建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，屬于動物細(xì)胞（組織）工程領(lǐng)域。膠原酶消化成年大鼠胰腺組織，Dextron不連續(xù)密度梯度離心，RPMI1640有血清培養(yǎng)，胰腺導(dǎo)管原代上皮樣干細(xì)胞貼壁生長，克隆環(huán)篩選，上皮樣干細(xì)胞純化，胰蛋白酶消化液消化傳代，建立細(xì)胞系；采用該方法建立的一例大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的特征是細(xì)胞貼壁呈多角形上皮樣，克隆性生長，是正常的二倍體細(xì)胞，在蛋白水平表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原、八聚體轉(zhuǎn)錄因子4、干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白、角蛋白19和神經(jīng)源性分化因子2，具有多分化潛能，無致瘤性。
【專利說明】建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及建立人類和其它哺乳動物胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系的方法，特別涉及一種建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，屬于動物細(xì)胞(組織)工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是危害人類健康的重大疾病之一,據(jù)統(tǒng)計(jì)目前全世界糖尿病患者已達(dá)3.46億(Am J Stem Cells.2012，I (3): 196-204.)，而傳統(tǒng)的藥物及胰島素替代療法卻不能從根本上醫(yī)治該病。近十年來，隨著移植技術(shù)的發(fā)展，胰島移植治療糖尿病取得了一定的療效(N Engl J Med.2000, 343(4):230-238.Diabetes.2005, 54(7): 2060-2069.Am J Transplant.2008,8(11):2463-2470.1mmune Netw.2013，13(6):235-239.)。但是，由于供體來源短缺，胰島移植治療糖尿病技術(shù)的應(yīng)用受到制約。胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞是存在于胰腺導(dǎo)管組織中的成體干細(xì)胞，能自我更新并具有多分化潛能。體外分離克隆胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化形成功能性胰島，并移植治療糖尿病是有效解決供體短缺的途徑之一。目前，建立胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系，研究胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞分化形成功能性胰島移植治療糖尿病已成為焦點(diǎn)。國外，Ramiya等(Nat Med.2000，6 (3): 278-282.J Hepatobiliary Pancreat Surg.2002，9 (6): 704-709.)首先報(bào)道膠原酶消化 NOD 小鼠胰腺組織，手工分離胰腺導(dǎo)管，消化獲得單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)，無糖、高氨基酸培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)形成單層；體外誘導(dǎo)，這些細(xì)胞產(chǎn)生小而圓的胰島祖細(xì)胞(islet progenitor cells,IPCs)，繼續(xù)培養(yǎng)，這些小細(xì)胞進(jìn)一步形成胰島(IPC-derived islets) ;RT_PCR擴(kuò)增表明IPCs和IPC-derived islets轉(zhuǎn)錄胰島素1、II等因子，也表達(dá)與胰島發(fā)育和分化有關(guān)的因子Pdxl、β -半乳糖苷酶和酪氨酸輕化酶等。葡萄糖刺激，IPC-derived islets釋放insulin ;將300個(gè)IPC -derived islets移植在NOD成年小鼠腎囊內(nèi)，能降低NOD小鼠血糖，抗糖尿病。Bonner-Weir 等(Sci Med.2000, 97 (14):7999- 8004.PediatricDiabetes.2004, 5 (Supppl2): 16-22.)采用Ricordi分離法,成人胰腺導(dǎo)管插管，向胰尾組織內(nèi)注入I~2g/L V型膠原酶(2mL/g胰腺組織)，并將胰尾放入30°C Hank'緩沖液中，消化20~30min ；0.5mm孔徑濾沙過濾，離心，收集組織碎片和細(xì)胞；以Histopaque作不連續(xù)密度梯度離心，收集位于1.098~1.119g/mL界面間的細(xì)胞，分離出胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞；CMRL1066+10%FBS培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)，部分上皮樣細(xì)胞形成單層后，換用無血清DMEM/F12+lg/LITS (5mg/Linsulin+5mg/L 轉(zhuǎn)鐵蛋白 +5mg/L 硒)+2g/L 牛血清白蛋白 +IOmM 煙酰胺+10ng/mL角質(zhì)細(xì)胞生長因子+100U/mL青霉素+100ug/mL鏈霉素培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)；免疫化學(xué)反應(yīng)顯示上皮樣細(xì)胞表達(dá)CK19，少量散在細(xì)胞表達(dá)insulin和Pdxl ;體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，上皮樣細(xì)胞分化形成雙硫腙(dithizone, DTZ)染色陽性,且分泌insulin的胰島細(xì)胞團(tuán)。Rovira 等(Proc Natl Acad Sci USA.2010, 107 (I):75-80.Development.2005,132 (16): 3767-3776.)無菌取成年小鼠完整胰腺，0.2mg/mL膠原酶消化，500 μ m和105 μ m孔徑濾膜過濾，離心，WaymouthsMB752 +10%FBS +50%RTC+0.lmg/mL胰蛋白酶抑制劑+1 μ g/!1^地塞米松+100(^/1^青霉素+10(^8/1^鏈霉素培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，置于37° C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d ;采用ALDHl熒光標(biāo)記和干細(xì)胞鑒定試劑盒，并通過流式細(xì)胞儀篩選，獲得來源于小鼠胰腺導(dǎo)管末端/泡心部干細(xì)胞；PCR檢測該干細(xì)胞表達(dá)Sca-1、Sdf1、c-Met、nestin和Sox9基因；體外定向誘導(dǎo)，干細(xì)胞分化形成腺泡細(xì)胞，產(chǎn)生淀粉酶；分化形成胰島細(xì)胞，糖刺激，分泌insulin。Huch等(EMBO J.2013，32(20):2708-2721.)結(jié)扎成年小鼠部分胰腺導(dǎo)管，制備胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞增殖修復(fù)模型。