專利名稱：：吸附重金屬鎘的重組惡臭假單胞菌ch01及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬環(huán)境工程土壤環(huán)境治理領(lǐng)域。具體涉及一種新的微生物修復(fù)重金屬鎘污染土壤的基因工程菌的構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明與微生物基因工程和環(huán)境工程領(lǐng)域有關(guān)。
背景技術(shù)：
：鎘是一種典型的分散型重金屬元素，主要以硫化物的形式存在于銅、鉛、鋅等有色金屬礦藏中。隨著人類活動(dòng)，鎘以各種途徑進(jìn)入環(huán)境中，造成了嚴(yán)重的鎘污染。鎘在環(huán)境中有穩(wěn)定積累和不易消除的特點(diǎn)，而鎘遷移轉(zhuǎn)化的最大特點(diǎn)是不能或不易被生物體分解轉(zhuǎn)化后排出體外，不易隨水移動(dòng)，只能沿食物鏈逐級(jí)往上傳遞，通過食物鏈富集使人體慢性中毒。研究表明，鎘同時(shí)對(duì)人類和動(dòng)物具有致癌作用，鎘污染地區(qū)居民的死亡率及癌癥罹患率同非污染地區(qū)相比均呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。目前，鎘已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)歸為第一類致癌物(McGregoretal.,2000)在鎘污染的土壤環(huán)境中的植物也會(huì)不同程度地吸收該重金屬，使得根、莖、葉等器官及各種細(xì)胞器受到不同程度的傷害，使植物生物量下降。植物對(duì)鎘的吸收取決于植物根系生理功能及根際圈內(nèi)微生物群落組成、士壤的理化性質(zhì)、重金屬種類和濃度、氧化還原電位以及PH值等因素影響。部分植物對(duì)包括鎘在內(nèi)的重金屬有較高的耐受和吸收性能而被用于修復(fù)重金屬污染的土壤，但是目前篩選出的富集重金屬的植物往往只對(duì)一種重金屬元素表現(xiàn)出較強(qiáng)的富集能力，而對(duì)復(fù)合污染的幾種重金屬元素同時(shí)富集的能力較弱；同時(shí)還存在著植物生物量小、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)以及扎根淺等問題。植物根際微生物與植物根系所組成的生態(tài)系統(tǒng)對(duì)重金屬在根土界面的遷移轉(zhuǎn)化有著重要的作用。根際微生物對(duì)重金屬的吸附轉(zhuǎn)化和固定能有效降低重金屬對(duì)植物的傷害。而微生物對(duì)重金屬的耐受和解毒能力也為微生物從功能上治理和修復(fù)重金屬污染土壤提供了新的途徑。在所有微生物修復(fù)重金屬機(jī)制中，通過金屬硫蛋白吸附重金屬，特別是難于轉(zhuǎn)化為低毒或無毒的鎘一類的重金屬受到我們特別的關(guān)注。金屬硫蛋白(Metallothionein，簡(jiǎn)稱MT)是一類低分子量，富含半胱氨酸，能夠結(jié)合Cd、Zn、Cu等多種金屬離子的蛋白質(zhì)。1957年，Margoshes和Vallee首次從馬腎中分離得到。在重金屬吸附的利用方面，目前主要是將該類蛋白與周質(zhì)空間或外膜組分融合后在大腸桿菌中表達(dá)，或者將MT的表達(dá)與金屬膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)相結(jié)合(Jacobs,1989；Romeyer,etal,1990；Sousaetal.,1998；Vallsetal.,2000；Vallsetal.，1998)。但是大腸桿菌對(duì)重金屬的耐受能力較弱，而工程菌吸附重金屬后降低了工程菌的有效吸附周期，單個(gè)MT分子對(duì)于吸附效率和容量的提高也沒有明顯的增強(qiáng)。發(fā)明人所分離的一株高度耐受多種重金屬的細(xì)菌，初步具備修復(fù)多種重金屬污染的能力，同時(shí)也為構(gòu)建高度重金屬污染土壤修復(fù)工程菌提供了一個(gè)十分有效的宿主。微生物表面展示技術(shù)是利用基因重組方法把靶蛋白(外源肽段或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域)基因序列與特定的載體蛋白基因序列(又稱定位序列)融合后導(dǎo)入微生物宿主細(xì)胞，從而使靶蛋白表達(dá)并定位于微生物細(xì)胞表面。被展示的多肽或蛋白質(zhì)可以保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。微生物展示策略能夠?qū)⑴c重金屬吸附的蛋白質(zhì)表達(dá)在宿主細(xì)胞表面，這既增強(qiáng)了修復(fù)工程菌與重金屬的接觸，又能降低細(xì)胞內(nèi)的重金屬濃度，從而增強(qiáng)工程菌的耐受能力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，篩選一種新的微生物修復(fù)重金屬鎘污染土壤的基因工程菌。本發(fā)明還涉及該基因工程菌的構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下申請(qǐng)人:通過基因工程的方法篩選獲得一種能夠修復(fù)重金屬鎘污染土壤的基因工程菌CHOl，該菌株屬于惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)CH01，于2009年12月19日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為=CCTCCNOM209320。