一種定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因的方法，具體的步驟如下：1)選取具有某一性狀的植株，假定該性狀受兩個非等位基因A和B控制，A和B突變后該性狀變?yōu)橥蛔冃誀睿?)將野生型和突變體雜交獲得F1，F(xiàn)1的基因型為AaBb，表現(xiàn)同野生型，為正常性狀；3)F1自交后獲得F2分離群體，共有9種基因型；4)將F1用突變體回交，產(chǎn)生的BC1F1分離群體共有4種基因型；5)取若干正常性狀的BC1F1單株自交，獲得各自的BC1F2分離群體；本發(fā)明的有益效果是：本方法結(jié)合了兩種傳統(tǒng)定位方法的優(yōu)點，可以既精確又快速地在BC1F2代對控制同一性狀的兩個非等位基因進(jìn)行定位，特別適用于雜交不易操作的自交植物。
【專利說明】一種定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因方法。
【背景技術(shù)】
[0002]控制同一性狀的2個非等位基因多由基因組加倍或基因復(fù)制產(chǎn)生，在異源四倍體植物中最為常見，如普通煙草、甘藍(lán)型油菜、硬粒小麥等，偶見于二倍體植物，如水稻、擬南芥等。由于它們的生物學(xué)功能極為相似，之間存在功能互補(bǔ)，故單個基因突變后不能導(dǎo)致相應(yīng)的隱性表型。分子標(biāo)記是當(dāng)前基因定位的最主要和最可靠的手段，在單個基因的定位和圖位克隆中發(fā)揮著非常重要的作用。不過，在定位植物控制同一性狀的2個非等位基因方面，目前流行的方法要么定位結(jié)果過于粗糙，要么花費(fèi)時間太長。
[0003]在定位植物控制同一性狀的2個非等位基因方面，根據(jù)所使用的分離群體，主要有2種方法:一種是利用F2或BClFl分離群體，把上述2個基因當(dāng)做數(shù)量性狀位點(Quantitative trait loci, QTLs)進(jìn)行定位，該方法由于獲得分離群體較快(野生型與突變體雜交后再自交一次或者用突變體回交一次即可)，故可快速獲得定位結(jié)果，但定位精度較低，且不能對單個基因進(jìn)行精細(xì)定位。利用這種方法定位的基因有2個水稻育性恢復(fù)基因Rf3、Rf(U)和2個硬粒小麥黃綠葉基因ygldl、ygld2等；另一種是利用高代回交(Advanced Backcross)的方 法,先將2個非等位基因分離到不同的回交單株之中，再分別對其定位。該方法精度較高，可用于基因的圖位克隆，但由于通常在回交3代(BC3)以后才能開始定位，故花費(fèi)時間較長。利用這種方法定位的基因有I個甘藍(lán)型油菜雄性不育基因ms2和I個印度芥菜的三室長角果基因mcl等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因方法。
[0005]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]一種定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因的方法，具體的步驟如下:
[0007]I)選取具有某一性狀的植株，假定該性狀受2個非等位基因A和B控制，A和B突變后該性狀變?yōu)橥蛔冃誀?，那么野生型的基因型為AABB，表現(xiàn)為正常性狀，而突變體的基因型為aabb，表現(xiàn)為突變性狀；
[0008]2)將野生型和突變體雜交獲得Fl，F(xiàn)l的基因型為AaBb，表現(xiàn)同野生型，為正常性狀；
[0009]3)Fl自交后獲得F2分離群體，共有9種基因型AABB、AABb, AAbb, AaBB, AaBb,Aabb、aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/16，所以F2群體的正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為15:1 ；
[0010]4)將Fl用突變體回交，產(chǎn)生的BClFl分離群體共有4種基因型AaBb、Aabb、aaBb、aabb，各占1/4，所以BClFl群體的正常性狀和突變性狀分離比表現(xiàn)為3:1;
[0011]5)取若干正常性狀的BClFl單株自交，獲得各自的BC1F2分離群體；
[0012]由于1/3的BClFl正常性狀的單株基因型為AaBb，那么其自交產(chǎn)生的BC1F2分離群體與Fl相同，有9種基因型，正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為15:1 ;
