4抗體的免疫熒光研究表明TMEM27 定位于胰腺f3細(xì)胞中。將MIN6細(xì)胞在載玻片上培養(yǎng)、固定、透化 并用第一抗體處理?？稍诩?xì)胞膜上以及核周區(qū)室和粒子內(nèi)4全測(cè)到特 異性染色(圖5a)。該結(jié)果與TMEM27定位于胰島素分泌粒子內(nèi)以 及通過這些小嚢泡運(yùn)輸至細(xì)胞膜相一致。使用免疫金標(biāo)記的抗 Col-4抗體的電鏡研究表明TMEM27定位于胰島素分泌顆粒內(nèi)部 (圖5b)。納米金(nanogold)顆粒與細(xì)胞膜相連，與小嚢泡/膜融 合事件相鄰(圖5c),表明TMEM27是與月夷島素分泌顆粒共定位的 細(xì)胞膜蛋白。實(shí)施例6:
Ob/Ob胰島中TMEM27表達(dá)增加以;S^體夕卜0細(xì)胞復(fù)制增強(qiáng)
評(píng)估和aP2-Srebp-lc轉(zhuǎn)基因小鼠的肥大胰島中的 TMEM27表達(dá)，以確定相比于對(duì)照的相對(duì)表達(dá)。分離6-8周齡小鼠 的胰島，并與其野生型同胞小鼠胰島的基因表達(dá)水平加以比較。在 半定量RT-PCR分沖斤中，發(fā)現(xiàn)oZ7/W和aP2-Srebp-1 c胰島中TMEM27 水平相比于對(duì)照值分別增加2.1倍和1.7倍(圖6a和6b )。此夕卜， 相比于野生型同胞小鼠的大小匹配的胰島，來自oM Z)b和 a尸2-^SW^/ -化小鼠的胰島分泌入培養(yǎng)基中的已切割TMEM27顯著增 加(圖6c,數(shù)據(jù)未顯示)。為了確定TMEM27是否刺激胰腺(3細(xì)胞 復(fù)制，評(píng)估了 TMEM27表達(dá)對(duì)MIN6細(xì)月包復(fù)制的效應(yīng)。細(xì)月包用質(zhì) 粒pTMEM27或革巴向TMEM27的siRNA進(jìn)4亍電穿孔。纟田胞復(fù)制則 通過細(xì)胞計(jì)數(shù)及電穿孔后48h測(cè)定["H]胸苦4參入來評(píng)估(圖6d-g)。 相比于pcDNA3轉(zhuǎn)染的細(xì)月包，用pTMEM27轉(zhuǎn)染的MIN6細(xì)月包表現(xiàn) 為約5倍過表達(dá)，并在平板接種(plating)后48小時(shí)，表現(xiàn)出[3司 月匈芬4參入i曾力口約3 4咅，且纟田月包密度i曾力口(圖6e、 g)。 ^目反，在siRNA 處理后，蛋白質(zhì)表達(dá)降低的MIN6細(xì)胞表現(xiàn)出["H]胸苷4參入和細(xì)胞 密度的顯著降低(圖6d、 f)。此外，未觀察到細(xì)胞中的凋亡隨 TMEM27表達(dá)增高或降低而發(fā)生變化(數(shù)據(jù)未顯示)，表明其表達(dá) 不影響細(xì)月包死亡。這些結(jié)果表明TMEM27調(diào)節(jié)MIN6細(xì)月包中的細(xì) 月包增殖。
實(shí)施例7:
胰島中表達(dá)TMEM27的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為胰島肥大
胰腺(3細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)基因小鼠通過原核孩i注射載體構(gòu)建體而產(chǎn) 生，該構(gòu)建體中，鼠TMEM27 cDNA處于鼠胰島素啟動(dòng)子的控制之下。RT-PCR和免疫印跡分析表明相比于野生型同胞小鼠，轉(zhuǎn)基因 小鼠中TMEM27的表達(dá)增力口 4 4咅(圖7A)。通過月夷島形態(tài)測(cè)定學(xué) 研究8-12周齡轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胰島質(zhì)量。轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為"臭島形態(tài) 學(xué)正常(根據(jù)利用胰島素/胰高血糖素共染色的免疫組織化學(xué))，但 相比于野生型同胞小鼠，胰島質(zhì)量增加約2倍(圖7B和7C)。所 述胰島質(zhì)量的增加通過測(cè)定轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的總胰島素 含量而進(jìn)一步確證。在過表達(dá)TMEM27的轉(zhuǎn)基因小鼠中，總胰島 素含量也顯著增加(圖7D)?？崭购筒秃笱獫{葡萄糖和胰島素水平 在轉(zhuǎn)基因和對(duì)照小鼠中相似，表明轉(zhuǎn)基因小鼠中的胰腺卩細(xì)胞在葡 萄糖感應(yīng)方面并不具有4交大異常(^t據(jù)未顯示)。綜上，這些ft據(jù) 表明TMEM27在體內(nèi)調(diào)節(jié)胰島生長。
實(shí)施例8:
BB94抑制TMEM27脫落