無菌取胰腺組織，0.3mg/mLXI型膠原酶消化，分離獲得單個(gè)細(xì)胞；篩選去除上皮細(xì)胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)表達(dá)陰性細(xì)胞和白細(xì)胞分化抗原45、31 (cluster of differentiation45、31,CD45、31)表達(dá)陽性細(xì)胞，篩選去除EpCAM陽性和Zn+螯合物TSQ (6-methoxy-8-/7-toIuenesulfonamido- quilone, TSQ)陽性細(xì)胞，再篩選去除insulin啟動子表達(dá)陽性細(xì)胞后，獲得純度>99.6% 的胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞(EpCAM+、TSQ_);體外培養(yǎng)，這些干細(xì)胞已擴(kuò)增10個(gè)月；核型分析，細(xì)胞染色體數(shù)正常；流式細(xì)胞術(shù)檢測表達(dá)成體干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)gr5 ;移植在裸鼠腎囊內(nèi)，干細(xì)胞分化形成胰腺導(dǎo)管細(xì)胞和胰島內(nèi)分泌細(xì)胞。Lee等(Elife.2013 Nov19;2:e00940.do1:10.7554/eLife.00940.)采用去除胰島后的剩余人胰腺組織，0.05%胰蛋白酶、lU/mLdispase依次消化，收集細(xì)胞，⑶133標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)分選；RT_PCR檢測分選出的細(xì)胞共表達(dá)CK19，不表達(dá)腺泡細(xì)胞和胰島細(xì)胞標(biāo)記物，證實(shí)分離獲得人胰腺導(dǎo)管細(xì)胞；DMEM/F-12+50ng/mLEGF+500ng/mLSpondinI+ 50ng/mLFGF10+100ng/mLNoggin+10mM 尼克酸胺培養(yǎng)液擴(kuò)增，人胰腺導(dǎo)管細(xì)胞呈對數(shù)生長，傳7代；構(gòu)建Neur0g3腺病毒載體，轉(zhuǎn)染，人胰腺導(dǎo)管細(xì)胞轉(zhuǎn)分化形成胰島細(xì)胞，分泌insulin ;將誘導(dǎo)胰島移植在NOD成年小鼠腎囊內(nèi)，糖刺激，分泌人insulin。國內(nèi)，效梅等(中國科學(xué)C輯:生命科學(xué).2008，38 (8): 699-707.Science in China Series C: Life Science.2008，51 (9):779-788.分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào).2008，41 (6):450-457.分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào).2008，41 (6):457-464.解剖學(xué)報(bào).2009，40(2):55-58.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào).2009，29(2): 191-195.)報(bào)道IV型膠原酶消化人胎兒胰腺組織20~40min，收集單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)，低糖DMEM+3.7g/LNaHC03 +10%FBS+0.08g/L青霉素+0.lg/L鏈霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)原代上皮樣胰腺干細(xì)胞長出后，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，傳代。在傳代中逐漸消除成纖維樣細(xì)胞和其他細(xì)胞，純化上皮樣胰腺干細(xì)胞。采用克隆環(huán)篩選出典型的單克隆人胰腺干細(xì)胞，培養(yǎng)液中添加10ng/mLEGF擴(kuò)增培養(yǎng)，建立人胎兒胰腺干細(xì)胞系。免疫化學(xué)反應(yīng)和RT-PCR檢測該干細(xì)胞表達(dá)Pdxl、glucagon、nestin及CK19，不表達(dá)insulin、⑶34、⑶44及⑶45。β -巰基乙醇體外誘導(dǎo)，分化形成神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NF。煙酰胺誘導(dǎo)，分化形成DTZ染色陽性，分泌insulin和C肽的功能性類胰島。將單克隆人胰腺干細(xì)胞體外誘導(dǎo)胰島移植在STZ制備的糖尿病大鼠腎囊內(nèi)，能降低糖尿病大鼠血糖水平，延長壽命。李娟等(現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.2009,9(11):2024-2026.)膠原酶消化人胰腺組織，F(xiàn)icoll密度梯度離心，收集細(xì)胞，用含10% FBS的CMRL1066培養(yǎng)液培養(yǎng)，7~10d，較純的鵝卵石樣胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞擴(kuò)增至單層，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代。取2~3代細(xì)胞，熒光免疫化學(xué)反應(yīng)和RT-PCR檢測分離的人胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞表達(dá)CK19、Pdxl和nestin,不表達(dá)insulin和glucagon。陳海燕等(南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版.2008, 28(3):273-277) V型膠原酶灌注消化成年大鼠胰腺組織，F(xiàn)icoll密度梯度離心去除胰島，獲得較純的胰腺導(dǎo)管細(xì)胞。采用含10%NBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代，獲得第2代細(xì)胞。熒光免疫化學(xué)反應(yīng)顯示大鼠胰腺導(dǎo)管細(xì)胞表達(dá) CK19、Pdxl 和 nestin,不表達(dá) insulin、glucagon。RT-PCR 進(jìn)一步證實(shí)該細(xì)胞轉(zhuǎn)錄 CK19、Pdxl和nestin基因。陳旭春等(中華器官移植雜志.2012，33(6):371-375.)V型膠原酶消化分離大鼠胰腺組織，不連續(xù)密度梯度離心，初步分離胰腺導(dǎo)管細(xì)胞與胰島細(xì)胞。采用動力性三維培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，獲得胰腺導(dǎo)管來源干細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)、連續(xù)傳代和純化，建立細(xì)胞系。該細(xì)胞是單核細(xì)胞，成纖維樣貼壁生長，表達(dá)⑶29、⑶73、⑶90和⑶105，不表達(dá)⑶14、⑶19、⑶34和⑶45，證實(shí)該大鼠胰腺導(dǎo)管來源干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。目前，國內(nèi)尚無建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的報(bào)道，建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法還不成熟。本發(fā)明建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，將為進(jìn)一步建立人類和其它哺乳動物胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系及研究其生物學(xué)特性提供依據(jù)，這對于研究人類和其它哺乳動物胰腺發(fā)育、糖尿病的產(chǎn)生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，為進(jìn)一步建立人類和其它哺乳動物胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系及研究其生物學(xué)特性提供依據(jù)，這對于研究人類和哺乳動物胰腺發(fā)育、糖尿病的產(chǎn)生以及再造胰島微小器官移植治療糖尿病具有重要的意義。