[0013]另有1/3的BClFl單株基因型為Aabb，那么其自交產(chǎn)生的BC1F2分離群體有3種基因型AAbb、Aabb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為3:1;由于正常性狀和突變性狀的分離只與A的基因型的分離相關(guān)，含有A為正常性狀，不含A則為突變性狀，故這個BC1F2群體是關(guān)于A基因分離的群體，用分子標(biāo)記對A基因進(jìn)行定位；
[0014]剩余1/3的BClFl單株基因型為aaBb，，那么其自交產(chǎn)生的BC1F2分離群體有3種基因型aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為3:1 ；由于正常性狀和突變性狀的分離只與B的基因型的分離相關(guān)，含有B為正常性狀，不含B則為突變性狀，故這個BC1F2群體是關(guān)于B基因分離的群體，可以用分子標(biāo)記對B基因進(jìn)行定位；
[0015]一種利用上述的方法定位控制普通煙草莖桿顏色的兩個非等位基因，具體的步驟如下:
[0016]I)正常中煙100的莖桿基部呈綠色，突變體的莖桿基部呈白色，用突變體和一個莖桿為綠色的煙草品種紅花大金元雜交，獲得雜種F1，F(xiàn)1自交獲得F2分離群體，F(xiàn)l同時用紅花大金元回交獲得BClFl分離群體。對F2和BClFl群體中莖桿綠色和白色的單株數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計和卡方檢驗，發(fā)現(xiàn)綠白分離比分別符合15:1和3:1，這表明白色莖桿性狀受2個隱性基因控制，我們分別將其命名為c和d，那么它們對應(yīng)的顯性基因分別為C和D ;
[0017]2)從步驟I中的BClFl分離群體中選取了 9株莖桿綠色的單株自交，獲得各自的BC1F2分離群體，分別編號為1-9號；對這些群體中莖桿綠色和白色的單株數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計和卡方檢驗，發(fā)現(xiàn)1-4號的4個群體的綠白分離比符合15:1，而另外5-9號的5個群體的綠白分離比符合3:1，這表明第5個群體對應(yīng)的上一代BClFl單株的基因型為Ccdd或ccDd，可以用來對c基因或d基因進(jìn)行定位；
[0018]3)采用煙草SSR分子標(biāo)記進(jìn)行基因定位
[0019]根據(jù)普通煙草SSR標(biāo)記連鎖圖M，選取1376對SSR引物對突變體和紅花大金元的基因組DNA進(jìn)行PCR，關(guān)于普通煙草SSR標(biāo)記連鎖圖M和1376對SSR引物參考文獻(xiàn):Bindler，G.，Plieskej J.，Bakaherj N.，Gunduzj 1.，Ivanov, N.，Van der Hoevenj R.，Ganalj M.and Doninij P.(2011) A high density genetic map of tobacco (Nicotiana tabacum L)obtained from large scale microsatellite marker development.Theoretical andApplied Genetics, 123，219-230.[0020]PCR產(chǎn)物經(jīng)6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，共獲得183對在突變體和紅花大金元之間有多態(tài)性的引物，用這些引物對第5號BC1F2群體的10個綠色莖桿單株和10個白色莖桿單株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和電泳檢測，發(fā)現(xiàn)第5連鎖群上的引物PT61414在10個白色莖桿單株，即隱性單株中只有2個單株發(fā)生交換，而在10個綠色莖桿單株中沒有觀察到交換，我們進(jìn)一步用該引物檢測了第5號群體中剩余的41個隱性單株，最終從51個隱性單株中共發(fā)現(xiàn)6個交換單株，這表明該引物與第5號群體中的控制基因連鎖，我們假定該基因為c ；[0021]4)采用與步驟3相同的方法，提取第6-9號BC1F2群體中各10個綠色莖桿單株和10個白色莖桿單株的基因組DNA，用PT61414進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該引物與第6、7號群體中的控制基因連鎖，但不與第8、9號群體中的控制基因連鎖，這樣第5-7號群體對應(yīng)的上一代BClFl單株的基因型為Ccdd，而第8、9號群體對應(yīng)的上一代BClFl單株的基因型應(yīng)為ccDd ；