本發(fā)明的基因工程菌的制備方法是，首先將猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域四聚體(mMT4α)融合在野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)ATCC33913冰晶核蛋白N端(inaX-N)，并以此為主要功能單元構(gòu)建一個(gè)廣宿主表達(dá)質(zhì)粒。然后在本發(fā)明人所分離的高效耐受多種重金屬的惡臭假單胞菌X4(PseudomonasputidaX4)中利用鎘特異性啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)，實(shí)現(xiàn)猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域四聚體在該細(xì)菌的表面展示，從而獲得高效專一吸附重金屬鎘的基因工程菌菌株，將該基因工程菌命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)CHOl0本發(fā)明所提供的基因工程菌CHOl可以在多種重金屬存在的實(shí)驗(yàn)室條件下顯著吸附重金屬鎘，與豇豆、玉米的共生的水培結(jié)果顯示本發(fā)明的基因工程菌CHOl可以在植物根際定殖并快速吸附重金屬鎘。本發(fā)明提供的基因工程菌CHOl可用于鎘污染土壤的治理，降低重金屬鎘污染土壤的生物毒性，促進(jìn)污染區(qū)農(nóng)作物的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)。更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實(shí)施方式》所述。序列表SEQIDNO:1是本發(fā)明所克隆并使用的野油菜黃單胞菌冰晶核蛋白N端(inaX-N)核苷酸序列。序列表SEQIDNO:2是本發(fā)明所克隆并使用的猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域(MTα)核苷酸序列。序列表SEQIDNO:3是本發(fā)明所克隆并使用的重金屬鎘響應(yīng)啟動(dòng)子核苷酸序列。序列表SEQIDNO:4是本發(fā)明人工構(gòu)建的具有吸附重金屬鎘的功能序列的核苷酸序列。表1本發(fā)明用于植物水培的Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液配方。圖1本發(fā)明實(shí)施例中所獲取的inaX-N序列PCR擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳分析；圖中M=DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1inxN的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2本發(fā)明實(shí)施例中所獲取的鎘響應(yīng)啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳分析；4圖中1=DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3本發(fā)明實(shí)施例中修復(fù)重金屬鎘污染的功能質(zhì)粒pCIM的構(gòu)建圖及其物理圖■i並曰ο圖4本發(fā)明實(shí)施例中工程菌CHOl的生長(zhǎng)態(tài)鎘吸附量測(cè)定結(jié)果。圖中X4指示本發(fā)明所采用的宿主菌；X4/pCIM指示本發(fā)明所使用的工程菌CH01。圖5本發(fā)明實(shí)施例中工程菌CHOl的靜態(tài)鎘吸附量測(cè)定結(jié)果。圖中X4指示本發(fā)明所采用的宿主菌；X4/pCIM指示本發(fā)明所使用的工程菌CH01。圖6本發(fā)明實(shí)施例中工程菌CHOl在共生水培實(shí)驗(yàn)下對(duì)不同植物的干重和株高的影響。圖中CK指示的實(shí)驗(yàn)條件為常規(guī)條件，無重金屬和工程菌；X4/pCIM+Cd指示添加工程菌和重金屬鎘；X4+Cd指示添加宿主菌X4和重金屬鎘；a部分是不同作物的干重比較；b部分是不同作物的株高比較圖7本發(fā)明實(shí)施例中工程菌CHOl在共生水培實(shí)驗(yàn)下對(duì)不同植物植物根際鎘含量測(cè)定。圖中X4/pCIM指示添加工程菌后植物根際鎘含量；X4指示添加宿主菌X4后植物根際鎘含量；withoutincubation指示未添加任何菌株的植物根際鎘含量。具體實(shí)施方案以下敘述是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)施例。應(yīng)該說明的是，本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。有關(guān)DNA的標(biāo)準(zhǔn)操作方法和所使用的藥品均參考分子克隆手冊(cè)(參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)所描述的內(nèi)容。本發(fā)明中所涉及的其他各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作技術(shù)，文中沒有特別說明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說明書、手冊(cè)等加以實(shí)施。