一種定點整合外源基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定點整合外源基因的方法。本發(fā)明公開了一種定點整合外源基因到牛β-酪蛋白基因的第二外顯子的方法，包括如下步驟：使TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ在離體的牛細胞中表達，得到第二外顯子靶序列發(fā)生突變的細胞；同時將外源基因同源重組到靶序列位置，實現(xiàn)外源基因在牛β-酪蛋白基因的第二外顯子上的定點整合。本發(fā)明的人溶菌酶基因或其它目的基因在乳腺中轉(zhuǎn)錄非常活躍的β-酪蛋白基因座定點整合，克服位置效應(yīng)，避免目的基因表達沉默，可以實現(xiàn)人溶菌酶或其它重組蛋白在乳腺中較高水平表達，提高了轉(zhuǎn)基因育種的成功率，同時可以節(jié)約后期生產(chǎn)純化重組蛋白的成本。
【專利說明】一種定點整合外源基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種定點整合外源基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]溶菌酶是人乳中重要的抗菌因子，對大部分革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌均具有殺滅作用，對于增強嬰幼兒免疫力有著重要的作用，同時溶菌酶在醫(yī)療保健，輕工業(yè)、食品業(yè)等方面也被廣泛應(yīng)用。2009年美國FDA批準了世界上首例乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的抗凝血酶轉(zhuǎn)基因藥物上市，這標志著利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)重組蛋白真正邁入產(chǎn)業(yè)化階段。
[0003]利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白具有廣闊的市場應(yīng)用前景，但是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在乳腺生物反應(yīng)器研究中仍存在一定的不足。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因研究中，由于外源基因在基因組中是一種隨機插入，受到位置效應(yīng)的影響以及載體自身大小限制，不能包含完整的調(diào)控元件往往使外源基因的表達量水平較低，甚至不表達或者異位表達(Clark，1994 ；Dobiel996 ;Kim，2007)。同時，由于外源基因的多拷貝隨機插入到宿主基因組中，這種整合對宿主自身來說可能也存在一定風險(Seggewis, 2006 ;McCormack, 2004)。這些不利因素大大降低了轉(zhuǎn)基因動物育種的可靠性，提高了成本，不利于轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展。食品規(guī)范委員會和美國FDA頒布的轉(zhuǎn)基因動物規(guī)范條例中也明確提出需充分重視這個問題。因此需要我們尋找使外源基因表達量更高，同時具有較高育種安全性和可靠性的新方法去改變傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因育種。
[0004]為了提高外源基因的表達量，克服轉(zhuǎn)入基因受到位置效應(yīng)的影響，人們嘗試了多種方法，如在載體中加入了核基質(zhì)附著元件(MAR)、位點控制元件(LCR)、絕緣子(Insulator)等元件來克服外源基因表達受到位置效應(yīng)的影響，但是由于基因表達調(diào)控的復(fù)雜性，仍不能取得很好的效果，而且外源基因在基因組上仍是隨機插入，降低了轉(zhuǎn)基因的可控性和安全性，這仍是在傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因研究急待解決的問題?；虼虬惺腔虬邢虿僮鞯囊婚T轉(zhuǎn)基因技術(shù)，利用外源基因與基因組序列間的同源性進行同源重組(homologousrecombination)來實現(xiàn)定點對染色體進行修飾的一門技術(shù),具有位點專一'丨生強，可以穩(wěn)定遺傳以及外源基因不受位置效應(yīng)影響，對鄰近基因也沒有影響等優(yōu)點，將成為今后一種較理想的改造物種基因的操作方法。2000年K.J.McCreath利用基因打靶的方法將人抗胰蛋白酶基因(AAT)定點整合到羊原膠原基因座上(C0L1A1)，羊乳中人抗胰蛋白酶表達量為650 μ g/ml (McCreath, 2000),遠高于之前McClenaghan隨機整合表達人抗胰蛋白酶的轉(zhuǎn)基因羊乳中18μg/ml的表達量(McClenaghan，1991)，克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因受位置效應(yīng)影響使蛋白低水平表達的弊端。