[0022]用183對多態(tài)性SSR引物對第8號群體的11個綠色莖桿單株和10個白色莖桿單株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和電泳檢測，發(fā)現(xiàn)第24連鎖群上的引物PT53716在10個白色莖桿單株，只有3個單株發(fā)生交換，而在11個綠色莖桿單株中沒有觀察到交換，我們進(jìn)一步用該引物檢測了該群體中剩余的38個隱性單株，最終從48個隱性單株中共發(fā)現(xiàn)4個交換單株，這表明該引物與d基因連鎖；這樣，我們分別定位了控制普通煙草白色莖桿性狀的2個非等位基因，它們分別位于普通煙草第5和24SSR標(biāo)記連鎖群上。
[0023]如上所述的定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因方法，該方法用于定位異源四倍體植物中控制同一性狀的兩個非等位基因。
[0024]上述的異源四倍體植物為普通煙草、甘藍(lán)型油菜、硬粒小麥。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:[0026]本方法結(jié)合了 2種傳統(tǒng)定位方法的優(yōu)點，可以既精確又快速地在BC1F2代對控制同一性狀的2個非等位基因進(jìn)行定位，特別適用于雜交不易操作的自交植物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]本發(fā)明有如下附圖:
[0028]圖1為實施例2中第5號BC1F2群體的10個綠色莖桿單株和10個白色莖桿單株的基因組DNA經(jīng)煙草SSR引物PT61414擴(kuò)增后的凝膠電泳圖；左側(cè)第一個條帶為紅花大金元，第二個條帶為突變體，第3-12為10個綠色莖桿單株，第13-22為10個白色莖桿單株；
星號表示交換單株；
[0029]圖2為實施例2中煙草SSR引物PT53716對第8號群體的11個綠色莖桿單株和10個白色莖桿單株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增后的凝膠電泳圖；左側(cè)第一個條帶為紅花大金元，第二個條帶為突變體，第3-13為11個綠色莖桿單株，第14-23為10個白色莖桿單株；
星號表示交換單株。
【具體實施方式】
[0030]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0031]實施例1
[0032]一種定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因的方法，具體的步驟如下:
[0033]I)選取具有某一性狀的植株，假定該性狀受2個非等位基因A和B控制，A和B突變后該性狀變?yōu)橥蛔冃誀?，那么野生型的基因型為AABB，表現(xiàn)為正常性狀，而突變體的基因型為aabb，表現(xiàn)為突變性狀；
[0034]2)將野生型和突變體雜交獲得Fl，F(xiàn)l的基因型為AaBb，表現(xiàn)同野生型，為正常性狀；
[0035]3)Fl自交后獲得F2分離群體，共有9種基因型AABB、AABb, AAbb, AaBB, AaBb,Aabb、aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/16，所以F2群體的正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為15:1 ；
[0036]4)將Fl用突變體回交，產(chǎn)生的BClFl分離群體共有4種基因型AaBb、Aabb、aaBb、aabb，各占1/4，所以BClFl群體的正常性狀和突變性狀分離比表現(xiàn)為3:1;
[0037]5)取若干正常性狀的BClFl單株自交，獲得各自的BC1F2分離群體；
[0038]由于1/3的BClFl正常性狀的單株基因型為AaBb，那么其自交產(chǎn)生的BC1F2分離群體與Fl相同，有9種基因型，正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為15:1 ;
