一種黃酒用雙功能酶交聯(lián)酶聚集體的制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種黃酒用雙功能酶交聯(lián)酶聚集體的制備與應(yīng)用，屬于酶制劑、釀酒添加劑【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明從普羅威登斯菌（Providencia?sp.）JNB815中提取具有降解尿素和氨基甲酸乙酯(EC)活性的游離脲酶粗酶液,證明該游離脲酶為具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶活性的雙功能酶。這種雙功能酶利用無載體固定化技術(shù)制成交聯(lián)酶聚集體，該交聯(lián)酶聚集體應(yīng)用于黃酒中，可同時去除其中的尿素和氨基甲酸乙酯。該交聯(lián)酶聚集體對尿素的去除率初次使用可達(dá)85.35%，使用6次后尿素去除率仍能達(dá)69.30%。對EC的去除率最高可達(dá)46.27%，經(jīng)交聯(lián)酶聚集體處理后的黃酒，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)無明顯變化。
【專利說明】一種黃酒用雙功能酶交聯(lián)酶聚集體的制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種黃酒用雙功能酶的純化及交聯(lián)酶聚集體的制備與應(yīng)用，屬于酶制劑、釀酒添加劑【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國人民生活水平的提高，酒類飲料等發(fā)酵食品的消費(fèi)量日趨上升。在發(fā)酵生產(chǎn)酒精飲料的過程中，有許多不需要的副產(chǎn)品，尿素就是其中之一，尿素在酸性條件下、高溫滅菌、蒸餾過程或長時間儲存過程中，容易和乙醇形成氨基甲酸乙酯。
[0003]氨基甲酸乙酯(EC)，是2A類致癌性的物質(zhì)，微量存在于大部分發(fā)酵食品和酒精飲料中。國外許多國家(加拿大、美國、日本、歐盟等)和組織已經(jīng)對發(fā)酵食品和酒精飲料中氨基甲酸乙酯作了限量要求，因此我國對各種不同產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的含量進(jìn)行檢測勢在必行。
[0004]我國黃酒中90%以上的氨基甲酸乙酯是來源于酒中所含尿素與乙醇的反應(yīng):。因此利用脲酶將飲料酒中的尿素及時除去，對于控制酒中氨基甲酸乙酯的生成具有重要意義。采用酒用酸性脲 酶處理煎酒前的黃酒，可除去黃酒中大部分尿素，減少生成EC的可能性，而EC降解酶則能直接有效的分解成品黃酒中已經(jīng)產(chǎn)生的EC。已有研究報道腸桿菌Enterobacter sp.R-SYB082能產(chǎn)生一種酸性脲酶同功酶,可實(shí)現(xiàn)同時去除黃酒中底物尿素及產(chǎn)物EC。
[0005]交聯(lián)酶聚集體由荷蘭Delft大學(xué)Sheldon小組提出。采用物理方法沉淀酶蛋白，得到酶聚集體，再用交聯(lián)劑交聯(lián)，制備交聯(lián)酶聚集體。其活性和穩(wěn)定性可與交聯(lián)酶晶體技術(shù)相媲美，制備過程不需要復(fù)雜耗時的結(jié)晶、純化步驟，是一種低成本、易操作、高活性和穩(wěn)定性的新型酶固定化方法。具有對酶純度要求低、無需載體、單位體積活性高、空間效率高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明采用(Providencia sp.) JNB815中提取的游離酶制成交聯(lián)酶聚集體,能夠同時降解黃酒中的尿素和氨基甲酸乙酯，對黃酒中EC的控制具有雙重效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種黃酒用雙功能酶的純化工藝及交聯(lián)酶聚集體的制備與應(yīng)用方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案，一種天然材料復(fù)合體系固定化酒用雙功能酶的制備方法，將從(Providencia sp.) JNB815菌體細(xì)胞破碎液中提取的游離酶，經(jīng)乙醇分級沉淀、DEAE-FF離子交換層析、Superdex 200凝膠層析進(jìn)行純化和SDS-PAGE凝膠電泳驗證,初步證明為同一種具有兩種酶活性的雙功能酶。游離酶經(jīng)乙醇沉淀和京尼平交聯(lián)，制成交聯(lián)酶聚集體。
[0008]1.其工藝為:
(I)游離脲酶提取:
菌種普羅威登斯菌(Providencia sp.) JNB815 ;該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC N0.8326。[0009]種子培養(yǎng):種子培養(yǎng)基組成以g/L計:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2P04 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用NaOH調(diào)pH 7.0，用純水配制；接種量3%，37°C搖床培養(yǎng) 8-12 h，轉(zhuǎn)速 150 rpm ；
發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2P042，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸錳0.05，六水硫酸鎳0.05，HCl調(diào)ρΗ5.5，用純水配制；接種量5%，37°C搖床培養(yǎng)20-24 h，轉(zhuǎn)速150 rpm ；
以上菌種經(jīng)種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)后，所得發(fā)酵液在4°C、8000rpm離心5 min后，棄去上清液，所得菌體用去離子水洗滌兩次，再用pH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，8000r/min離心5min后獲得全細(xì)胞；將獲得的全細(xì)胞用檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液稀釋到原發(fā)酵液體積的1/10，重新懸浮菌體，攪勻，進(jìn)行超聲波破碎；超聲波破碎條件為300W、15min,破碎時間3s、間隔時間3s,處理量35mL ;破碎液在4°C、1000Orpm離心20min,收集上清液，即得到游離脲酶粗酶液；
(2)游離脲酶的純化:
a、乙醇分級沉淀:將步驟(1)中由{Providenciasp.) JNB815所提取的游離脲酶粗酶液，依次采用質(zhì)量濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇分級沉淀，10000r/min離心20min,所得沉淀復(fù)溶于pH6.8、25mmol.L-1磷酸鈉緩沖液中，測定上清液的酶活并繪制醇沉曲線；
b、DEAE-FF離子交換層析=DEAE-FF層析柱預(yù)先以pH6.8、25mmol.L—1磷酸鈉緩沖液平衡完全，將5mL醇沉得到的酶液上樣，用所述磷酸鈉緩沖液配制的O~1.0 mo 1-L-1的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL .min-1,收集蛋白峰，測定各峰脲酶和EC降解酶酶活，合并有酶活部分，4°C保存?zhèn)溆茫?br> c、Superdex200凝膠過濾層析:以pH6.8、25mmol.L-1磷酸鈉緩沖液平衡Superdex200層析柱2~3個柱體積，完全平衡后，將ImL步驟b收集的酶液加到層析柱上，以磷酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，收集、合并有酶活部分，超濾濃縮得到純化后的游離脲酶，4°C保存?zhèn)溆茫?br> (3)交聯(lián)酶聚體的制備:步驟(2)c所得游離脲酶用質(zhì)量濃度為10%的乙醇去除雜質(zhì)后，采用終濃度為60%的乙醇進(jìn)行沉淀，所得沉淀復(fù)溶于5ml含60%乙醇的pH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，加入反應(yīng)體系總體積的0.3% (m/v)的京尼平(Genipin，分子式C11H14O5),室溫下進(jìn)行交聯(lián)2.5h，混合溶液放置到4°C冰箱中生成交聯(lián)酶聚集體CLEAs ；在10000 r.min-1離心20min后棄上清，沉淀用超純水洗滌兩次，離心獲得交聯(lián)酶聚集體CLEAs，于4 °C冰箱中貯存。
[0010]2.純化酶的性質(zhì):采用10%的乙醇去雜后，收集乙醇終濃度在10%_60%之間的沉淀具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶的活性。DEAE-FF離子交換層析時，在0.35 mol.L'