實(shí)施例1修復(fù)鎘污染的功能質(zhì)粒pCIM的構(gòu)建本發(fā)明所利用的核苷酸序列來源如下鎘響應(yīng)啟動(dòng)子來源于惡臭假單胞菌KT2440(Pseudomonasputida)KT2440(見SEQIDΝ0:3所示)；猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域序列(見SEQIDΝ0:2所示)，該序列來源于復(fù)旦大學(xué)黃仲賢教授實(shí)驗(yàn)室提供；inaX-N來源于野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)ATCC33913(見SEQIDN0:1所示)。1、野油菜黃單胞菌的Inax-N的獲取申請(qǐng)人:以野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)ATCC33913的總DNA為模板，設(shè)計(jì)上游引物5，CCATGGATCGCGAAAAAGTCTTGG3，，下游引物5，GAATTCTGCGTACCCGCGAAAT3，，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系包括IOXBuffer2.5μ1，Mg2+Iμ1，dNTP2.5μ1，模板DNA2μ1，引物各1μl，K0D_Plus0.5μ1，ddH20補(bǔ)足25μ1。PCR條件為94°C5min，94°C30ec,58°C30sec,68°C3sec，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠檢測(cè)如圖1，然后將純化的PCR產(chǎn)物與T載體(購自寶生物工程(大連)有限公司)連接，獲得pMDIS-inax克隆，并對(duì)其中的inax進(jìn)行測(cè)序。該片段的核苷酸序列序列如SEQIDNO:1所示，表明申請(qǐng)人獲得具有細(xì)菌表面展示功能的inax-N片段。52、猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域(MTα)序列的獲取和四聚體片段MTα4的構(gòu)建PCR模極為復(fù)旦大學(xué)黃仲賢教授所饋贈(zèng)的含有猴金屬硫蛋白的序列的質(zhì)粒，申請(qǐng)人通過克隆獲得猴金屬硫蛋白的α結(jié)構(gòu)域序列(見SEQIDΝ0:2所示)。具體方法如下以含有猴金屬硫蛋白的序列的質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域片段的擴(kuò)增。為了進(jìn)行猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域多聚體的構(gòu)建，利用引物(如后所述)在該片段兩側(cè)引入BglII和BamHI酶切位點(diǎn)。引物序列和PCR反應(yīng)條件如下以上游引物5'-cggaAGATCTaagaaaagctgctgctc,下游引物5'-attcGGATCCggcacaacagttgcac進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR體系包括IOXBuffer2.5μ1，Mg2+Iμ1，dNTP2.5μ1，模板DNA2μ1，引物各1μ1，KOD-Plus0.5μ1，ddH20補(bǔ)足25μ1。PCR條件:94°C2min，94°C15sec，58°C30sec,68°C20sec，循環(huán)25次。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，并按照常規(guī)方法純化檢測(cè)。然后將MTa基因片段連入T載體，藍(lán)白斑篩選獲得ρΤΑ-ΜΤα陽性克隆，并進(jìn)行測(cè)序和分析。所克隆的猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，表明獲得的猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域序列正確。接下來用BglII和BamHI酶切ρΤΑ-ΜΤα，瓊脂糖凝膠回收小片段MTα(IlObp)，MTa與經(jīng)BamHI酶切并去磷酸化的載體pGEX-2T連接。酶連操作按照以下方法進(jìn)行取PGEX-2TIyl稀釋到ΙΟμΙ。取回收的MTa基因片斷，室溫下溶解。建立酶連體系如下體系1(物質(zhì)的量比為140)稀釋后的線狀PGEX-2T0.2μ1，ΜΤa8.5μ1，T4DNALigaseBuffer1μ1,T4DNALigase0·3μ1，ddH20補(bǔ)足10μ1。體系2(對(duì)照)稀釋后的線狀PGEX-2T0.2μ1，T4DNALigaseBuffer1μ1,T4DNALigase0.3μ1，ddH20補(bǔ)足10μ1。16°C過夜反應(yīng)。按照申請(qǐng)人的經(jīng)驗(yàn)，一步酶連反應(yīng)一般可以獲得三聚串連體(pGMTa3)，然后以三聚串連體為基礎(chǔ)進(jìn)一步獲得更高數(shù)目串連體。PGMTα3經(jīng)BamHI酶切，并進(jìn)行去磷酸化處理，獲得線狀PGMTα3，溶解凍存的MTα片段，建立線狀pGMTα3與MTα片段的酶連體系(pGMTa3MTa的物質(zhì)的量比為140)。酶連轉(zhuǎn)化獲得的克隆子經(jīng)過驗(yàn)證得到四聚體串聯(lián)體MTa4，并被命名為pGEX-4T_mMT4a。