惡臭假單胞菌的pcr檢測用引物及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種惡臭假單胞菌的PCR檢測用引物和檢測方法，其中，引物的核苷酸序列為序列1和序列2；檢測方法包括下列步驟：1）將權(quán)利要求1中的引物、待檢菌液的DNA模板與PCR擴(kuò)增用的含Mg2+的PCR緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶混合，配制得PCR反應(yīng)體系；2）將上述的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上，按照預(yù)定擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增；3）擴(kuò)增結(jié)束后，利用電泳檢測擴(kuò)增片段從而斷定結(jié)構(gòu)；本發(fā)明采用PCR方法進(jìn)行惡臭假單胞菌的基因片段檢測，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度更高，檢測方法更加靈敏，僅需要普通的PCR儀和電泳儀就可以達(dá)到檢測的目的，而且僅用2-3小時就可以出具檢測結(jié)果。
【專利說明】惡臭假單胞菌的PCR檢測用引物及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，特別提供了一種惡臭假單胞菌的PCR檢測用引物及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]惡臭假單胞菌在自然界中普遍存在，是一種能夠去除環(huán)境污染的環(huán)保微生物菌劑。美國、日本等國家已將該菌大批量生產(chǎn)制成產(chǎn)品經(jīng)銷到世界各國。為了增加進(jìn)口環(huán)保微生物菌劑的質(zhì)量安全，保護(hù)我國自然環(huán)境不受外來細(xì)菌的破壞，需要盡快建立環(huán)保微生物菌劑中惡臭假單胞菌檢驗(yàn)方法。
[0003]目前，只有形態(tài)學(xué)鑒定和生化鑒定兩種方法檢測惡臭假單胞菌，而上述兩種檢測方法的結(jié)果均有很大的不確定性。
[0004]因此，如何研發(fā)一種新的檢測惡臭假單胞菌的方法，成為人們亟待解決的問題。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種惡臭假單胞菌的PCR檢測用引物及檢測方法，其通過采用PCR方法進(jìn)行惡臭假單胞菌的基因片段檢測，該檢測方法不僅更加靈活，而且檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高。
[0006]本發(fā)明一方面提供了惡臭假單胞菌的PCR檢測用引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為:
序列 1:5’ -CTG CAT CAT GGC CGG TGA CAA CAT TT- 3’
序列 2:5’ -GTC GCA TGG CTG TCG GTC TTC AGA TC-3，
本發(fā)明另一方面提供了惡臭假單胞菌的PCR檢測方法，其特征在于，包括下列步驟:
1)將上述惡臭假單胞菌的PCR檢測用引物、待檢菌液的DNA模板與PCR擴(kuò)增用的含Mg2+的PCR緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶混合，配制得PCR反應(yīng)體系；
2)將上述的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上，按照預(yù)定擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增；
3)擴(kuò)增結(jié)束后，利用電泳檢測擴(kuò)增片段從而斷定結(jié)構(gòu)。
[0007]優(yōu)選，所述擴(kuò)增條件為:94 °C預(yù)變性Imin ;94 °C變性15s，61°C退火15s，72 °〇延伸15s，進(jìn)行30個循環(huán)；72 °C延伸5min。
[0008]進(jìn)一步優(yōu)選，所述電泳檢測為凝膠電泳檢測。
[0009]進(jìn)一步優(yōu)選，所述凝膠電泳檢測具體為:3~5V/cm恒壓電泳，電泳50~60min 本發(fā)明提供的惡臭假單胞菌的PCR檢測用引物及檢測方法，采用PCR方法進(jìn)行惡臭假
單胞菌的基因片段檢測，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度更高，檢測方法更加靈敏，僅需要普通的PCR儀和電泳儀就可以達(dá)到檢測的目的，而且僅用2-3小時就可以出具檢測結(jié)果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為特異性確定檢測的電泳圖；
圖2為敏感性確定檢測的電泳圖；圖3、圖4和圖5為29批惡臭假單胞菌的樣品檢測電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面以具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的解釋，但并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]實(shí)施例1
引物的設(shè)計:
在Gengbank上查閱惡臭假單胞菌全基因序列，設(shè)計針對惡臭假單胞菌保守基因設(shè)計的特異性引物，其具體核苷酸序列為:
序列 1:5’ -CTG CAT CAT GGC CGG TGA CAA CAT TT- 3’
序列 2:5’ -GTC GCA TGG CTG TCG GTC TTC AGA TC-3，
擴(kuò)增惡臭假單胞菌目的基因片段為161bp。
[0013]實(shí)施例2
待檢菌液的DNA模板提取:
O以無菌操作取Ig UL)樣品加入到IOOmL生理鹽水中混勻，移取I環(huán)菌連續(xù)劃線接種5個假單胞菌顯色培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)24h。取樣過程中，在樣品旁邊放置I個假單胞菌顯色培養(yǎng)基平板作為空白對照。
[0014]2)挑取平板上1-3個單菌落轉(zhuǎn)營養(yǎng)肉湯35土 1°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)增菌培養(yǎng)18h~24h。
[0015]3)細(xì)菌基因組DNA的提取
取上述培養(yǎng)的菌液200ul，使用商品化的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，具體提取操作參照說明書進(jìn)行，提取得到細(xì)菌基因組DNA。
[0016]實(shí)施例3
PCR擴(kuò)增方法的建立:
I) PCR反應(yīng)體系的配制:具體的成分配制見表1，
表1
【權(quán)利要求】
1.一種惡臭假單胞菌的PCR檢測用引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為:
序列 1:5’ -CTG CAT CAT GGC CGG TGA CAA CAT TT- 3’ 序列 2:5’ -GTC GCA TGG CTG TCG GTC TTC AGA TC-3’。
2.一種惡臭假單 胞菌的PCR檢測方法，其特征在于，包括下列步驟: 1)將權(quán)利要求1中的引物、待檢菌液的DNA模板與PCR擴(kuò)增用的含Mg2+的PCR緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶混合，配制得PCR反應(yīng)體系； 2)將上述的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上，按照預(yù)定擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增； 3)擴(kuò)增結(jié)束后，利用電泳檢測擴(kuò)增片段從而斷定結(jié)構(gòu)。
3.按照權(quán)利要求2所述惡臭假單胞菌的PCR檢測方法，其特征在于，所述擴(kuò)增條件為:94 °C預(yù)變性Imin ；94 °C變性15s，61°C退火15s，72 °C延伸15s，進(jìn)行30個循環(huán)；72 °〇延伸 5min。
4.按照權(quán)利要求2所述惡臭假單胞菌的PCR檢測方法，其特征在于:所述電泳檢測為凝膠電泳檢測。
5.按照權(quán)利要求4所述惡臭假單胞菌的PCR檢測方法，其特征在于，所述凝膠電泳檢測具體為:3~5V/cm恒壓電泳，電泳50~60min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898221SQ201410135105
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】耿慶華, 王芳, 王金玲, 張瑩, 林穎 申請人:中華人民共和國沈陽出入境檢驗(yàn)檢疫局