胰腺(3細(xì)胞系MIN6用含有25 mM葡萄糖、15%胎牛血清和 5.5|iM 2-5克基乙醇的DMEM i咅養(yǎng)基進(jìn)4亍i咅養(yǎng)。將MIN6細(xì)月包以50% 融合鋪于12孔板中，脬育24小時(shí)。用OPTI-MEM (Invitrogen )洗 滌細(xì)胞，并用DMSO或蛋白酶抑制劑BB94 ( 1 jaM )在OPTI-MEM 中于37。C孵育15分鐘。上述孵育后，用DMSO、 PMA (Sigma P8139 )、 BB94或者PMA+BB94在OPTI-MEM中孵育2小時(shí)。每 一種上清均收集30 |il用于SDS-PAGE。用識(shí)別TMEM27 N末端(已 切害']部分)的抗TMEM27抗體實(shí)施免疫印跡(圖8)。利用抗V5 抗體(其識(shí)別TMEM27的C末端(細(xì)胞內(nèi))部分)的免疫印跡用 作對(duì)照，表明PMA和BB94不改變TMEM27的表達(dá)水平(圖8 )。 BB94 (而非PMA )降4氐TMEM27 N末端的表達(dá)水平(圖8 ), ^旦 不改變TMEM27 C末端的表達(dá)水平。因?yàn)锽B94是一種已知的絲氨 酸蛋白酶和金屬蛋白酶的抑制劑，這可以表明TMEM27是一種屬 于絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶家族的蛋白酶的底物。盡管本文中已經(jīng)舉例說明并描述了本發(fā)明的某些特征，對(duì)于本 領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員來說，還可以進(jìn)行多種變化、替代、改變和 等同。因此，應(yīng)該理解附加的^又利要求涵蓋所有這些落入本發(fā)明真 實(shí)精神的改變和變化。
權(quán)利要求
1. 一種分離的核酸，包含編碼TMEM27蛋白的基因的調(diào)控區(qū)，其中所述調(diào)控區(qū)包含至少一個(gè)對(duì)于Tcf1蛋白的高親和力結(jié)合位點(diǎn)。
2. 才艮據(jù)4又利要求1所述的分離核酸，其中所述調(diào)控區(qū)具有對(duì)應(yīng)于 或同源于SEQIDNO:10或11的沖亥酉臾序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離核酸，其中所述結(jié)合位點(diǎn)包含對(duì)應(yīng) 于或同源于SEQIDNO:12、 13、 14或15的核酸序列。
4. 一種細(xì)胞，包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是胰腺卩細(xì)胞。
6. —種載體，包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸。
7. —種分離的多肽，包含TMEM27蛋白的分泌形式，其中所述 多月太的大小為約25 kDa,且包含只寸應(yīng)于或同源于SEQ ID NO: 16 的序列的N末端片,史。
8. —種增加力夷&泉|3細(xì)月包質(zhì)量的方法，所述方法包4舌用TMEM27 多肽接觸胰腺p細(xì)胞或可經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺p細(xì)胞的細(xì)胞，并沖是 供有利于(3細(xì)力包增殖的條件。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中在體外或離體接觸所述細(xì)胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中在體內(nèi)接觸所述細(xì)胞。
11. 才艮據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞或者祖細(xì)胞。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)胞/人患糖尿病或易患 4唐尿病的患者中分離。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步包括將所述細(xì)胞給予所 述患者的步驟。
14. 才艮才居一又利要求13所述的方法，其中所述細(xì)月包為所述患者自體 的或同種異體的。
15. 才艮據(jù)^又利要求8所述的方法，其中所述TMEM27多肽包含全長蛋白或其片段。
16. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括用蛋白酶抑制劑接觸 所述細(xì)胞的步驟。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是絲氨 酸蛋白酶抑制劑或金屬蛋白酶抑制劑。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是BB94。
19. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括用Tcfl蛋白或編碼所 述Tcfl蛋白的核S菱^妄觸所述細(xì)胞的步驟。
20. —種增加胰腺(3細(xì)胞質(zhì)量的方法，所述方法包括用編碼 TMEM27多肽的核酸接觸胰腺卩細(xì)胞或可經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺(3細(xì) 月包的細(xì)胞，并提供有利于所述核酸表達(dá)的條件。
21. 才艮據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中在體外或離體接觸所述細(xì)胞。