0.55 mo 1.L-1時各出現(xiàn)一個洗脫峰，洗脫濃度0.35 mo 1.L-1時出現(xiàn)的洗脫峰具有脲酶和EC酶酶活。Superdex 200凝膠層析時，在洗脫體積為7.2 mL左右出現(xiàn)一個大峰，具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶這兩種活性。該洗脫體積對應(yīng)Superdex 200凝膠柱的外水體積。以上三步純化的過程中，兩種酶的活性峰重疊，分子量一致。由SDS-PAGE電泳可以看出，經(jīng)過乙醇分級沉淀，分離效果較為明顯，去除了部分雜質(zhì)；DEAE-FF分離后，去除了兩三種雜蛋白，各條帶分界清晰，能看到若干主要條帶；經(jīng)由Superdex 200分離最終得到的活性峰純化倍數(shù)較高，目的條帶數(shù)為2條，推測可能為同一種酶的兩種不同大小的亞基。[0011]游離酶酶活測定方法:采用靛酹藍(lán)反應(yīng)(Berthelot reaction)比色法。
[0012]酶活力定義:在常壓，37°C，pH4.5條件下，每分鐘分解底物尿素或氨基甲酸乙酯產(chǎn)生IMfflol氨為一個酶活力單位。其中，尿素降解酶和EC降解酶活力的測定分別采用尿素和EC為底物。
[0013]交聯(lián)酶聚集體酶活測定方法:取0.1 g交聯(lián)酶聚集體分別浸入一定體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制的PH4.5的3%的尿素或EC溶液中，在37°C恒溫水浴箱中保溫20min后，10000 r.min—1離心取其上清，余下的測定步驟與游離酶活力測定步驟相同。酶活力定義同游離酶。
[0014]蛋白質(zhì)含量的測定:采用考馬斯亮藍(lán)染色法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
[0015]尿素含量的測定方法:二乙酰一肟法。
[0016]EC含量的測定方法:采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。
[0017]黃酒中風(fēng)味物質(zhì)的測定:采用頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。
[0018]3、制備得到的黃酒用雙功能酶交聯(lián)酶聚集體的應(yīng)用:取市售黃酒溶液,裝于反應(yīng)容器中，加入25 mg.L4交聯(lián)酶聚集體,每反應(yīng)6 h為一批次，以10000 r.mirT1離心20min回收CLEAs，并加入同種新批次黃酒進(jìn)行處理，重復(fù)多次,測定每次所回收的CLEAs質(zhì)量和黃酒的尿素去除率，反應(yīng)6批次后CLEAs濕重僅減少0.18 g，沒有明顯變化；說明交聯(lián)酶聚集體的穩(wěn)定性較好，在使用過程中沒有發(fā)生酶的泄漏或溶解現(xiàn)象。
[0019]所述交聯(lián)酶聚集體對尿素的去除率初次使用可達(dá)85.35%,使用6次后尿素去除率仍能達(dá)69.30% ;對EC的去除率最高達(dá)46.27%，重復(fù)使用性較好；經(jīng)交聯(lián)酶聚集體處理后的黃酒，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)無明顯變化。
[0020]本發(fā)明的有益效果:該雙功能酶制成交聯(lián)酶聚集體后，能在酒中穩(wěn)定發(fā)揮作用。在黃酒中加入交聯(lián)酶聚集體后對尿素的去除率初次使用可達(dá)85.35%，使用6次后尿素去除率仍能達(dá)69.30%ο對EC的去除率最高可達(dá)46.27%，且交聯(lián)酶聚集體便于回收，可重復(fù)利用多次。本發(fā)明可以不改變原釀造酒的工藝條件，不改變酒的風(fēng)味，在勾兌，澄清酒的過程中，添加交聯(lián)酶聚集體，就可以降低尿素和EC含量。且相對于其他的固定化方法來說，成本較低，是一種較為理想的同時去除酒中尿素和EC的方法。
[0021]生物材料樣品保藏:一株產(chǎn)酸性脲酶和EC降解酶的菌株，分類命名為普羅威登斯菌(Providencia sp.)JNB815,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，其保藏編號為=CGMCC N0.8326，保藏日期為2013年10月12日。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1醇沉曲線。
[0023]圖2脲酶的DEAE-FF離子交換層析圖譜。
[0024]圖3脲酶的Superdex 200凝膠層析圖譜。
[0025]圖4 SDS-PAGE 電泳圖。UMarker ;2、粗酶；3、醇沉；4, DEAE ；5, Superdex 200。
[0026]圖5 CLEAs應(yīng)用于膜反應(yīng)器中的工藝流程圖。
[0027]圖6黃酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)圖譜。(a圖表示原黃酒，b圖表示交聯(lián)酶聚集體處理后的黃酒)。【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1