[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，包括如下步驟: 1.大鼠胰腺導(dǎo)管原代上皮樣干細(xì)胞分離培養(yǎng)
無菌取大鼠胰腺組織，剪碎至Imm3，0.1% IV型膠原酶37°C消化20min，Dextron不連續(xù)密度梯度離心；收集11%和20%濃度Dextron分離液處細(xì)胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，大鼠胰腺導(dǎo)管原代上皮樣干細(xì)胞貼壁生長(圖1)；
2.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞純化
打開培養(yǎng)皿，將底部沾有凡士林的克隆環(huán)置于胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞區(qū)域內(nèi)，在克隆環(huán)孔中加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液，室溫消化3min ;收集克隆環(huán)中的細(xì)胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，純化的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞克隆性生長(圖2);生長至80%融合時(shí)，呈“鋪路石”樣(圖3)；
3.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞傳代培養(yǎng)
當(dāng)純化的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞生長至80%融合，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，收集的細(xì)胞接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF細(xì)胞培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)；1例大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞已傳80代；
4.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞冷凍保存
冷凍:80%DMEM+10%DMS0+10%NBS細(xì)胞冷凍液稀釋大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞至IX IO6個(gè)/mL，分裝于冷凍管，4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長期冷凍保存；
解凍:從液氮罐中取出大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLEGF培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)；臺盼藍(lán)染色檢測，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞解凍成活率為92% ；
5.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞形態(tài)特征
H.E染色，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞完全貼壁后，呈多角形上皮樣(圖4) ；Giemsa染色，細(xì)胞有一個(gè)圓形或橢圓形細(xì)胞核，細(xì)胞核內(nèi)有I~3個(gè)核仁(圖5)；
6.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞生長特性大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞克隆性生長；生長曲線表明細(xì)胞接種第I~2d生長緩慢，第3~6d呈對數(shù)生長，第7d增殖能力下降(圖6);
7.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞染色體數(shù)目
染色體標(biāo)本顯示大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞是正常的二倍體細(xì)胞，染色體數(shù)目2n=42(圖 7)；
8.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞表達(dá)特征
流式細(xì)胞術(shù)檢測和熒光免疫化學(xué)反應(yīng)顯示大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA,圖8)、八聚體轉(zhuǎn)錄因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,圖 9)、干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(Nanog,圖10)、角蛋白19 (Cytokeratin 19, CK19，圖11)和神經(jīng)源性分化因子2 (Neurogenicdifferentiation factor 2,NeuroD2,圖 12),不表達(dá) Pdxl、Pax4、Pax6、MafA、Ptfla、Ngn3、nestin、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 和secretin ;圖13是熒光免疫化學(xué)反應(yīng)陰性對照；
9.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞分化潛能
大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞具有多分化潛能，體外定向誘導(dǎo)，分化形成神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞；
9.1分化形成神經(jīng)細(xì)胞:采用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液體外定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6d，約有30%大鼠胰腺導(dǎo)管多角形上皮樣干細(xì)胞分化形成有突觸的神經(jīng)細(xì)胞(圖14)，突光免疫化學(xué)反應(yīng)表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(圖15);
9.2分化形成脂肪細(xì)胞:采用DMEM+10%NBS+1 umo I /L地塞米松+lug/Linsulin+