[0039]另有1/3的BClFl單株基因型為Aabb，那么其自交產(chǎn)生的BC1F2分離群體有3種基因型AAbb、Aabb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為3:1;由于正常性狀和突變性狀的分離只與A的基因型的分離相關(guān)，含有A為正常性狀，不含A則為突變性狀，故這個BC1F2群體是關(guān)于A基因分離的群體，用分子標(biāo)記對A基因進(jìn)行定位；
[0040]剩余1/3的BClFl單株基因型為aaBb，，那么其自交產(chǎn)生的BC1F2分離群體有3種基因型aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為3:1;由于正常性狀和突變性狀的分離只與B的基因型的分離相關(guān)，含有B為正常性狀，不含B則為突變性狀，故這個BC1F2群體是關(guān)于B基因分離的群體，可以用分子標(biāo)記對B基因進(jìn)行定位；
[0041]實施例2
[0042]一種利用上述的方法定位控制普通煙草莖桿顏色的兩個非等位基因，具體的步驟如下:
[0043]I)正常中煙100的莖桿基部呈綠色，突變體的莖桿基部呈白色，用突變體和一個莖桿為綠色的煙草品種紅花大金元雜交，獲得雜種F1，F(xiàn)1自交獲得F2分離群體，F(xiàn)l同時用紅花大金元回交獲得BClFl分離群體。對F2和BClFl群體中莖桿綠色和白色的單株數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計和卡方檢驗，發(fā)現(xiàn)綠白分離比分別符合15:1和3:1，這表明白色莖桿性狀受2個隱性基因控制，我們分別將其命名為c和d，那么它們對應(yīng)的顯性基因分別為C和D ;
[0044]表1步驟I中F2及BClFl分離群體的表型統(tǒng)計
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因的方法，其特征在于具體的步驟如下: 1)選取具有某一性狀的植株，假定該性狀受2個非等位基因A和B控制，A和B突變后該性狀變?yōu)橥蛔冃誀?，那么野生型的基因型為AABB，表現(xiàn)為正常性狀，而突變體的基因型為aabb，表現(xiàn)為突變性狀； 2)將野生型和突變體雜交獲得Fl，F(xiàn)l的基因型為AaBb，表現(xiàn)同野生型，為正常性狀； 3)Fl自交后獲得F2分離群體，共有9種基因型AABB、AABb, AAbb, AaBB, AaBb, Aabb、aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/16，所以F2群體的正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為15:1 ； 4)將Fl用突變體回交，產(chǎn)生的BClFl分離群體共有4種基因型AaBb、Aabb、aaBb、aabb，各占1/4，所以BC lFl群體的正常性狀和突變性狀分離比表現(xiàn)為3:1; 5)取若干正常性狀的BClFl單株自交，獲得各自的BC1F2分離群體； 由于1/3的BClFl正常性狀的單株基因型為AaBb，那么其自交產(chǎn)生的BC1F2分離群體與Fl相同，有9種基因型，正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為15:1 ; 另有1/3的BClFl綠色單株基因型為Aabb，那么其自交產(chǎn)生的BC1F2分離群體有3種基因型AAbb、Aabb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為3:I ;由于正常性狀和突變性狀的分離只與A的基因型的分離相關(guān)，含有A為正常性狀，不含A則為突變性狀，故這個BC1F2群體是關(guān)于A基因分離的群體，用分子標(biāo)記對A基因進(jìn)行定位； 剩余1/3的BClFl綠色單株基因型為aaBb，，那么其自交產(chǎn)生的BC1F2分離群體有3種基因型aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性狀和突變性狀的分離比表現(xiàn)為3:1 ；由于正常性狀和突變性狀的分離只與B的基因型的分離相關(guān)，含有B為正常性狀，不含B則為突變性狀，故這個BC1F2群體是關(guān)于B基因分離的群體，可以用分子標(biāo)記對B基因進(jìn)行定位。