[0005]牛乳中酪蛋白含量占乳蛋白含量的76-86%，而且asl、as2、@、K是以基因簇的形式位于染色體中，研究發(fā)現(xiàn)存在一些類似LCR的序列來調(diào)控乳四種蛋白基因的協(xié)調(diào)表達(Curtin et al.1989;Rijnkels et al.2003)。
[0006]利用常規(guī)基因打靶進行轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的效率很低，只有10_6_10_7的效率(Hanson K D et al.1995)，而且最后得到的克隆動物通常會帶有藥物篩選所必須的抗性基因，最后要得到不含抗性基因的動物個體還要經(jīng)歷一次體細胞克隆。近年來，基于TALE結(jié)構(gòu)的人工核酸內(nèi)切酶已經(jīng)被成功地應(yīng)用于包括芽殖酵母、果蠅、斑馬魚、線蟲、大鼠、水稻、蟋蟀、家蠶、非洲爪蟾與熱帶爪蟾、豬和牛、擬南芥在內(nèi)的多個物種，以及體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞(包括人類細胞)。類轉(zhuǎn)錄激活樣因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)技術(shù)被用來產(chǎn)生位點特異的雙鏈斷裂，當這一斷裂通過具有同源臂的外源供體載體進行同源重組修復(fù)時，便可實現(xiàn)基因定點插入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種定點整合外源基因的方法。
[0008]本發(fā)明提供了一種定點整合外源基因到牛酪蛋白基因的第二外顯子的方法，包括如下步驟:使TALE蛋白-1和TALE蛋白-1I在離體的牛細胞中表達，得到第二外顯子靶序列發(fā)生突變的細胞；同時將外源基因同源重組到靶序列位置，實現(xiàn)外源基因在牛β-酪蛋白基因的第二外顯子上的定點整合；[0009]所述TALE蛋白-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示；
[0010]所述TALE蛋白-1I的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示；
[0011]所述靶序列如SEQ ID N0.1所示；
[0012]所述TALE蛋白-1和TALE蛋白-1I能分別與所述牛β _酪蛋白基因的第二外顯子靶序列特異結(jié)合，TALE蛋白-1和TALE蛋白-1I中的Fok I功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，使得TALE蛋白-1和TALE蛋白-1I分別與牛β -酪蛋白基因的第二外顯子靶序列特異結(jié)合位點之間的序列發(fā)生突變；
[0013]所述TALE蛋白-1與所述牛酪蛋白基因的第二外顯子靶序列特異結(jié)合的序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第I位至第16位核苷酸所示；
[0014]所述TALE蛋白-1I與所述牛酪蛋白基因的第二外顯子靶序列特異結(jié)合的序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第36位至第52位核苷酸所示。
[0015]上述方法中，所述使TALE蛋白-1和TALE蛋白-1I在牛細胞中表達的方法為將分別含有TALE蛋白-1和TALE蛋白-1I編碼基因的重組表達質(zhì)粒導入牛細胞中；
[0016]所述含有TALE蛋白-1編碼基因的重組表達質(zhì)粒具體為將SEQ ID N0.2所示的DNA分子插入pCS2-Fok I骨架載體的Nhe I位點得到；
[0017]所述含有TALE蛋白-1I編碼基因的重組表達質(zhì)粒具體為將SEQ ID N0.3所示的DNA分子插入pCS2-Fok I骨架載體的Nhe I位點得到；
[0018]所述將外源基因同源重組到靶序列位置為將所述外源基因通過線性化的同源重組載體整合在靶序列位置上；
[0019]所述同源重組載體上具有靶序列同源左臂-外源基因-靶序列同源右臂的片段。
[0020]上述任一所述的方法中，所述同源重組載體的構(gòu)建方法如下:將所述靶序列同源左臂序列插入PL452的KpnI和SalI位點間得到重組質(zhì)粒，將其命名為L_pL452 ;再將所述靶序列同源右臂序列插入L-pL452的NotI和Sac II位點間得到重組質(zhì)粒，將其命名為L-pL452-R ;最后將所述外源基因插入SalI和NotI位點間即得；
[0021]所述線性化為用限制性內(nèi)切酶Sac II線性化所述同源重組載體。