0.5mmol/LIBMX誘導(dǎo)液體外定向誘導(dǎo),誘導(dǎo)14d,大鼠胰腺導(dǎo)管多角形上皮樣干細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，脂滴小而分散；21d，約40%多角形上皮樣干細(xì)胞變?yōu)閳A形細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)脂滴增大、增多；27d，圓形細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯，油紅O染色陽性(圖16)；
9.3分化形成成骨細(xì)胞:采用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+10mmol/L β -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導(dǎo)液體外定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)5d，大鼠胰腺導(dǎo)管多角形上皮樣干細(xì)胞出現(xiàn)皺縮；10d，皺縮細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞分泌增多，并形成基質(zhì)樣結(jié)節(jié)；15d，形成明顯的島狀礦化結(jié)節(jié)；20d,島狀礦化結(jié)節(jié)菌素紅染色陽性(圖17), Vonkossa染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色(圖18)；
10.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞致瘤性
大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞無致瘤性；大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞接種在裸鼠背部皮下30d，解剖，眼觀未見瘤狀物。
[0005]上述的建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法建立的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的保藏號為C201457，保藏日期2014年4月2日，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0006]本發(fā)明的有益效果是:建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，將為進(jìn)一步建立人類和其它哺乳動物胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞系及研究其生物學(xué)特性提供依據(jù)，這對于研究人類和其它哺乳動物胰腺發(fā)育、糖尿病的產(chǎn)生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0007]本說明書共有18幅附圖，其中:
圖1大鼠胰腺導(dǎo)管原代上皮樣干細(xì)胞貼壁生長(X200);
圖2純化的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞克隆性生長(X100)；
圖3大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞生長至80%融合，呈“鋪路石”樣(X200)；
圖4大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞H.E染色形態(tài)特征(X 200)；
圖5大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞Giemsa染色形態(tài)特征(X 400)；
圖6大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞生長曲線；
圖7大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞染色體數(shù)目2n=42 ；
圖8流式細(xì)胞術(shù)檢測，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞表達(dá)PCNA ；
圖9流式細(xì)胞術(shù)檢測，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞表達(dá)0ct4 ；
圖10突光免疫化學(xué)反應(yīng)，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞表達(dá)Nanog ( X 200)；
圖11熒光免疫化學(xué)反應(yīng)，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞表達(dá)CK19 (X200)； 圖12熒光免疫化學(xué)反應(yīng)，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞表達(dá)NeuroD2 (X200)；
圖13熒光免疫化學(xué)反應(yīng)陰性對照(X 200)；
圖14體外定向誘導(dǎo)，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞分化形成有突觸的神經(jīng)細(xì)胞(X200)；
圖15熒光免疫化學(xué)反應(yīng)，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞分化形成的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)NSE(X200)；
圖16體外定向誘導(dǎo)，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞分化形成脂肪細(xì)胞，油紅O染色陽性(X200)；
圖17體外定向誘導(dǎo)，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞分化形成成骨細(xì)胞，茜素紅染色陽性(X100)；
圖18大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞分化形成成骨細(xì)胞，Vonkossa染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色(X100)。
【具體實(shí)施方式】
[0008]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。
[0009]實(shí)施例1
1.大鼠胰腺導(dǎo)管原代上皮樣干細(xì)胞分離培養(yǎng)
無菌取SD成年大鼠胰腺組織，剪碎至Imm3，0.1% IV型膠原酶37 V消化20min，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液終止消化。100目孔徑濾紗過濾，離心(lOOOrpm，5min)，PBS (-)洗漆2次。25%濃度Dextron分離液重懸細(xì)胞,依次加入23%、20%、11%濃度Dextron分離液以及PBS (-),不連續(xù)密度梯度離心(1500rpm, 5min),收集11%和20%濃度Dextron分離液處細(xì)胞，離心(lOOOrpm, 5min),洗滌。RPMI1640+10%NBS稀釋細(xì)胞至I X IO6個(gè)/mL，接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，置于37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3~5d，大鼠胰腺導(dǎo)管原代上皮樣干細(xì)胞貼壁生長(圖1)。