3、鎘特異性啟動(dòng)子的克隆和X4表達(dá)載體的構(gòu)建以惡臭假單胞菌KT2440(AnuLeedja..rvetal.，2008)基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增鎘響應(yīng)啟動(dòng)子片段。惡臭假單胞菌KT2440總DNA的抽提(1)用1.5ml離心管將LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的菌液離心收集菌體，6，OOOrpm離心5min，棄上清液；(2)加入300μ1ΤΕ，吹吸充分混勻，8，OOOrpm離心5min，棄上清液，重復(fù)2次；(3)用300μITE混勻，再加入15μ110mg/ml的溶菌酶37°C水浴30min；(4)加入30μ110%的十二烷基硫酸鈉(SDS)混合均勻水浴37°C至50°C；(5)再加入5μ1蛋白酶K，50°C水浴Ih；(6)加入80μ15Μ的NaCl；(7)加等體積的酚-仿，振蕩5min，12，OOOrpm離心5min，使溶液分層，取上層水相；(8)重復(fù)上述操作，至無蛋白析出，取上層水相；(9)加入2倍體積的無水乙醇在_20°C保溫30min沉淀DNA，12，OOOrpm離心5min，棄上清液；(10)加入70%乙醇洗滌沉淀，12，OOOrpm離心5min，棄上清，置于室溫自然風(fēng)干，加入50μ1ddH20使DNA完全溶解；(11)將抽提的總DNA取2μ1，用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA質(zhì)量。然后以上述抽提的總DNA為模板，以正向引物5，一GGGTCGACCTTAAATTGAGCCTGTTG—3，；反向引物5，—GCGAAGCTTAGATCTCAATGCCCGTGA—3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μLPCR反應(yīng)體系中包含10μL5XPCRBuffer,28.75μLdH20，0.25μLKOD酶，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，1μL模板。PCR反應(yīng)參數(shù)和程序?yàn)?4°C，2min，1個(gè)循環(huán)；94°C，15sec，64°C，30sec，68°C，3min,30個(gè)循環(huán)；4°C，5min,1個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠檢測(cè)如圖2，然后將啟動(dòng)子連接入廣宿主表達(dá)質(zhì)粒PTR102，形成pTR102-PcadR，并進(jìn)行測(cè)序。序列如SEQIDNO34鎘修復(fù)功能質(zhì)粒pCIM的構(gòu)建和基因工程菌CHOl的獲取為了進(jìn)行高效專一的重金屬鎘污染土壤的修復(fù)，申請(qǐng)人在本身能耐受鎘并具有一定鎘修復(fù)能力的宿主菌惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)X4(該菌株于2009年12月19日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCCNOM209319)的基礎(chǔ)上，以鎘特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)金屬結(jié)合蛋白猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域四串聯(lián)體在宿主菌表面展示表達(dá)。功能質(zhì)粒包括鎘特異性啟動(dòng)子，細(xì)菌表面展示元件inx-N和金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域四串聯(lián)體。具體構(gòu)建流程見圖3。構(gòu)建過程如下所述。以pGEX-4T-mMT4α為模板，以5，GAATTCTGCGTACCCGCGAAAT3，禾P，GGATCCTTATTATCTAGAGATTCGAATTCCCG3，為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系包括引物各2.5μL，模板DNAlμL,Ex-TaqDNA聚合酶0.8μL，IOXEx-TaqDNA聚合酶緩沖液5μL，dNTPmixture4μL,ddH2034.2μL,PCR條件為94°C2min，94°C15sec，58°C30sec，68°C20sec，循環(huán)25次。PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳分析檢測(cè)；然后連接到pMD18-T得到pMD18-mMT4α質(zhì)粒，然后進(jìn)行測(cè)序以確定。將pMD18-mMT4α和pMD18_inaX分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI處理，使兩者產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，連接得到pMD18-inaX-N-mMT4α，經(jīng)過測(cè)序證實(shí)inaX-N_mMT4α為同一開放閱讀框(ORF)下的融合基因，其核苷酸序列如SEQIDΝ0:4所示(即本發(fā)明需要的功能序列)。