[0022]上述任一所述的方法中，所述同源重組載體是將所述外源基因插入SEQ ID N0.15所示的DNA分子的Sail和NotI位點間得到；
[0023]所述靶序列同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示；
[0024]所述靶序列同源右臂的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示。
[0025]上述任一所述的方法中，所述外源基因為人溶菌酶基因；
[0026]所述人溶菌酶基因如SEQ ID N0.14所示；
[0027]所述靶序列同源左臂-外源基因-靶序列同源右臂的片段如SEQ ID N0.16中自5’末端起第2654-10890位核苷酸所示；
[0028]所述同源重組載體的核苷酸序列如SEQ ID N0.16所示。
[0029]上述任一所述的方法中，所述牛細胞為牛胎兒成纖維細胞。
[0030]一種試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍，該試劑盒由SEQ ID N0.4所示的蛋白或SEQID N0.4所示的蛋白的編碼基因、SEQ ID N0.5所示的蛋白或SEQ ID N0.5所示的蛋白的編碼基因、SEQ ID N0.15所 示的DNA分子組成；
[0031]或，
[0032]SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示的蛋白也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0033]或，
[0034]SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示的蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0035]所述SEQ ID N0.4所示的蛋白的編碼基因具體如SEQ ID N0.2中自5’末端起第4位至第1533位所示；
[0036]所述SEQ ID N0.5所示的蛋白的編碼基因具體如SEQ ID N0.3中自5’末端起第4位至第1635位所示；
[0037]或，
[0038]含有SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示的蛋白編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0039]或，
[0040]SEQ ID N0.10所示的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0041]和/ 或，
[0042]SEQ ID N0.11所示的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0043]SEQ ID N0.15所示的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0044]SEQ ID N0.16所示的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0045]SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.5 所示的蛋白、SEQ ID N0.10 所示的 DNA 分子、SEQ IDN0.11所示的DNA分子、SEQ ID N0.15所示的DNA分子和/或SEQ ID N0.16所示的DNA分子在將外源基因定點整合在牛β_酪蛋白基因的第二外顯子上的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0046]所述外源基因具體為人溶菌酶基因；
[0047]或，
[0048]SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.5 所示的蛋白、SEQ ID N0.10 所示的 DNA 分子、SEQ IDN0.11所示的DNA分子、SEQ ID N0.15所示的DNA分子和/或SEQ ID N0.16所示的DNA分子在利用牛β-酪蛋白基因制備人溶菌酶和/或人溶菌酶轉(zhuǎn)基因牛中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；[0049]或，
[0050]上述任一所述的方法在制備人溶菌酶和/或人溶菌酶轉(zhuǎn)基因牛中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0051]或，