2.一種利用權(quán)利要求1所述的方法定位控制普通煙草莖桿顏色的兩個非等位基因，其特征在于具體的步驟如下: 1)正常中煙100的莖桿基部呈綠色，突變體的莖桿基部呈白色，用突變體和一個莖桿為綠色的煙草品種紅花大金元雜交，獲得雜種F1，F(xiàn)1自交獲得F2分離群體，F(xiàn)l同時用紅花大金元回交獲得BClFl分離群體。對F2和BClFl群體中莖桿綠色和白色的單株數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計和卡方檢驗，發(fā)現(xiàn)綠白分離比分別符合15:1和3:1，這表明白色莖桿性狀受2個隱性基因控制，我們分別將其命名為c和d，那么它們對應(yīng)的顯性基因分別為C和D ; 2)從步驟I中的BClFl分離群體中選取了9株莖桿綠色的單株自交，獲得各自的BC1F2分離群體，分別編號為1-9號；對這些群體中莖桿綠色和白色的單株數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計和卡方檢驗，發(fā)現(xiàn)1-4號的4個群體的綠白分離比符合15:1，而另外5-9號的5個群體的綠白分離比符合3:1，這表明第5個群體對應(yīng)的上一代BClFl單株的基因型為Ccdd或ccDd，可以用來對c基因或d基因進(jìn)行定位； 3)采用煙草SSR分子標(biāo)記進(jìn)行基因定位 根據(jù)普通煙草SSR標(biāo)記連鎖圖M，選取1376對SSR引物對突變體和紅花大金元的基因組DNA進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，共獲得183對在突變體和紅花大金元之間有多態(tài)性的引物，用這些引物對第5號BC1F2群體的10個綠色莖桿單株和10個白色莖桿單株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和電泳檢測，發(fā)現(xiàn)第5連鎖群上的引物PT61414在10個白色莖桿單株，即隱性單株中只有2個單株發(fā)生交換，而在10個綠色莖桿單株中沒有觀察到交換，我們進(jìn)一步用該引物檢測了第5號群體中剩余的41個隱性單株，最終從51個隱性單株中共發(fā)現(xiàn)6個交換單株，這表明該引物與第5號群體中的控制基因連鎖，我們假定該基因為c ； 4)采用與步驟3相同的方法，提取第6-9號BC1F2群體中各10個綠色莖桿單株和10個白色莖桿單株的基因組DNA，用PT61414進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該引物與第6、7號群體中的控制基因連鎖，但不與第8、9號群體中的控制基因連鎖，這樣第5-7號群體對應(yīng)的上一代BClFl單株的基因型為Ccdd，而第8、9號群體對應(yīng)的上一代BClFl單株的基因型應(yīng)為ccDd ； 用183對多態(tài)性SSR引物對第8號群體的11個綠色莖桿單株和10個白色莖桿單株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和電泳檢測，發(fā)現(xiàn)第24連鎖群上的引物PT53716在10個白色莖桿單株，只有3個單株發(fā)生交換，而在11個綠色莖桿單株中沒有觀察到交換，我們進(jìn)一步用該引物檢測了該群體中剩余的38個隱性單株，最終從48個隱性單株中共發(fā)現(xiàn)4個交換單株，這表明該引物與d基因連鎖；這樣，我們分別定位了控制普通煙草白色莖桿性狀的2個非等位基因，它們分別位于普通煙草第5和24SSR標(biāo)記連鎖群上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因方法，其特征在于該方法用于定位植物中控制同一性狀的兩個非等位基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因方法，其特征在于所述植物為異源四倍體植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的定位植物控制同一性狀的兩個非等位基因方法，其特征在于所述的異源四倍體植物為普通煙草、甘藍(lán)型油菜、硬粒小麥。
【文檔編號】C12Q1/68GK103947538SQ201410173939
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】劉貫山, 吳清章, 吳新儒, 蔣彩虹, 張雪峰, 孫玉合, 王元英 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所