然后用NcoI和BamHI分別處理pTR102-PcadR和pMD18-inaX-N-mMT4α，回收pTR102_PcadR和inaX-N_mMT4α融合基因，酶連后得到載體pCIM(pTR102-PcadR-inaX-N-mMT4α)，電轉(zhuǎn)化Χ4得到重組菌X4/pCIM，該重組菌被命名為CHOl04、重組惡臭假單胞菌CHOl的生物學(xué)及遺傳學(xué)特性①生物學(xué)特性革蘭陰性桿菌，單端叢毛菌，專性需氧，最適生長(zhǎng)溫度25°C30°C，生長(zhǎng)迅速，但是在42°C不生長(zhǎng)，飽和培養(yǎng)物有腥臭味。有莢膜。對(duì)鎘(Cd2+)7mM、銅(Cu2+)4.5mM、鈷(Co2+)7.5mM、銀(Ag+)O.05mM、鋅(Zn2+)7.5mM等重金屬有較好的耐受性。②遺傳學(xué)特性本發(fā)明是以對(duì)重金屬具有高度耐受性的惡臭假單胞菌X4為出發(fā)菌株得到的重組惡臭假單胞菌CH01，該重組菌株CHOl含有本發(fā)明構(gòu)建的鎘吸附功能質(zhì)粒pCIM，該質(zhì)粒能在該重組菌中穩(wěn)定存在，表達(dá)正常，對(duì)受體菌的生長(zhǎng)無重大影響。③培養(yǎng)條件本重組菌CHOl所使用的培養(yǎng)基為MJS培養(yǎng)基HEPES12.5mM(pH7.1)；NaCl50mmol/L；NH4Cl20mmol/L；KCllmmol/L；MgCl2lmmol/L；7MnCl2O.05mmol/L；酪氨酸0.8%；甘油4%；硫胺素0.005%，121°C高壓蒸汽滅菌30min。培養(yǎng)本發(fā)明的重組菌CHOl時(shí)應(yīng)加入氨芐青霉素Amp100μg/mL；鹽酸四環(huán)素Tet20μg/mL,然后進(jìn)行28°C，200r/min搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)惡臭假單胞菌X4時(shí)基本條件同上，但該菌使用的抗生素為氨芐青霉素Amp，其終濃度為100μg/mL。實(shí)施例2本發(fā)明的基因工程菌CHOl對(duì)鎘吸附能力實(shí)驗(yàn)1、生長(zhǎng)態(tài)鎘的吸附將本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌CHOl和出發(fā)菌株惡臭假單胞菌X4在含有相應(yīng)抗生素的MJS培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后按照1100的比例接種到50毫升的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)到OD600為0.6，然后加入終濃度為100ymol/L的CdCl2,于llh、21h、31h分別取樣2mL，測(cè)量鎘的吸附量。具體測(cè)量方法是將菌液樣品于13000r/min離心5min，沉淀用5mmol/LHEPES緩沖液(pH7.1)混合0.8%NaCl溶液洗滌3次，65°C干燥24h，再加入100μL濃硝酸硝化48h，硝化產(chǎn)物用ddH20稀釋，然后用石墨爐原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定菌體中鎘的含量。圖4表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌體對(duì)鎘的單位吸附量逐漸增大?；蚬こ叹鶦HOl對(duì)鎘的吸附量達(dá)到2.17士0.4nm0l/mg(干重)，是對(duì)照菌吸附量的2倍左右，顯著提高了細(xì)菌對(duì)鎘的吸附能力。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明中的基因工程菌CHOl能顯著增強(qiáng)對(duì)重金屬鎘的吸附而具備修復(fù)鎘污染土壤或水體的能力。2、靜態(tài)鎘吸附為了模擬工程菌投入土壤后，在土壤中的緩慢生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)鎘吸附的影響，發(fā)明人進(jìn)行了靜態(tài)細(xì)胞鎘吸附實(shí)驗(yàn)。將基因工程菌CHOl和出發(fā)菌株惡臭假單胞菌X4進(jìn)行過夜培養(yǎng)，然后按照體積比為1100的比例接種到50毫升的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)到0D_為0.6，然后加入終濃度為50μmol/L的CdCl2,28°C靜置培養(yǎng)17h，冰上冷卻20min，4°C離心收集菌體，用50mmol/LTris-HCl(pH7.4)緩沖液洗滌3次，重懸，再加入終濃度為50μmol/L的CdCl2,分別于0、5、30、60和150min取樣2mL，按照前述方法測(cè)定鎘的吸附量。從圖5可以看出，細(xì)胞與鎘的結(jié)合在很短時(shí)間內(nèi)完成，最大吸附量的90%都在5min時(shí)間內(nèi)完成。工程菌的最大吸附量達(dá)到2.96士0.5nmol/mg(干重)，是對(duì)照的0.5士0.02nmOl/mg(干重)吸附量6倍左右。在5min取樣測(cè)得的吸附量與最高濃度吸附量相比較，占91%以上，這說明工程菌能在5分鐘內(nèi)快速、高效且專一的吸附重金屬鎘。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在模擬土壤環(huán)境中本發(fā)明中的基因工程菌CHOl能高效專一的吸附重金屬鎘。實(shí)施例3本發(fā)明的基因工程菌CHOl與植物共生水培實(shí)驗(yàn)本發(fā)明的制備的用于水培培養(yǎng)的植物營(yíng)養(yǎng)液見表1所示。