游離酶提取:保藏編號為=CGMCC N0.8326的普羅威登斯菌sp.)JNB815菌種經(jīng)過種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)獲得一定量菌體，將發(fā)酵液4°C、8000rpm離心5 min后，棄上清，所得菌體用去離子水洗滌兩次，PH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，離心獲得全細(xì)胞；將獲得的全細(xì)胞用pH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋到原發(fā)酵液體積的1/10，重新懸浮菌體，攪勻，進(jìn)行超聲波破碎，超聲波破碎條件為300 W、15min，破碎時間3 S、間隔時間3 s,處理量35 mL ;破碎液在4°C、10000 rpm離心20 min,收集上清液，即為游離脲酶粗酶液；
'miPl'ovichnciei sp.) JNB815所提取的游離脲酶，經(jīng)乙醇分級沉淀、DEAE-FF離子交換層析、Superdex 200凝膠過濾層析。尿酶和氨基甲酸乙酯降解酶的醇沉分級范圍相同，活性峰重疊。初步證明具有這兩種活性的酶為同一種雙功能酶。具體步驟為:
乙醇分級沉淀:將由{Providencia sp.) JNB815所提取的游離脲酶，依次采用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇分級沉淀，離心，所得沉淀復(fù)溶于pH6.8、25mmol.L-1磷酸鈉緩沖液中,測定上清液的酶活并繪制醇沉曲線，曲線如圖1所示。
[0029]DEAE-FF離子交換層析:DEAE_FF層析柱預(yù)先以25 mmol.L—1、pH6.8磷酸鈉緩沖液平衡完全，將5 mL醇沉得到的酶液上樣，用O~1.0 mol.L-1的NaCl (磷酸鈉平衡緩沖液配制)溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL 收集蛋白峰，測定各峰酶活，合并有酶活部分，4°C保存?zhèn)溆茫迕傅腄EAE-FF離子交換層析圖譜如圖2所示。
[0030]Superdex 200凝膠過濾層析:以25 mmol.L-1磷酸鈉緩沖液(ρΗ6.8)平衡Superdex 200層析柱2~3個柱體積，完全平衡后，將I mL DEAE-FF離子交換層析步驟收集的酶液加到層析柱上，以磷酸鈉平衡緩沖液進(jìn)行洗脫，收集、合并有酶活部分，超濾濃縮后4°C保存?zhèn)溆谩ｋ迕傅腟uperdex 200凝膠層析圖譜如圖3所示。{Providencia sp.)JNB815產(chǎn)酶的純化結(jié)果如表1所示。
[0031]表1 Providencia sp.JNB815 產(chǎn)酶的純化結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種黃酒用雙功能酶交聯(lián)酶聚集體的制備方法，其特征在于步驟為: (1)游離脲酶提取: 菌種普羅威登斯菌(jDroriofeflcia sp.) JNB815 ;該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC N0.8326 ； 種子培養(yǎng):種子培養(yǎng)基組成以g/L計:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2P042，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用NaOH調(diào)pH 7.0，用純水配制；接種量3%，37°C搖床培養(yǎng)8_12h,轉(zhuǎn)速 150 rpm ； 發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO42，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸錳0.05，六水硫酸鎳0.05，HCl調(diào)ρΗ5.5，用純水配制；接種量5%，37°C搖床培養(yǎng)20-24 h，轉(zhuǎn)速150 rpm ； 以上菌種經(jīng)種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)后，所得發(fā)酵液在4°C、8000rpm離心5 min后，棄去上清液，所得菌體用去離子水洗滌兩次，再用PH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌一次，8000r/min離心5min后獲得全細(xì)胞；將獲得的全細(xì)胞用檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液稀釋到原發(fā)酵液體積的1/10，重新懸浮菌體，攪勻，進(jìn)行超聲波破碎；超聲波破碎條件為300W、15min,破碎時間3s、間隔時間3s,處理量35mL ;破碎液在4°C、1000Orpm離心20min,收集上清液，即得到游離脲酶粗酶液； (2)游離脲酶的純化: a、乙醇分級沉淀:將步驟(1)中由{Providenciasp.) JNB815所提取的游離脲酶粗酶液，依次采用質(zhì)量濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇分級沉淀，10000r/min離心20min,所得沉淀復(fù)溶于pH6.8、25mmol.L-1磷酸鈉緩沖液中，測定上清液的酶活并繪制醇沉曲線； b、DEAE-FF離子交換層析=DEAE-FF層析柱預(yù)先以pH6.8、25mmol.L—1磷酸鈉緩沖液平衡完全，將5mL醇沉得到的酶液上樣，用所述磷酸鈉緩沖液配制的O~1.0 mo 1-L-1的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL IirT1,收集蛋白峰，測定各峰脲酶和EC降解酶酶活，合并有酶活部分，4°C保存?zhèn)溆茫? c、Superdex200凝膠過濾層析:以pH6.8、25mmol.L-1磷酸鈉緩沖液平衡Superdex200層析柱2~3個柱體積，完全平衡后，將ImL步驟b收集的酶液加到層析柱上，以磷酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，收集、合并有酶活部分，超濾濃縮得到純化后的游離脲酶，4°C保存?zhèn)溆茫? (3)交聯(lián)酶聚集體的制備:步驟(2)c所得游離脲酶用質(zhì)量濃度為10%的乙醇去除雜質(zhì)后，采用終濃度為60%的乙醇進(jìn)行沉淀，所得沉淀復(fù)溶于5mL含60%乙醇的pH4.5、50mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，加入反應(yīng)體系總體積的0.3%，m/v,的京尼平，室溫下進(jìn)行交聯(lián)2.5h，混合溶液放置到4°C冰箱中生成交聯(lián)酶聚集體CLEAs ;在10000 r ^mirT1離心20min后棄上清，沉淀用超純水洗滌兩次，離心獲得交聯(lián)酶聚集體CLEAs，于4°C冰箱中貯存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述黃酒用雙功能酶交聯(lián)酶聚集體的制備方法，其特征在于游離脲酶的純化: a、乙醇分級沉淀:乙醇終濃度在10%-60%之間時，收集的沉淀具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶的活性； b、DEAE-FF離子交換層析時，在0.35 mo I.L-1\θ.55 mo I.L-1時各出現(xiàn)一個洗脫峰，洗脫濃度0.35 mo I.L-1時出現(xiàn)的洗脫峰具有脲酶和EC酶酶活；C>Superdex 200凝膠層析時,在洗脫體積為7.2 mL時出現(xiàn)一個大峰,具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶這兩種活性。
3.用權(quán)利要求1所述方法制備得到的黃酒用雙功能酶交聯(lián)酶聚集體的應(yīng)用，其特征在于:取市售黃酒溶液，裝于反應(yīng)容器中，加入25 mg 交聯(lián)酶聚集體，每反應(yīng)6 h為一批次，以10000 r *min_1離心20 min回收CLEAs，并加入同種新批次黃酒進(jìn)行處理,重復(fù)多次，測定每次所回收的CLEAs質(zhì)量和黃酒的尿素去除率，反應(yīng)6批次后CLEAs濕重僅減少0.18g，沒有明顯變化；說明交聯(lián)酶聚集體的穩(wěn)定性較好，在使用過程中沒有發(fā)生酶的泄漏或溶解現(xiàn)象。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述黃酒用雙功能酶交聯(lián)酶聚集體的應(yīng)用，其特征在于:所述交聯(lián)酶聚集體對尿素的去除率初次使用可達(dá)85.35%，使用6次后尿素去除率仍能達(dá)69.30% ;對EC的去除率最高達(dá)46.27%，重復(fù)使用性較好；經(jīng)交聯(lián)酶聚集體處理后的黃酒，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)無明 顯變化。
【文檔編號】C12H1/15GK103923900SQ201410146269
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】田亞平, 查小紅, 楊廣明 申請人:江南大學(xué)