[0052]上述試劑盒在制備人溶菌酶和/或人溶菌酶轉(zhuǎn)基因牛中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0053]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0054](I)人溶菌酶基因或其它目的基因在乳腺中轉(zhuǎn)錄非?；钴S的β_酪蛋白基因座定點整合，該位點位于β -酪蛋白基因第二外顯子翻譯起始位點ATG之前，這不僅克服了位置效應(yīng)，避免目的基因表達沉默，還可以實現(xiàn)人溶菌酶或其它重組蛋白在乳腺中較高水平表達，提高了轉(zhuǎn)基因育種的成功率，同時可以節(jié)約后期生產(chǎn)純化重組蛋白成本；
[0055](2)目的基因在染色體定點整合，避免了隨機插入以及多拷貝插入對鄰近重要基因表達的影響(如插入突變、多拷貝的插入引起染色體不穩(wěn)定、鄰近基因功能失活、激活原癌基因、失活抑癌基因等)，提高了轉(zhuǎn)基因的安全性、可控性，消除部分人群對轉(zhuǎn)基因食品安全性顧慮；
[0056](3)利用酪蛋白基因座完整的內(nèi)源性啟動子指導外源基因表達，可以實現(xiàn)人溶菌酶基因或其它目的基因較高水平的表達，同時減少了由于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因研究中調(diào)控元件不完整造成的異位表達，提高轉(zhuǎn)基因成功率；
[0057]本發(fā)明首次利用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALENs)成功介導人溶菌酶基因定點插入牛β -酪蛋白基因第二外顯子，由此獲得轉(zhuǎn)基因克隆牛，與常規(guī)的通過同源重組技術(shù)獲得克隆牛相比，利用TALENs介導的同源重組，在單細胞克隆中的重組效率在1%_4%之間，而常規(guī)的基因打靶效率僅為10_6-10_7，其打靶效率提高了 IO4-1O5,為生產(chǎn)定點轉(zhuǎn)基因動物提供了極大的便利。
[0058]另外，所構(gòu)建的載體不含抗性基因，省去了藥物篩選過程，有利于細胞單克隆的形成，避免了細胞需要對抗藥物毒害的過程，對于后續(xù)的體細胞核移植和胚胎發(fā)育質(zhì)量起到關(guān)鍵作用，大大簡化了生物安全評價過程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0059]圖1為094牛胎兒。
[0060]圖2為094牛胎兒成纖維細胞。
[0061]圖3為酪蛋白基因序列同源左臂PCR擴增。
[0062]圖4為β -酪蛋白基因序列同源右臂PCR擴增。
[0063]圖5為人溶菌酶基因PCR擴增。
[0064]圖6為pL452-LYZ質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0065]圖7為同源重組示意圖。
[0066]圖8為人溶菌酶陽性PCR鑒定。
[0067]圖9為跨同源左臂PCR鑒定。
[0068]圖10為跨同源右臂PCR鑒定。
[0069]圖11為跨同源臂產(chǎn)物測序鑒定?！揪唧w實施方式】
[0070] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0071]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0072]pL452 載體在文獻 “Pentao Liu, Nancy A.Jenkins, and Neal G.Copeland.A Highly Efficient Recombineering-Based Method for Generating ConditionalKnockout Mutations.Genome Res.200313:476-484”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。
[0073]pMD19-T購自Takara公司，產(chǎn)品目錄號為D102A。
[0074]pCS2-Fok I骨架載體在文獻“沈延，黃鵬，張博.TALEN構(gòu)建與斑馬魚基因組定點突變的實驗方法與流程.遺傳，2013，35 (4):533-544”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。
[0075]下述實施例中牛胎兒成纖維細胞建立采用胰酶消化法。具體方法如下:
[0076](一)屠宰妊娠期第42天的母牛，取出胎盤放入DMEM培養(yǎng)基中，12h內(nèi)送回到實驗室，牛胎兒如圖1所不。
[0077](二)在含有5XDPBS的細胞培養(yǎng)皿中剔除胎兒頭、四肢、內(nèi)臟及軟骨組織，將剩余組織放入一個新的IOcm細胞培養(yǎng)皿中，用眼科剪盡量剪碎。
[0078](三)加入1mlDMEM完全培養(yǎng)基，用剪頭的Iml槍頭將組織碎塊及培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中，加入7ml DPBS，用移液器吸打幾下，待組織塊沉下后，吸棄上清，重復(fù)洗滌一次。