表1用于水培實(shí)驗(yàn)的植物營(yíng)養(yǎng)液配方本實(shí)施例的具體步驟如下(1)將玉米和豇豆種子用95%的乙醇浸泡5min，再用100%NaClO洗5min，然后用無菌水漂洗5-10次。將玉米和豇豆種子置于裝有無菌水的培養(yǎng)皿中，置于28°C恒溫光照培養(yǎng)箱中催芽，玉米和豇豆種子的培養(yǎng)皿中水變渾濁后換水，約3天生根。將生根的種子置于石英砂上繼續(xù)培養(yǎng)，每天澆一次Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液，28°C恒溫光照培養(yǎng)10天。(2)將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的惡臭假單胞菌X4和基因工程菌CHOl在4°C，4000r/min條件下離心IOmin收集菌體，并用PBS(pH7.2)洗滌兩次，最終重懸于Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液中，使終濃度達(dá)到107CFU/mL。本發(fā)明中用于植物水培的Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液是由去離子水配好的大量元素和微量元素的的1000倍濃縮液，避光保存?zhèn)溆?。換培養(yǎng)液時(shí)用去離子水稀釋后根據(jù)需求用氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值。具體的元素組成如表1所示。(3)將植物小苗移栽到裝有Hoagland's營(yíng)養(yǎng)液的三角瓶中，瓶口用錫紙將基部固定。每個(gè)瓶子裝入一個(gè)通氣管，管口置于瓶底部，用空氣泵向瓶?jī)?nèi)通氣。三角瓶外面套上一層不透光的黑布，置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，每7天換一次Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)20天后接入處理過的工程菌。待菌體在根部定殖4天后，換成含有100μmol/L鎘的營(yíng)養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)7天后收獲植株，將收獲的植株根分離，108°C烘干48h后稱重，取0.05g于ImL濃硝酸中硝解48h后，稀釋過濾后測(cè)定鎘含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入鎘的植株都表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩、植株矮小、莖倒伏、葉片黃化等現(xiàn)象。但接入基因工程菌CHOl后能顯著提高植物在鎘環(huán)境下的干重和株高，增強(qiáng)對(duì)鎘脅迫的耐受(圖6)。接種工程菌CHOl的植株和接種惡臭假單胞菌X4的相比較，玉米和豇豆組中的基因工程菌CHOl處理比惡臭假單胞菌X4處理的干重和株高都要高，說明本發(fā)明的基因工程菌工程菌CHOl能有效緩解重金屬鎘對(duì)植物的生物毒性。植物根際鎘含量原子吸收結(jié)果(圖7)表明，接入基因工程菌CHOl和原宿主菌惡臭假單胞菌X4的植株其根際與對(duì)照組根際相比都有較高的鎘吸附量，且主要集中在植物的根部。吸附量最高均為接入基因工程菌CHOl的植株根際，其中豇豆根際最高達(dá)到16.13士3.SOnmol/mg(干重)，與對(duì)照比較，吸附量差異最大的為玉米組，接入基因工程菌CHOl的植株根際鎘吸附量是對(duì)照組到1.75倍。本實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明中的基因工程菌CHOl在部分農(nóng)作物的實(shí)際生產(chǎn)中能通過在植物根際吸附固定重金屬鎘而避免重金屬向植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，從而保護(hù)農(nóng)作物免受鎘的毒害。9參考文獻(xiàn)1.McGregorDB,BaanRA,PartenskyC,RiceJΜ,WilbournJD.Evaluationofthecarcinogenicriskstohumansassociatedwithsurgicalimplantsandotherforeignbodies—areportofanIARCMonodraphsProgrammeMeeting,InternationalAgencyforResearchonCancer.EurJCancer,2000,36:307_3132.JacobsFA,BeaucheminFM,BrousseauMR.Humanmetallothionein-IIissynthesizedasastablemembrane-localizedfusionproteininEscherichiacoli..Gene,1989,83:95_1033.RomeyerFM,JacobsFA,BrousseauR.ExpressionofaNeurosporacrassametallothioneinanditsvariantsinEscherichiacoli.ApplEnvironMicrobiol,1990,562748-27544.SousaC,KotrbaP,RumlT,CebollaA,DeLorenzoV.MetalloadsorptionbyEscherichiacolicellsdisplayingyeastandmammalianmetallothioneinsanchoredtotheoutermembraneproteinLamB.