22. 才艮據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中在體內(nèi)接觸所述細(xì)胞。
23. 才艮據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞從患糖尿病或易 患糖尿病的患者中分離。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，進(jìn)一步包括將所述細(xì)胞給予所述患者的步驟。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述細(xì)胞為所述患者自體 的或同種異體的。
27. 才艮據(jù)#又利要求20所述的方法，其中所述核酸編碼全長TMEM27 蛋白或其片段。
28. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括用蛋白酶抑制劑接 觸所述細(xì)胞的步驟。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是絲氨 酸蛋白酶抑制劑或金屬蛋白酶抑制劑。
30. 才艮據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是BB94。
31. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括用Tcfl蛋白或編碼所述Tcfl蛋白的核酸接觸所述細(xì)胞的步驟。
32. —種改變患者體內(nèi)新陳代謝的方法，所述方法包括用TMEM27 多肽或編碼所述TMEM27多肽的核酸4妻觸膽J^ (3細(xì)月包或可經(jīng) i秀導(dǎo)變成月夷&泉(3纟田月包的纟田萬包。
33. 才艮據(jù)^又利要求32所述的方法，其中在體外或離體4妻觸所述細(xì)胞。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中在體內(nèi)接觸所述細(xì)胞。
35. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
36. 才艮據(jù)4又利要求32所述的方法，其中所述細(xì)胞促進(jìn)所述患者體 內(nèi)的月夷島素分泌。
37. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述細(xì)胞從患糖尿病或易 患糖尿病的患者中分離，或給予患糖尿病或易患糖尿病的患 者，或其組合。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述細(xì)胞為所述患者自體 的或同種異體的。
39. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述TMEM27多肽是全長 TMEM27蛋白或其片4史。
40. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述核酸編碼全長TMEM27 蛋白或其片段。
41. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，進(jìn)一步包括用蛋白酶抑制劑接 觸所述細(xì)胞的步驟。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑或金屬蛋白酶抑制劑。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是BB94。
44. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，進(jìn)一步包4舌用Tcfl蛋白或編碼 所述Tcfl蛋白的核酸接觸所述細(xì)胞的步驟。
45. 才艮據(jù)一又利要求32所迷的方法，其中所述患者為胰島素4氐抗或 4氐月夷島素血癥患者。
46. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述患者為糖尿病患者或 易患4唐尿病。
47. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，進(jìn)一步包括將磺酰脲類、瘦素、 氯茴苯酸、雙胍、漆唑烷二酮、a-糖苷酶抑制劑或其組合給予 所述患者的步驟。
48. —種抑制、遏制或治療患者糖尿病的方法，所述方法包4舌用 TMEM27多肽或編碼所述TMEM27多肽的核酸4妄觸月夷腺(3細(xì) 月包或可經(jīng)i秀導(dǎo)變成胰腺j3纟田月包的纟田月包。
49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中在體外或離體接觸所述細(xì) 胞。
50. 才艮據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中在體內(nèi)接觸所述細(xì)胞。
51. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
52. 才艮據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述細(xì)胞從患糖尿病或易 患糖尿病的患者中分離，或?qū)⑺黾?xì)胞給予患糖尿病或易患糖 尿病的患者，或其纟且合。