[0010]2.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞純化打開培養(yǎng)皿，將底部沾有凡士林的克隆環(huán)置于胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞區(qū)域內(nèi)。在克隆環(huán)孔中加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液，室溫消化3min，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液終止消化，收集克隆環(huán)中的細(xì)胞懸液，離心(lOOOrpm，5min)。RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。3~5d，純化的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞克隆性生長(圖2)。生長至80%融合時(shí)，呈“鋪路石”樣(圖3)。
[0011]3.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞傳代培養(yǎng)
當(dāng)純化的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞生長至80%融合，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化3min，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液終止消化，離心(lOOOrpm，5min)。收集的細(xì)胞按1 X IO6個(gè)/mL細(xì)胞密度接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mL EGF細(xì)胞培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0012]4.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞冷凍保存
冷凍:大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，PBS (-)清洗，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液終止消化，離心(lOOOrpm，5min)。80%RPMI1640+10%DMS0+10%NBS冷凍液稀釋細(xì)胞至1 X IO6個(gè)/mL，分裝于冷凍管。4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長期冷凍保存。
[0013]解凍:從液氮罐中取出大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI1640+10%NBS 培養(yǎng)液清洗解凍細(xì)胞 2 ~3 遍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLEGF 培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)。取少量細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色檢測，細(xì)胞解凍成活率為92%。
[0014]采用以上分離、純化、傳代培養(yǎng)及冷凍保存技術(shù)，已獲得大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞。其中，1例大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系已穩(wěn)定擴(kuò)增1年以上，傳80代，冷凍保存100管細(xì)胞，約1XlO8個(gè)細(xì)胞。
[0015]5.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞形態(tài)特征
H.Ε染色:大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞完全貼壁后，呈多角形上皮樣(圖4)。染色方法參照司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[Μ].世界圖書出版公司.2007.略；
Giemsa染色:大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞有一個(gè)圓形或橢圓形細(xì)胞核，核內(nèi)有1~3個(gè)核仁(圖5)。染色方法參照R.1.弗雷謝尼.動物細(xì)胞培養(yǎng)-基本技術(shù)指南[Μ].科學(xué)出版社.2008.略。
6.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞生長特性
大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞克隆性生長。生長曲線表明細(xì)胞接種第I~2d生長緩慢，第3~6d呈對數(shù)生長，第7d增殖能力下降(圖6)。
[0016]生長曲線測定方法:解凍復(fù)活第20、40、60代大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞，RPMI1640+ 10%NBS+10ng/mLEGF培養(yǎng)液分別稀釋細(xì)胞至1X 1O4個(gè)/mL。取96孔板7個(gè)，每個(gè)板上分別接種3種不同代數(shù)的細(xì)胞，每代設(shè)6個(gè)孔，每孔加100 μ L細(xì)胞懸液，并設(shè)陰性對照(基礎(chǔ)培養(yǎng)液，無細(xì)胞)，置于37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此時(shí)記為0d。每24h取出一塊培養(yǎng)板，采用CCK-8法測定細(xì)胞吸光度值(0D值)，共測7d。測定時(shí)，每孔加10μ LCCK-8后，置于37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中作用2h，在酶標(biāo)儀上測定450nm處OD值。以時(shí)間Cd)為橫坐標(biāo)，吸光度值(OD)為縱坐標(biāo)，繪制大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞生長曲線圖。
[0017]7.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞染色體數(shù)目
染色體標(biāo)本顯示大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞是正常的二倍體細(xì)胞，染色體數(shù)目2n=42(圖 7)。
[0018]大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞按IX IO5個(gè)/ mL細(xì)胞密度接種于鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，貼壁培養(yǎng)。擴(kuò)增至80%融合時(shí)，加入終濃度為0.1 μ g/mL秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)5h，使多數(shù)細(xì)胞染色體停于中期分裂相。0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液室溫消化3min，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液終止消化，離心。棄上清，加入0.4%KC1，并置于37°C水域中，低滲30min，離心。棄上清，加甲醇-冰醋酸固定液(甲醇:冰醋酸=3: 1，現(xiàn)用現(xiàn)配)，混勻，靜置固定20min，離心。如此反復(fù)固定2~3次。棄上清，加0.5mL固定液，混勻，制成染色體懸液。取冰凍載玻片，于約80cm高度滴片,火焰干燥。滴加Giemsa染色液,染色lOmin。普通生物學(xué)顯微鏡下觀察染色體標(biāo)本，照相。