[0079](四)向15ml離心管中加入IOml0.25g/100ml胰酶，37°C水浴消化30min。
[0080](五)小心吸取上清細胞懸液到另一個15ml離心管中，室溫1200rpm，離心5min收
集細胞。重復(fù)步驟(四)和(五)各一次并收集細胞。
[0081](六)將離心獲得的細胞按照IXIO6/瓶的濃度接種到T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于37.5°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔兩天換一次培養(yǎng)液，待細胞長滿后凍存，并將其命名為094牛胎兒成纖維細胞系，如圖2所示。
[0082]Nucleofector轉(zhuǎn)染試劑盒購自德國Lonza公司，產(chǎn)品目錄號為VP1-1002。
[0083]實施例1、TALENs表達載體的構(gòu)建
[0084]一、篩選靶點區(qū)域
[0085]基于大量分析篩選與驗證，確認將牛β -酪蛋白基因(AC_000163)第二外顯子上的一段序列作為靶點，該靶序列如下:
[0086]5’ -TGAGAGCCATGAAGGTCCTCATCCTTGCCTGCCTGGTGGCTCTGGCCCTTGC-3’ (SEQIDN0.1)
[0087]SEQ ID N0.1中帶下劃線部分為可被TALENs蛋白中的結(jié)合功能域特異結(jié)合的部分，結(jié)合位點中間部分為Fok I內(nèi)切核酸酶切割識別位點。
[0088]二、合成 TALEs 蛋白
[0089]基于SEQ ID N0.1所示的靶序列，設(shè)計一對TALE蛋白(TALE蛋白-1和TALE蛋白-1I)。
[0090](一)合成TALE蛋白-1和TALE蛋白_II的編碼基因，分別如SEQ ID N0.2 (SEQID N0.2中自5’末端起第4位至第1533位為TALE蛋白-1的編碼基因)和SEQ ID N0.3所示(SEQ ID N0.3中自5’末端起第4位至第1635位為TALE蛋白-1I的編碼基因)。
[0091 ] TALE蛋白-1和TALE蛋白_ II的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。
[0092](二)制備重組質(zhì)粒
[0093]Nhe I和Spe I雙酶切SEQ ID N0.2所示的DNA分子，得到基因片段；用Nhe I單酶切pCS2-Fok I骨架載體，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為TALENS-LF6。
[0094]Nhe I和Spe I雙酶切SEQ ID N0.3所示的DNA分子，得到基因片段；用Nhe I單酶切pCS2-Fok I骨架載體，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為TALENS-RF2。
[0095]將重組質(zhì)粒TALENS-LF6和TALENs_RF2進行測序，結(jié)果正確。
[0096]三、TALENs蛋白的敲除效率
[0097]如果TALENs蛋白發(fā)揮切割作用，細胞會啟動自身修復(fù)機制，在切割位點會出現(xiàn)小片段的刪除或者插入，測序結(jié)果峰圖為雜合峰圖。
[0098](一)將TALENS-LF6和TALENs_RF2電擊轉(zhuǎn)化094牛胎兒成纖維細胞系，每IO6個細胞轉(zhuǎn)染 3 μ g TA LENs-LF6 和 3 μ g TALENs_RF2。
[0099](二)電擊72小時后，提取轉(zhuǎn)染后細胞的基因組DNA，采用TALENJD-F和TALENJD-R組成的引物對進行PCR擴增，然后將PCR擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果峰圖為雜合峰圖。
[0100]引物如下:
[0101]TALENJD-F:5’ -GAAGCACGGAGTCTTAGATA-3’ ；
[0102]TALENJD-R: 5，-TGTCTGATATACCATCCTCTG-3，。
[0103](三)電擊72小時后，采用TA克隆測序的方式計算敲除效率(突變型克隆與總有效測序總數(shù)的比值即為敲除效率；其中有效測序總數(shù)為野生型克隆與突變型克隆的總和)。計算得到TALENs蛋白(TALE蛋白-1和TALE蛋白-1I)的敲除效率為28%。
[0104]實施例2、基因打靶載體的構(gòu)建
[0105]一、β -酪蛋白基因序列同源臂的擴增和測序
[0106](一)根據(jù)GeneBank 公布的牛 β -釀蛋白序列(Genebank 號:NW_003103978.1)設(shè)計上游引物I和下游引物I用來擴增部分β_酪蛋白基因序列的同源左臂。
[0107]上游引物1:5' -CGGGGTACC AGAGATGTTGATGGCAAGAAC-3' ；(SEQ ID N0.6)