53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述細(xì)胞為所述患者自體 的或同種異體的。
54. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述細(xì)胞促進(jìn)所述患者中 的(3細(xì)月包增殖、力夷島素分泌或其組合。
55. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述TMEM27多欣是全長 TMEM27蛋白或其片革史。
56. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述核酸編碼全長TMEM27蛋白或其片段。
57. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，進(jìn)一步包括用蛋白酶抑制劑接 觸所述細(xì)胞的步驟。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是絲氨 酸蛋白酶抑制劑或金屬蛋白酶抑制劑。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是BB94。
60. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，進(jìn)一步包括用Tcfl蛋白或編碼 所述Tcfl蛋白的核酸接觸所述細(xì)胞的步驟。
61. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述患者為胰島素抵抗或 《氐月夷島素血癥患者。
62. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述患者易患糖尿病。
63. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述患者患有青春晚期糖 尿病(MODY)。
64. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，進(jìn)一步包括將磺酰脲類、瘦素、 氯茴苯酸、雙胍、噻唑烷二酮、a-糖苷酶抑制劑或其組合給予所述患者的步-驟。
65. —種估計(jì)患者體內(nèi)力夷島質(zhì)量的方法，所述方法包括確定所述患 者血清中TMEM27濃度的步驟以及將所述濃度與對(duì)照濃度進(jìn) 行比較的步驟。
66. —種用于鑒定與TMEM27蛋白或其分泌形式相互作用的蛋白 的方法，所述方法包括在足以促進(jìn)TMEM27多肽與感興趣分 子之間特異性相互作用的條件下，用所述感興趣分子4妄觸所述 TMEM27多肽一段時(shí)間以及鑒定所述感興趣分子的步驟。
67. —種增加胰爿泉(3細(xì)胞質(zhì)量的方法，所述方法包括用絲氨酸蛋白 酶或金屬蛋白酶抑制劑接觸胰腺P細(xì)胞或可經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺卩 細(xì)月包的纟田胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)或可經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)TMEM27,并 才是供利于P細(xì)胞增殖的條件。
68. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是BB94、 (HONH-COCH2CH2CO-FA-NH2) 、 (OA-Hy;順式-9-油酸?；?-N-羥酰胺；油酰-N-氫化環(huán)酰胺)、{N-[[(4,5-二氬-5-石克代-l，3,4-喀二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸曱酯}、 {a-[[[4，5-二氫-5-硫 代-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基]羰基]氨基]-((2-吡啶基)哌嗪基-(S)-苯丙烷酰胺}、 { (2R)-2-[(4-二苯磺酰)氨基]-3-苯丙酸}、{ (2R)-[(4- 二苯磺酰)氨基]-N-羥基-3-苯丙酰胺}、 H-Cys 1 -Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys 10-OH 、 (SB-3CT)、 (Ac-RCGVPD-NH2;基質(zhì);容解素-l #卩制劑)、[N-異丁基-N-(冬甲氧苯石黃酰)-甘氨酰異羥肟酸;NNGH] {N-[[+S-二 氫-5-硫代-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基]-羰基]-L-苯丙氨酸}、 {a-[[[4,5-二氫-5-硫代-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基]-羰基]]氨基]-N-(環(huán)己基曱基)-(S)-苯丙酰胺、4-二苯呋喃-2cp-基-4-肟基-丁 酸、[4— (4cp-聯(lián)苯基)-4-肟基-丁酸]、{(3R) - ( + ) -[2- (4-甲 氧基苯磺酰)-1,2,3,4-四氫異壹啉3-異羥肟酸酯])、{( 3S )-(-) -[2- (4-曱氧基苯磺酰)-1,2,3,4-四氬異唾啉3-異羥肟酸酯])、 [N-羥基-l隱(4-曱氧苯基)石黃酰-4- (4-聯(lián)苯羰基)哌。秦-2-羧酰 胺]、[N-羥基-l-( 4-曱氧苯基)磺酰-4-芐氧羰基哌嗪-2-羧酰胺]、 (l,lO-二氮菲一水合物)、馬馬司他、普啉司他、坦諾司他、新 ^f戈司他、。坐來膦酸，或其組合。