JBacteriol,1998,180:2280_22845.VallsM,deLorenzoV,Gonzalez-DuarteR,AtrianS.Engineeringouter-membraneproteinsinPseudomonasputidaforenhancedheavy-metalbioadsorption.JInorgBiochem，2000，79:219_2236.VallsM,Gonzalez-DuarteR,AtrianS,DeLorenzoV.BioaccumulationofheavymetalswithproteinfusionsofmetallothioneintobacterialOMPs.Biochimie,1998,80:855_8617.AnuLeedja“rv,AngelaIvask,andMarkoVirta.InterplayofDifferentTransportersintheMediationofDivalentHeavyMetalResistanceinPseudomonasputidaKT2440.JBacteriol,2008,190(8)=2680-2689序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>吸附重金屬鎘的基因工程菌CHOl及應(yīng)用<130><141>2009-12-29<160>4<170>PatentInversion3.1<210>1<211>540<212>DNA<213>野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)<220><221>gene<222>(1)..(540)<223><400>10103]atggtccatatgaatcgcgaaaaagtcttggcattacgcacttgcacgaacaacatgtcc600104]gatcattgcgggctgatctggccactgtccggcatcgtcgaatgtcggcattggcaaccc1200105]agcatcaaacaggaaaacggcttgaccggcCtgttgtggggacagggcaccaatgcgcat1800106]ctgaacatgcatgccgacgcgcattgggtcgtctgcatggtggacaccgccgacatcatc2400107]tggctgggcgaagagggaatgatcaagttccccagggcggaggtggtctacgccggcaac3000108]CgtgCgggCgcgatgagctgcatcgccgccggcatcgagcagcattcgccacccaagccc3600109]gagccccctgcagacagcgtgattgctgcggagttcactcccaaggcggcgcatgcgcaa4200110]ttcactgcgcccgtcgttgaaagcggtgcgcattccaccgcgccactgccatcgccgcct4800111]aatggcatcggcccacaagccgcgcagccgtcaaatgcgatcctgcgtacccgcgaaatc5400112]<210>20113]<211>960114]<212>DNA0115]<213>猴子(Macaca)0116]<220>0117]<221>gene0118]<222>⑴··(96)0119]<223>0120]<400>20121]aagaaaagctgctgctcctgCtgCCCCgtgggctgtgccaagtgtgcccagggctgtgtc600122]tgcaaaggggcgtcggagaagtgcaactgttgtgcc960123]<210>30124]<211>5410125]<212>DNA0126]<213>惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)0127]<220>0128]<221>promoter0129]<222>⑴··(541)0130]<223>0131]<400>30132]gcgaagcttttggctcaatgcccgtgactccgccccacatgggaatgttcggtatccggt600133]accgataccgCCCCgtttgtctccagttgctgcaagatcgcgcattcactcccctgcgcg1200134]ttgcagcgccgccgcagctccaccagctgctcctgcaatgccaccaagccatcgatccgc1800135]gcctgaacatgctcgatatgctcgtcgatcagcgcattgacgctgccgcacgcgtcgtcg2400136]gggctgtcgcgcaggcgtagcaggctgcgaatttcgtccagggtcatgtccagcgtgcgg3000137]cagttgcggatgaaggtcagccgctccacatgggcctgggtgtacaaccggtagttgccc3600138]tcgctgcgcgCCggCtCtggcagcaggttttcacgctcgtagtagcggatggtttccacc4200139]gcgcagtcggtggctttggccagttctccgatcttcatcacgaaatctccagcaagtggc4800140]ttgaccctatagtggctacagggtgttcacttggcaacaggctcaatttaaggatgaccc5400141]C5410142]<210>40143]<211>9660144]<212>DNA0145]<213>人工序列0146]<220>0147]<221>gene0148]<222>⑴··(966)0149]<223>0150]<400>40