[0108](下劃線所示序列為KpnI酶切識別位點)
[0109]下游引物1:5' ~GCGTCGACCTCTCAATTCCTGGGAATGGG~3/。(SEQ ID N0.7)
[0110](下劃線所示序列為SalI酶切識別位點)
[0111](二)設(shè)計上游引物2和下游引物2用來擴增部分β-酪蛋白基因序列的同源右臂。
[0112]上游引物2:5' -ATTTGCGGCCGCTTGCAAGAGAGGTAAATACAG-3' ; (SEQ ID N0.8 )
[0113](下劃線所示序列為NotI酶切識別位點)
[0114]下游引物2:5' ~TCCCCGCGGTCATTCAGAGGCAATTTCCC~3/。(SEQ ID N0.9)
[0115](下劃線所示序列為SacII酶切識別位點)
[0116](三)提取094牛胎兒成纖維細胞基因組DNA，以基因組DNA為模板，以上游引物I和下游引物I為引物進行PCR擴增，得到同源左臂，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示；
[0117]圖3中，M:250bp marker ; 1-3:同源左臂PCR擴增產(chǎn)物，其序列如SEQ ID N0.10所示。
[0118]以094牛胎兒成纖維細胞基因組DNA為模板，以上游引物2和下游引物2為引物進行PCR擴增，得到同源右臂，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖4所示；
[0119]圖4中，M:100bp marker ; 1_5:同源右臂PCR擴增產(chǎn)物，其序列如SEQ ID N0.11所示。
[0120]將同源左臂和同源右臂分別與pMD19-T載體連接分別得到重組質(zhì)粒Left arm-T和Right arm-T,將Left arm-T和Right arm-T進行測序,結(jié)果正確。
[0121]二、人溶菌酶基因序列擴增和測序
[0122](一)根據(jù)GeneBank公布的人溶菌酶序列(Genebank號:X14008)設(shè)計上游引物3和下游引物3。
[0123]上游引物3:5' ~GCGTCGACAACATGAAGGCTCTCATTGTTC~3/ ; (SEQ ID N0.12)
[0124](下劃線所示序列為SalI酶切識別位點)
[0125]下游引物3:5' ~ATTTGCGGCCGCTAGAAGTGTAATATGAGGCCAG~3/ ; (SEQ ID N0.13)
[0126](下劃線所示序列為NotI酶切識別位點)
[0127](二)提取人基因組DNA，以其為模板，上游引物3和下游引物3為引物進行PCR擴增，得到人溶菌酶基因序列，該序列包括溶菌酶自身加尾信號，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖5所示。
[0128]圖5中，M:lkb marker ; 1-4:人溶菌酶基因PCR擴增產(chǎn)物，其序列如SEQ ID N0.14所示。
[0129](三)將步驟2得到的人溶菌酶基因序列連接PMD19-T載體，得到重組質(zhì)粒LYZ-T，將LYZ-T進行測序，結(jié)果正確。
[0130]三、基因打靶載體的構(gòu)建
[0131]KpnI和SalI雙酶切Left arm_T，得到同源左臂片段；KpnI和SalI雙酶切pL452，得到載體大片段；將載體大片段與同源左臂片段連接得到重組質(zhì)粒，將其命名為L-pL452 ；
[0132]NotI和Sac II雙酶切Right arm_T，得到同源右臂片段；NotI和Sac II雙酶切L-pL452，得到載體大片段；將載體大片段與同源右臂片段連接得到重組質(zhì)粒，將其命名為L-pL452-R ;L-pL452-R 質(zhì)粒的序列如 SEQ ID N0.15 所示。
[0133]SalI和NotI雙酶切LYZ-T，得到人溶菌酶基因片段；SalI和NotI雙酶切L-pL452-R，得到載體大片段；將載體大片段與人溶菌酶基因片段連接得到打靶載體，將其命名為PL452-LYZ。對打靶載體pL452-LYZ進行測序驗證，結(jié)果正確。
[0134]pL452-LYZ質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖6所示，其序列如SEQ ID N0.16所示。
[0135]實施例3、牛胎兒成纖維細胞中β -酪蛋白基因座定點整合人溶菌酶基因
[0136]定點整合策略如圖7所示。
[0137]一、打靶載體pL452-LYZ與TALENs質(zhì)粒的細胞共轉(zhuǎn)染
[0138]細胞轉(zhuǎn)染采用amaxa nucleofector進行電轉(zhuǎn)。具體流程如下:
[0139](一)將消化并收集的兩瓶T25細胞瓶的094牛胎兒成纖維細胞(每瓶的細胞數(shù)約8X106)和 3ug Sac II 酶切線性化的打靶載體 pL452_LYZ 及 6ug TALENs 質(zhì)粒(TALENs_LF6和TALENs-RF2各3ug)和400 μ I Nucleofector試劑混勻，得混合液，將混合液分裝4個電擊杯進行電擊，然后分別將電擊后的混合液在四個Τ-25培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
[0140](二)48h后將每個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細胞消化并分別鋪到15個IOcm的皿中，培養(yǎng)約10天后挑取單克隆共15個到48孔板培養(yǎng)。
[0141](三)待各克隆的細胞90%匯合后將其擴繁至24孔板培養(yǎng)，選108個生長狀態(tài)較好的克隆點，然后將這108個克隆長滿后的細胞一半凍存，一半用于基因組提取和PCR鑒定。
[0142]二、同源重組鑒定
[0143](一)首先進行溶菌酶陽性檢測，將得到的108個克隆點的細胞提取基因組，分別取50ng的基因組DNA用于PCR檢測，同時以094牛胎兒成纖維細胞的基因組、基因打靶載體PL452-LYZ和水作為對照。
[0144]PCR檢測引物如下:
[0145]溶菌酶jd-Fj' -AGAGAAGGAAGAAGAAGAAGG-3'；
[0146]溶菌酶jd-Rj' -AGCACGAGAATCACTTGAG-3'；
[0147]該對引物設(shè)計在人溶菌酶序列中，擴增的片段大小為516bp，只要發(fā)生了人溶菌酶整合，無論是隨機整合還是定點插入，都能檢測出來，這樣可以排除大部分的陰性克隆，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測的部分結(jié)果如圖8所示。
[0148]圖8中，1-12分別代表不同的克隆，M為DNA marker。
[0149]經(jīng)過檢測，一共獲得了 7個溶菌酶陽性克隆分別為103、81、61、42、41、38和15。
[0150](二)對這7個溶菌酶陽性克隆點分別進行跨同源臂的PCR檢測，PCR檢測引物如下:
[0151]KZB-F: 5' -CTTCACTTCTTGTCCTCTACT-3'；
[0152]KZB-R:5/ -CCTTCTTCTTCTTCCTTCTCT-3'；
[0153]KYB-F:5/ -CTTATATCGTCACTTACCTCAC-3'；
[0154]KYB-R:5/ -TCATTCTCACTGCCTCTTG-3'。
[0155]跨同源左臂的上游引物KZB-F設(shè)計在同源左臂外側(cè)牛β -酪蛋白基因序列中，下游引物KZB-R設(shè)計在人溶菌酶基因序列中，目的片段大小為2226bp，只有發(fā)生了同源重組的細胞才能擴增出目的條帶?？缤从冶鄣纳嫌我颣YB-F設(shè)計在人溶菌酶基因序列中，下游引物KYB-R設(shè)計在同源右臂外側(cè)的牛β-酪蛋白基因序列中，目的片段大小為2065bp，只有發(fā)生了同源重組的細胞才能擴增出目的條帶。跨同源左臂的PCR檢測結(jié)果如圖9所示，跨同源右臂的檢測結(jié)果如圖10所示。
[0156]圖9和圖10中，15、38、41、42、61、81、103分別表示7個人溶菌酶陽性的細胞克隆點，M:lkb marker。
[0157]圖9和圖10的結(jié)果表明，在得到的7個克隆點中，61號克隆點細胞發(fā)生了同源重組，擴增檢測得到了跨同源左臂和跨同源右臂的目的片段。對這兩個片段回收測序，結(jié)果顯示，跨同源左臂PCR片段的5’端為β-酪蛋白基因序列，3’端為人溶菌酶基因序列，跨同源右臂PCR片段的5’端為人溶菌酶基因序列，3’端為β -酪蛋白基因序列，測序結(jié)果如圖11所示。PCR產(chǎn)物的序列與同源重組后預(yù)期序列相一致，這表明61號克隆點確實為中靶的陽性細胞，即人溶菌酶基因定點整合到了牛酪蛋白基因座上。
【權(quán)利要求】
1.一種定點整合外源基因到牛β-酪蛋白基因的第二外顯子的方法，包括如下步驟:使TALE蛋白-1和TALE蛋白-1I在離體的牛細胞中表達，得到第二外顯子靶序列發(fā)生突變的細胞；同時將外源基因同源重組到靶序列位置，實現(xiàn)外源基因在牛酪蛋白基因的第二外顯子上的定點整合； 所述TALE蛋白-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示； 所述TALE蛋白-1I的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示； 所述靶序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述使TALE蛋白-1和TALE蛋白-1I在牛細胞中表達的方法為將分別含有TALE蛋白-1和TALE蛋白-1I編碼基因的重組表達質(zhì)粒導入牛細胞中； 所述含有TALE蛋白-1編碼基因的重組表達質(zhì)粒具體為將SEQ ID N0.2所示的DNA分子插入pCS2-Fok I骨架載體的Nhe I位點得到； 所述含有TALE蛋白-1I編碼基因的重組表達質(zhì)粒具體為將SEQ ID N0.3所示的DNA分子插入pCS2-Fok I骨架載體的Nhe I位點得到； 所述將外源基因同源重 組到靶序列位置為將所述外源基因通過線性化的同源重組載體整合在靶序列位置上； 所述同源重組載體上具有靶序列同源左臂-外源基因-靶序列同源右臂的片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述同源重組載體的構(gòu)建方法如下:將所述靶序列同源左臂序列插入PL452的KpnI和SalI位點間得到重組質(zhì)粒，將其命名為L-pL452 ;再將所述靶序列同源右臂序列插入L-pL452的NotI和Sac II位點間得到重組質(zhì)粒，將其命名為L-pL452-R ;最后將所述外源基因插入SalI和NotI位點間即得； 所述線性化為用限制性內(nèi)切酶Sac II線性化所述同源重組載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述同源重組載體是將所述外源基因插入SEQ ID N0.15所示的DNA分子的SalI和NotI位點間得到； 所述靶序列同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示； 所述靶序列同源右臂的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述外源基因為人溶菌酶基因； 所述人溶菌酶基因如SEQ ID N0.14所示； 所述靶序列同源左臂-外源基因-靶序列同源右臂的片段如SEQ ID N0.16中自5’末端起第2654-10890位核苷酸所示； 所述同源重組載體的核苷酸序列如SEQ ID N0.16所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于:所述牛細胞為牛胎兒成纖維細胞。
7.一種試劑盒，該試劑盒由SEQ ID N0.4所示的蛋白或SEQ ID N0.4所示的蛋白的編碼基因、SEQ ID N0.5所示的蛋白或SEQ ID N0.5所示的蛋白的編碼基因、SEQ ID N0.15所不的DNA分子組成； 或， SEQ ID N0.4 或 SEQ ID N0.5 所示的蛋白； 或， SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示的蛋白的編碼基因；所述SEQ ID N0.4所示的蛋白的編碼基因具體如SEQ ID N0.2中自5’末端起第4位至第1533位所示； 所述SEQ ID N0.5所示的蛋白的編碼基因具體如SEQ ID N0.3中自5’末端起第4位至第1635位所示； 或， 含有SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示的蛋白編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌； 或， SEQ ID N0.10所示的DNA分子； 和/或， SEQ ID N0.11所示的DNA分子。
8.SEQ ID N0.15 所示的 DNA 分子。
9.SEQ ID N0.16 所示的 DNA 分子。
10.SEQ ID N0.4 和 SEQ ID N0.5 所示的蛋白、SEQ ID N0.10 所示的 DNA 分子、SEQ IDN0.11所示的DNA分子、SEQ ID N0.15所示的DNA分子和/或SEQ ID N0.16所示的DNA分子在將外源基因定點整合在牛β_酪蛋白基因的第二外顯子上的應(yīng)用； 所述外源基因具體為人溶菌酶基因； 或， SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示的蛋白、SEQ ID N0.10所示的DNA分子、SEQ ID N0.11所示的DNA分子、SEQ ID N0.15所示的DNA分子和/或SEQ ID N0.16所示的DNA分子在利用牛β_酪蛋白基因制備人溶菌酶中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求1-6任一所述的方法在制備人溶菌酶中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求7所述的試劑盒在制備人溶菌酶中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/36GK103923940SQ201410152886
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】戴蘊平, 王本利, 丁方榮, 李松, 王海萍, 鄭敏, 李京, 李玲 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學