69. 根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是BB94。
70. —種改變患者體內(nèi)新陳代i射的方法，所述方法包括用絲氨酸或 金屬蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制劑接觸胰腺卩細(xì)胞或可經(jīng)誘導(dǎo) 變成胰腺p細(xì)胞的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)或可經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá) TMEM27。
71. 根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是BB94 、 (HONH-COCH2CH2CO-FA-NH2) 、 (OA-Hy;順式-9-油酸?；?-N-羥酰胺；油酰-N-氫化環(huán)酰胺)、{N-[[(4，5-二氬-5-碌b代-l，3，4-，塞二唑-2-基)氨基]羰基]-L-苯丙氨酸甲酯}、 U-[[[4,5-二氫-5-硫 代-l,3,4-噻二唑-2-基)氨基]羰基]氨基H(2-吡啶)哌嗪基-(S)-苯 丙烷酰胺}、 {(2R)-2-[(4-二苯磺酰)氨基]-3-苯丙酸}、 {(2R)-[(4-二苯磺酰)氨基]-N-羥基-3-苯丙酰胺}、 H-Cys 1 -Thr-Thr陽His-Trp-Gly -Phe-Thr-Leu-Cys 10-OH 、 (SB-3CT)、 (Ac-RCGVPD-NH2;基質(zhì)溶解素-1抑制劑)、[N-異 丁基—N-(4-甲氧苯石黃酰)-甘氨酰異羥肟酸;NNGH] {N-[[《5-二氫 -5-硫代-1，3,4-p塞二唑-2-基)氨基]-羰基]-L-苯丙氨酸}、 {a-[[[4,5-二氫-5-硫代-1，3,4-噻二唑-2-基)氨基]-羰基]]氨基]-N-(環(huán)己基甲 基)-(S)-苯丙酰胺、4-二苯呋喃-2 cp-基-4-肟基-丁酸、[4- (4cp-聯(lián)苯基)-4-肟基-丁酸]、{ (3R) - ( + ) -[2- (4-曱氧基苯磺酰) -1,2,3,4-四氫異喹啉3-異羥肟酸酯]}、 { (3S) - (-) -[2- (4-曱 氧基苯磺酰)-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-異羥肟酸酯]}、 [N-羥基-l-(4-甲氧苯基)磺酰-4- (4-二苯羰基)哌漆-2-羧酰胺]、[N-羥 基—1— (4-甲氧苯基)磺酰-4芐氧羰基哌嗪-2-羧酰胺]、(l,lO-二 氮菲一水合物)、馬馬司4也、普啉司^f也、坦i若司^也、#斤4戈司4也、 p坐來膦酸，或其組合。
72. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是BB94。
73. —種抑制、遏制或治療患者糖尿病的方法，所述方法包4舌用絲 氨酸或金屬蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制劑接觸胰腺P細(xì)胞或可 經(jīng)誘導(dǎo)變成胰腺(3纟田月包的纟田胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)或可經(jīng)誘導(dǎo) 表達(dá)TMEM27。
74. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是BB94或其組合。
75. 根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是BB94。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多肽TMEM27及其分泌形式、編碼該多肽的核酸和構(gòu)建體以及包含該核酸和構(gòu)建體的細(xì)胞。所述TMEM27蛋白在胰腺發(fā)育早期階段的激素陽性細(xì)胞和成熟胰腺中的胰腺β細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，其表達(dá)促進(jìn)胰腺β細(xì)胞復(fù)制和胰島質(zhì)量增加。本申請(qǐng)中還描述了該蛋白在診斷學(xué)和治療學(xué)中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101512336SQ200680020054
公開日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2006年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月7日
發(fā)明者皮納爾·阿克珀納爾, 馬庫斯·施托費(fèi)爾 申請(qǐng)人:洛克菲勒大學(xué)