[0019]8.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞表達(dá)特征
流式細(xì)胞術(shù)檢測和熒光免疫化學(xué)反應(yīng)顯示大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA,圖8)、八聚體轉(zhuǎn)錄因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,圖 9)、干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(Nanog,圖10)、角蛋白19 (Cytokeratin 19, CK19,圖11)和神經(jīng)源性分化因子2 (Neurogenicdifferentiation factor 2,NeuroD2,圖 12),不表達(dá) Pdxl、Pax4、Pax6、MafA、Ptfla、Ngn3、nestin、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 和secretin。圖13是熒光免疫化學(xué)反應(yīng)陰性對照。
[0020]8.1流式細(xì)胞術(shù)檢測
根據(jù)所購特異性抗體是否帶熒光標(biāo)記，采用直接免疫熒光標(biāo)記法或間接免疫熒光標(biāo)記法檢測。 [0021]8.1.1直接免疫熒光標(biāo)記法
直接免疫熒光標(biāo)記法檢測大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，不表達(dá) MafA、CD117、CD15、CD34 和 CD45。
[0022]PBS(-)洗滌大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞2次，稀釋細(xì)胞至I X IO6個(gè)/mL。取EP管7個(gè)，分別加入ImL細(xì)胞懸液，離心(lOOOrpm, 5min)。棄上清，分別加入200uL含1%BSA的PBS(-)稀釋的熒光素標(biāo)記抗體(5uL/1OOuL稀釋的小鼠抗人PCNA熒光抗體、0.25ug/1OOuL稀釋的金黃地鼠抗小鼠MafA熒光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人CD117熒光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人CD 15熒光抗體、5uL/1 OOuL稀釋的小鼠抗人CD34熒光抗體或5uL/100uL稀釋的小鼠抗人⑶45突光抗體,均購自eBioscience公司)，陰性對照加PBS(-),混勻，4°C孵育 30min,離心(lOOOrpm, 5min)。棄上清,PBS (-)洗漆細(xì)胞 2 次,離心(lOOOrpm, 5min),以除去未結(jié)合的多余抗體。每管分別加0.5mLPBS(_)重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(FACS Canto II,BD，美國)檢測陽性細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0023]8.1.2間接免疫熒光標(biāo)記法
間接免疫熒光標(biāo)記法檢測大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞表達(dá)八聚體轉(zhuǎn)錄因子4 (0ct4)不表達(dá)Pax4和Pax6。
[0024]PBS(-)洗滌大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞2次，稀釋細(xì)胞至I X IO6個(gè)/mL。取EP管4個(gè),分別加入ImL細(xì)胞懸液,離心(lOOOrpm, 5min)。棄上清，分別加入200uL含1%BSA的PBS (_)稀釋的無熒光素標(biāo)記的一抗(1:100稀釋的兔抗人0ct4和1:500稀釋的兔抗大鼠Pax6,購自Epitomics公司；1:50兔抗人Pax4,購自Abgent公司)，陰性對照加PBS (-),混勻，4°C孵育30min，離心(lOOOrpm，5min)。棄上清，PBS (-)洗滌細(xì)胞2次，離心(lOOOrpm，5min)，以除去未結(jié)合的多余抗體。棄上清，加入200uL含I %BSA的PBS (_)稀釋的熒光素標(biāo)記二抗(1: 100稀釋的羊抗兔突光二抗,購自Epitomics公司)，陰性對照加PBS (-),混勻，4°C孵育30min，離心(lOOOrpm，5min)。棄上清，PBS (-)洗滌細(xì)胞2次，離心(lOOOrpm，5min)，以除去未結(jié)合的多余抗體。每管分別加0.5mLPBS (_)重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(FACSCanto II，BD，美國)檢測陽性細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0025]8.2突光免疫化學(xué)反應(yīng)
對于購買不到流式細(xì)胞術(shù)檢測的抗體，則購買熒光免疫化學(xué)反應(yīng)抗體檢測。
[0026]熒光免疫化學(xué)反應(yīng)顯示大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(Nanog)、細(xì)胞角蛋白19 (CK19)和神經(jīng)源性分化因子2 (NeuroD2)，不表達(dá)Pdxl、Ptfla、Ngn3、nestin、Sox2、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 及 secretin。
[0027]在鋪有0.1 %明膠的培養(yǎng)皿中放入蓋玻片，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞按IX IO5個(gè)/ HiL細(xì)胞密度接種在放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中。當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞爬片15min。PBS (-)洗滌細(xì)胞爬片2次，l%Triton_X100穿孔30min, 1%BSA封閉45min。洗掉多余封閉液，加含1%BSA的PBS (_)稀釋的一抗(1:100稀釋的兔抗人NanogU:300稀釋的兔抗大鼠NeuroD2、1:100稀釋的兔抗人Sox2或1:100稀釋的兔抗人somatostatin,均購自Epitomics公司；20 μ g/mL稀釋的小鼠抗人CK19或20 μ g/mL稀釋的小鼠抗人Pdxl,購自eBioscie nce公司；3 μ g/mL稀釋的小鼠抗人Ptf la、1:100稀釋的小鼠抗人Ngn3、5 μ g/mL稀釋的小鼠抗人ghrelin或1:100稀釋的兔抗人secretin,均購自Abcam公司；1:500稀釋的小鼠抗大鼠insulin或1:500稀釋的兔抗大鼠glucagon,購自Boster公司；1:300稀釋的小鼠抗大鼠nestin,購自Novus公司)，陰性對照加PBS(-),4°C過夜。PBS (_)洗滌3次，每次3min。加含1%BSA的PBS (_)稀釋的熒光二抗(1: 1000稀釋的羊抗小鼠突光二抗，購自Novu公司或1:100稀釋的羊抗兔突光二抗,購自Epitomics公司)，陰性對照加PBS(-)，37°C孵育lh。PBS (_)漂洗3次，每次3min，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，照相。