151]atggtccatatgaatcgcgaaaaagtcttg0152]gatcattgcgggctgatctggccactgtcc0153]agcatcaaacaggaaaacggcttgaccggc0154]ctgaacatgcatgccgacgcgcattgggtc0155]tggctgggcgaagagggaatgatcaagttc0156]CgtgCgggCgcgatgagctgcatcgccgcc0157]gagccccctgcagacagcgtgattgctgcg0158]ttcactgcgcccgtcgttgaaagcggtgcg0159]aatggcatcggcccacaagccgcgcagccg0160]gaattcaagaaaagctgctgctcctgctgc0161]tgtgtctgcaaaggggcgtcggagaagtgc0162]tgctcctgctgccccgtgggctgtgccaag0163]tcggagaagtgcaactgttgtgctggatct0164]ggctgtgccaagtgtgcccagggctgtgtc0165]tgtgccggatctaagaaaagctgctgctcc0166]cagggctgtgtctgcaaaggggcgtcggag0167]gcattacgcacttgcacgaacaacatgtcc60ggcatcgtcgaatgtcggcattggcaaccc120Ctgttgtggggacagggcaccaatgcgcat180gtctgcatggtggacaccgccgacatcatc240cccagggcggaggtggtctacgccggcaac300ggcatcgagcagcattcgccacccaagccc360gagttcactcccaaggcggcgcatgcgcaa420cattccaccgcgccactgccatcgccgcct480tcaaatgcgatcctgcgtacccgcgaaatc540CCCgtgggCtgtgccaagtgtgcccagggc600aactgttgtgccggatctaagaaaagctgc660tgtgcccagggctgtgtctgcaaaggggcg720aagaaaagctgctgctcctgCtgCCCCgtg780tgcaaaggggcgtcggagaagtgcaactgt840tgctgccccgtgggctgtgccaagtgtgcc900aagtgcaactgttgtgccaagcttccggga96096權(quán)利要求一株能夠修復(fù)重金屬鎘污染的重組惡臭假單胞菌CH01，其特征在于，該菌株是惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)CH01，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCCNOM209320。2.一個(gè)具有重金屬修復(fù)功能的廣宿主質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其步驟包括將SEQIDNO2所示的猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域序列，組裝成四聚體mMT4a，然后將其與如SEQIDN0:1所示的野油菜黃單胞菌ATCC33913冰晶核蛋白N端序列結(jié)合，得到人工構(gòu)建的具有吸附重金屬鎘的如序列表SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；再將SEQIDNO:4所示的核苷酸序列與SEQIDNO:3所示的惡臭假單胞菌KT2440的鎘特異性啟動(dòng)子序列進(jìn)行拼接，最后將所述的SEQIDNO:4及SEQIDNO:3所示的核苷酸序列與廣宿主表達(dá)載體pTR102拼接，獲得質(zhì)粒pCIMo3.權(quán)利要求1所述的重組惡臭假單胞菌CHOl重金屬鎘污染治理中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于環(huán)境工程土壤環(huán)境治理領(lǐng)域。涉及一種新的微生物修復(fù)重金屬鎘污染土壤的基因工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用。將猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域四聚體融合在野油菜黃單胞菌ATCC33913冰晶核蛋白N端，以此為主要功能單元構(gòu)建一個(gè)廣宿主表達(dá)質(zhì)粒，然后在高效耐受多種重金屬的惡臭假單胞菌X4中利用鎘特異性啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域四聚體在該細(xì)菌中的表面展示，獲得高效專一吸附重金屬鎘的基因工程菌CH01。該工程菌可在多種重金屬存在的條件下顯著吸附重金屬鎘，與小麥、豇豆、玉米的共生水培結(jié)果顯示該工程菌CH01可以在植物根際定殖并快速吸附鎘離子。本發(fā)明還公開了基因工程菌CH01的構(gòu)建方法。其保藏號(hào)為CCTCCNo.M209320。文檔編號(hào)C12N15/78GK101892187SQ20091027344公開日2010年11月24日申請(qǐng)日期2009年12月30日優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日發(fā)明者何小川,李友國(guó),王珂征,陳雯莉,雷磊,黃巧云申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)