一種狂犬病滅活疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，其包括以下步驟：對(duì)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代與培養(yǎng)的步驟；然后對(duì)處理后的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞進(jìn)行毒種繁殖、毒液繁殖的步驟；制備疫苗佐劑，然后按照毒液總量0.025％的比例加入B-丙內(nèi)酯，在4℃條件下滅活24小時(shí)，然后在37℃條件下水解2小時(shí)，然后按照水解后細(xì)胞毒液與疫苗佐劑9:1的比例進(jìn)行定量分裝，得到狂犬病滅活疫苗。使其具有操作簡(jiǎn)單、工藝穩(wěn)定、疫苗病毒含量高、質(zhì)量易控等優(yōu)點(diǎn)，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量，并且采用本發(fā)明制備方法制得的疫苗安全性好、免疫力高、制造成本低。
【專利說(shuō)明】一種狂犬病滅活疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種狂犬病滅活疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前我國(guó)生產(chǎn)犬用狂犬病滅活疫苗主要用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)，此方法成本高、毒價(jià)低、勞動(dòng)強(qiáng)度大。同時(shí)因各個(gè)轉(zhuǎn)瓶都是獨(dú)立單元，每瓶的細(xì)胞質(zhì)量、病毒滴度均不相同，致使生產(chǎn)出的疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定、批量差異大。因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于更進(jìn)一步的改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，以提高制作工藝的穩(wěn)定性與病毒含量。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0005]一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，其包括以下步驟:
[0006]A、對(duì)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代與培養(yǎng)的步驟；
[0007]B、然后在步驟A處理后的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞進(jìn)行毒種繁殖、毒液繁殖的步驟；
[0008]C、制備疫苗佐劑，然后按照毒液總量0.025%的比例加入B-丙內(nèi)酯，在4°C條件下滅活24小時(shí)，然后在37°C條件下水解2小時(shí)，然后按照水解后細(xì)胞毒液與疫苗佐劑9:1的比例進(jìn)行定量分裝，得到狂犬病滅活疫苗。
[0009]所述的制備方法，其中，所述步驟A具體的包括:
[0010]先用方瓶培養(yǎng)從液氮中復(fù)蘇的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞，待其長(zhǎng)成單層后經(jīng)胰酶消化傳代，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成單層的細(xì)胞并繼續(xù)放大傳代培養(yǎng)。
[0011]所述的制備方法，其中，所述步驟A具體的包括:在細(xì)胞接種密度為
2-3X103cells/ml，溶氧量為 30% -60%, Ph 值為 7.2-7.4，溫度為 36°C _37°C，轉(zhuǎn)數(shù)為 50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1: 1，在此條件下對(duì)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)。
[0012]所述的制備方法，其中，所述步驟B具體的包括:取步驟A中生長(zhǎng)良好的單層倉(cāng)鼠腎細(xì)胞，接種含狂犬病 病毒的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)4-6天獲得狂犬病毒種。
[0013]所述的制備方法，其中，所述步驟B具體的包括:
[0014]將狂犬病毒種在接種量為1% _2%，溶氧量為30% -60%, Ph值為7.2-7.4，轉(zhuǎn)數(shù)為50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1:1，溫度為32°C _34°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-6天，當(dāng)病毒含量達(dá)到107 5TCID5(l/ml時(shí)得到狂犬病毒液，將狂犬病毒液在_20°C條件下保存。
[0015]所述的制備方法，其中，所述細(xì)胞生長(zhǎng)液為99% -97%的MEM199液與1% -3%的胎牛血清，且細(xì)胞生長(zhǎng)液的Ph值為7.2-7.4。
[0016]本發(fā)明提供的一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，采用復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)、毒種繁殖、毒液繁殖與滅活分裝的步驟，使其具有操作簡(jiǎn)單、工藝穩(wěn)定、疫苗病毒含量高、質(zhì)量易控等優(yōu)點(diǎn)，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量，并且采用本發(fā)明制備方法制得的疫苗安全性好、免疫力高、制造成本低。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的制備方法細(xì)胞生長(zhǎng)液血清中的濃度可降低至1% -3% ;不僅能提高細(xì)胞生長(zhǎng)密度，提高病毒滴度，能生產(chǎn)出的病毒液均一穩(wěn)定，顯著提高了疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量，
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明提供了一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0018]本發(fā)明提供了一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，其包括以下步驟:
[0019]步驟101:對(duì)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代與培養(yǎng)的步驟；
[0020]步驟102:然后在步驟:101處理后的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞進(jìn)行毒種繁殖、毒液繁殖的步驟；
[0021]步驟103:制備疫苗佐劑，然后按照毒液總量0.025%的比例加入B-丙內(nèi)酯，在4°C條件下滅活24小時(shí)，然后在37°C條件下水解2小時(shí)，然后按照水解后細(xì)胞毒液與疫苗佐劑9:1的比例進(jìn)行定量分裝，得到狂犬病滅活疫苗。
[0022]更進(jìn)一步的，所述步驟101具體的包括:
[0023]先用方瓶培養(yǎng)從液氮中復(fù)蘇的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞，待其長(zhǎng)成單層后經(jīng)胰酶消化傳代，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成單層的細(xì)胞并繼續(xù)放大傳代培養(yǎng)。 [0024]在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述步驟101具體的還包括:在細(xì)胞接種密度為
2-3X103cells/ml，溶氧量為 30% -60%, Ph 值為 7.2-7.4，溫度為 36°C _37°C，轉(zhuǎn)數(shù)為 50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1: 1，在此條件下對(duì)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)。