[0028]9.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞分化潛能
大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞具有多分化潛能，體外定向誘導(dǎo)，分化形成神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。
[0029]9.1分化形成神經(jīng)細(xì)胞
分化形成神經(jīng)細(xì)胞:采用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液體外定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6d，約有30%大鼠胰腺導(dǎo)管多角形上皮樣干細(xì)胞分化形成有突觸的神經(jīng)細(xì)胞(圖14)，熒光免疫化學(xué)反應(yīng)表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(圖15)。
[0030]大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞按I X IO5個(gè)/ mL細(xì)胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，換DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，隔天換液。誘導(dǎo)6d，約有30%大鼠胰腺導(dǎo)管多角形上皮樣干細(xì)胞分化形成有突觸的神經(jīng)細(xì)胞，熒光免疫化學(xué)反應(yīng)表達(dá)NSE。
[0031]9.2分化形成脂肪細(xì)胞
分化形成脂肪細(xì)胞:采用 DMEM+10%NBS+lumol/L 地塞米松 +lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX誘導(dǎo)液體外定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)14d，大鼠胰腺導(dǎo)管多角形上皮樣干細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，脂滴小而分散；21d，約40%多角形上皮樣干細(xì)胞變?yōu)閳A形細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)脂滴增大、增多；27d，圓形細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯，油紅O染色陽性(圖16)。
[0032]大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞按IX IO5個(gè)/ mL細(xì)胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，換DMEM+10%NBS+lumol/L地塞米松+lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，隔天換液。誘導(dǎo)14d,大鼠胰腺導(dǎo)管多角形上皮樣干細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，脂滴小而分散；21d，約40%多角形上皮樣干細(xì)胞變?yōu)閳A形細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)脂滴增大、增多；27d，圓形細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯，油紅O染色陽性。
[0033]9.3分化形成成骨細(xì)胞
分化形成成骨細(xì)胞:采用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導(dǎo)液體外定向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)5d，大鼠胰腺導(dǎo)管多角形上皮樣干細(xì)胞出現(xiàn)皺縮；10d，皺縮細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞分泌增多，并形成基質(zhì)樣結(jié)節(jié)；15d，形成明顯的島狀礦化結(jié)節(jié)；20d，島狀礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色陽性(圖17)，Vonkossa染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色(圖 18)。
[0034]大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞按I X IO5個(gè)/ mL細(xì)胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，換RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo)培養(yǎng),隔天換液。誘導(dǎo)5d，大鼠胰腺導(dǎo)管多角形上皮樣干細(xì)胞出現(xiàn)皺縮；10d，皺縮細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞分泌增多，并形成基質(zhì)樣結(jié)節(jié)；15d,形成明顯的島狀礦化結(jié)節(jié)；20d,島狀礦化結(jié)節(jié)菌素紅染色陽性，Vonkossa染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色。
[0035]10.大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞致瘤性
大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞無致瘤性。大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞接種在裸鼠背部皮下30d，解剖，眼觀未見瘤狀物。
[0036]在6只裸鼠背部皮下分別注射大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞，劑量為I X IO6個(gè)/0.2mL/site, 3只裸鼠背部皮下注射0.2mL細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640作為對照，正常飼養(yǎng)管理30d。結(jié)果，6只實(shí)驗(yàn)裸鼠和3只對照裸鼠均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，解剖觀察，均未見瘤狀物。
【權(quán)利要求】
1.建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)大鼠胰腺導(dǎo)管原代上皮樣干細(xì)胞分離培養(yǎng) 無菌取大鼠胰腺組織，剪碎至1mm3，膠原酶消化，Dextron不連續(xù)密度梯度離心，收集Dextron分離液處細(xì)胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，大鼠胰腺導(dǎo)管原代上皮樣干細(xì)胞貼壁生長； (2)大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞純化 打開培養(yǎng)皿，將底部沾有凡士林的克隆環(huán)置于胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞區(qū)域內(nèi)，在克隆環(huán)孔中消化，收集克隆環(huán)中的細(xì)胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，RPMI1640+10%NBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，純化的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞克隆性生長；當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，呈“鋪路石”樣； (3)大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞傳代培養(yǎng) 當(dāng)純化的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞生長至80%融合，加入胰蛋白酶消化液消化，收集的細(xì)胞接種在鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)；1例大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞已傳80代； (4)大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞冷凍保存 冷凍:用細(xì)胞冷凍液稀釋大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞，分裝于冷凍管，平衡，投入液氮長期冷凍保存； 解凍:從液氮罐中取出大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLEGF培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)；臺盼藍(lán)染色檢測，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞解凍成活率為92%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，其特征在于: 步驟(1)所述的膠原酶消化是指加入0.1% IV型膠原酶，在37°C條件下，消化20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，其特征在于:步驟(I)所述的收集Dextron分離液處細(xì)胞是指收集11%和20%濃度Dextron分離液處細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，其特征在于:步驟(2)所述的消化是指加入0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA消化液，室溫消化3min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，其特征在于:步驟(3)所述的細(xì)胞培養(yǎng)液是指RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，其特征在于: 步驟(4)所述的細(xì)胞冷凍液是指80%DMEM+10%DMS0+10%NBS。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的方法，其特征在于: 步驟(4)所述的平衡是指4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法建立的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系的保藏號為C201457，保藏日期2014年4月2日，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保減中心。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系形態(tài)特征為:大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞貼壁呈多角形上皮樣，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，細(xì)胞核 內(nèi)有I~3個(gè)核仁。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞生長特性為:大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞克隆性生長；細(xì)胞接種第I~2d生長緩慢，第3~6d呈對數(shù)生長，第7d增殖能力開始下降。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞染色體數(shù)目為:大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞是正常的二倍體細(xì)胞，染色體數(shù)目2n=42。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞表達(dá)特征為:大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、八聚體轉(zhuǎn)錄因子 4(0ctamer_bindingtranscription factor 4, 0ct4)、干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(Nanog)、角蛋白 19 (Cytokeratin 19,CK19)和神經(jīng)源性分化因子 2 (Neurogenic differentiation factor 2, NeuroD2),不表達(dá) Pdxl、Pax4、Pax6、MafA、Ptfla、Ngn3、nestin、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 和 secretin。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞分化潛能為:大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞具有多分化潛能，體外定向誘導(dǎo)，大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞分化形成有突觸的神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NSE;分化形成含有脂滴的脂肪細(xì)胞，油紅O染色陽性；分化形成成骨細(xì)胞，產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽性，Vonkossa染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞系，其特征在于:所述的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞致瘤性為:大 鼠胰腺導(dǎo)管上皮樣干細(xì)胞無致瘤性。
【文檔編號】C12N5/071GK103881962SQ201410138851
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】效梅, 安立龍 申請人:廣東海洋大學(xué)