[0025]更進(jìn)一步的，所述步驟102具體的包括:取步驟101中生長(zhǎng)良好的單層倉(cāng)鼠腎細(xì)胞，接種含狂犬病病毒的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)4-6天獲得狂犬病毒種。并且將狂犬病毒種在接種量為I % -2 %,溶氧量為30 % -60%, Ph值為7.2-7.4，轉(zhuǎn)數(shù)為50r/min-60r/min,培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1:1，溫度為32°C _34°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4_6天，當(dāng)病毒含量達(dá)到107_5TCID5ciAil時(shí)得到狂犬病毒液，將狂犬病毒液在_20°C條件下保存。
[0026]在步驟101中的所述細(xì)胞生長(zhǎng)液為99% -97%的MEM199液與1% _3%的胎牛血清，且細(xì)胞生長(zhǎng)液的Ph值為7.2-7.4。
[0027]為了更進(jìn)一步描述本發(fā)明，以下列舉更詳盡的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。
[0028](I)篩選適宜細(xì)胞系:將狂犬病毒株接種于倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞上，不斷培養(yǎng)傳代，控制培養(yǎng)條件，Ph值7.2-7.4、溫度32°C _34°C，使病毒適應(yīng)細(xì)胞，檢測(cè)病毒增殖滴度，當(dāng)所需病毒含量每毫克達(dá)到>107_5TCID5tZml，篩選出適宜細(xì)胞；
[0029](2)制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):長(zhǎng)成單層的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化傳代，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液于37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層的細(xì)胞并繼續(xù)放大傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:DMEM:
199= 1:1, Ph值為7.2-7.4，溫度為36°C _37°C，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)-72小時(shí)；
[0030](3)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞的生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng):將長(zhǎng)成單層的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞經(jīng)胰酶細(xì)胞分散液消化為單個(gè)細(xì)胞，接種于生物反應(yīng)器中，細(xì)胞接種密度為2-3X103cellS/ml，溶氧量為 30% -60%，Ph 值為 7.2-7.4，溫度為 36°C _37°C，轉(zhuǎn)數(shù)為 50r/min_60r/min，培養(yǎng)基為DMEM: 199 =1:1。[0031](4)細(xì)胞毒種的繁殖:將生長(zhǎng)良好的單層倉(cāng)鼠腎細(xì)胞，接種含狂犬病病毒的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)4-6天獲得狂犬病毒種；
[0032]細(xì)胞毒種的鑒定:細(xì)胞毒種鑒定完全符合狂犬病病毒CVS-1l株毒種標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞毒種每毫升病毒含量>107_ 5TCID50/mL.[0033](5)細(xì)胞毒液的繁殖:將狂犬病毒種在接種量為1% _2%，溶氧量為30% -60%,Ph 值為 7.2-7.4，轉(zhuǎn)數(shù)為 50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為 DMEM: 199 = 1:1，溫度為 32°C -34°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-6天，當(dāng)病毒含量達(dá)到107 5TCID5(l/ml時(shí)得到狂犬病毒液，將狂犬病毒液在-20°C條件下保存。
[0034](6)病毒的滅活、配苗與分裝:制備疫苗佐劑，然后按照毒液總量0.025%的比例加入B-丙內(nèi)酯，在4°C條件下滅活24小時(shí)，然后在37°C條件下水解2小時(shí)，然后按照水解后細(xì)胞毒液與疫苗佐劑9:1的比例進(jìn)行定量分裝，得到狂犬病滅活疫苗。
[0035]安全檢測(cè)
[0036]用體重11克-13克的小白鼠8只，各腹腔注射疫苗0.5ml，觀察7日，全部健活，無(wú)不良反應(yīng)。并與市面上的狂犬疫苗進(jìn)行比較，其結(jié)果如表1所示。
[0037]表1
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種狂犬病滅活疫苗的制備方法，其包括以下步驟: A、對(duì)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代與培養(yǎng)的步驟； B、然后在步驟A處理后的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞進(jìn)行毒種繁殖、毒液繁殖的步驟； C、制備疫苗佐劑，然后按照毒液總量0.025%的比例加入B-丙內(nèi)酯，在4°C條件下滅活24小時(shí)，然后在37°C條件下水解2小時(shí)，然后按照水解后細(xì)胞毒液與疫苗佐劑9:1的比例進(jìn)行定量分裝，得到狂犬病滅活疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟A具體的包括: 先用方瓶培養(yǎng)從液氮中復(fù)蘇的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞，待其長(zhǎng)成單層后經(jīng)胰酶消化傳代，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成單層的細(xì)胞并繼續(xù)放大傳代培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟A具體的包括:在細(xì)胞接種密度為 2-3X103cells/ml，溶氧量為 30% -60%, Ph 值為 7.2-7.4，溫度為 36°C -37。。，轉(zhuǎn)數(shù)為50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1: 1，在此條件下對(duì)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟B具體的包括:取步驟A中生長(zhǎng)良好的單層倉(cāng)鼠腎細(xì)胞 ，接種含狂犬病病毒的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)4-6天獲得狂犬病毒種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟B具體的包括: 將狂犬病毒種在接種量為I % -2%，溶氧量為30% -60%, Ph值為7.2-7.4，轉(zhuǎn)數(shù)為50r/min-60r/min，培養(yǎng)基為DMEM:199 = 1:1，溫度為32°C _34°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-6天，當(dāng)病毒含量達(dá)到107 5TCID5(l/ml時(shí)得到狂犬病毒液，將狂犬病毒液在_20°C條件下保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述細(xì)胞生長(zhǎng)液為99% -97 %的MEM199液與1% -3%的胎牛血清，且細(xì)胞生長(zhǎng)液的Ph值為7.2-7.4。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103948919SQ201410168670
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】吳金, 張中洋, 高玉龍, 任培森, 李曉莉, 楊金梅, 孫巖 申請(qǐng)人:吉林和元生物工程有限公司