多肽，分離的其多核苷酸，以及包含多肽的添加劑、其用途及方法
【專利摘要】以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其是具有選自SEQ ID No.1?15的氨基酸序列或其功能性變體的水解酶，其中在所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40％；以及包含所述多肽的添加劑；以及編碼所述多肽的分離的多核苷酸；以及用于用所述多肽來以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的方法。
【專利說明】多肽，分離的其多核苷酸，以及包含多肽的添加劑、其用途及 方法
[00011 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2014年8月27日、申請(qǐng)?zhí)枮?01480055221.7、發(fā)明名稱為"用于 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，分離的其多核苷酸，以及 包含多肽的添加劑、其用途及方法"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 本發(fā)明涉及用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生 物的多肽，編碼此類多肽的分離的多核苷酸，以及包含此類多肽的添加劑，還涉及此類多肽 的用途，以及涉及用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物 的方法。
[0003] 真菌毒素是絲狀真菌產(chǎn)生的次生代謝物。其一個(gè)重要的代表是世界范圍傳播的玉 米赤霉烯酮(ZEN)(以前稱為F-2毒素），其由許多鐮孢菌真菌產(chǎn)生。這些真菌尤其侵染栽培 植物，例如各種各樣的谷類，其中真菌侵染通常出現(xiàn)在收獲之前，其中真菌生長或真菌毒素 產(chǎn)生可以在收獲之前發(fā)生，或者在不適當(dāng)?shù)馁A藏的情況下也可以在收獲之后發(fā)生。FA0估 計(jì)，在世界范圍內(nèi)25%的農(nóng)產(chǎn)品被真菌毒素污染，這導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在一項(xiàng)最近在世 界范圍內(nèi)進(jìn)行的研究中，從2009年1月至2011年12月分析了總共23，781個(gè)樣品，其中81 %經(jīng) 測試為對(duì)于至少一種真菌毒素來說陽性和45%對(duì)于ZEN來說陽性?？梢栽谑澜绲乃械貐^(qū) 中，同樣地在所有經(jīng)測試的谷物類別和飼料類別，例如玉米、大豆粉、小麥、麥麩、DDGS(干酒 糟）中，以及在預(yù)制飼料混合物中，以直至100%的頻率發(fā)現(xiàn)ZEN。
[0004] ZEN是一種非甾類的、雌激素的、大環(huán)的、通過聚酮化合物物質(zhì)代謝途徑合成的內(nèi) 酯，其具有下述結(jié)構(gòu)式：
[0005]
[0006] 和IUPAC命名名稱"(2E，llS)-15，17-二羥基-ll-甲基-12-氧雜雙環(huán)[12·4·0]十八 碳-1(18)，2,14,16-四烯-7,13-二酮"。
[0007] 然而，在自然界中還存在有許多ZEN衍生物，其通過ZEN的酶促或化學(xué)修飾而形成。 關(guān)于此的例子為糖苷式的或含硫酸酯的ZEN綴合物，其由真菌、植物或哺乳動(dòng)物代謝來形 成；以及ZEN代謝物，其尤其在人或動(dòng)物機(jī)體中形成。在下文中，ZEN衍生物是指在自然界中 存在的或者通過化學(xué)或生物化學(xué)合成而制備的ZEN綴合物或ZEN代謝物，但特別地是指α-玉 米赤霉烯醇(α-ZEL ;(2E，7R，llS)-7，15，17-三羥基-ll-甲基-12-氧雜雙環(huán)[12·4·0]十八 碳-l(18)，2，14，16-四烯-13-酮）、β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL ;(2E，7S，llS)-7，15，17-三羥基-ll-甲基-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八碳-l(18)，2，14，16-四烯-13-酮）、a-玉米赤霉醇( a-2八1^(71?，113)-7，15，17-三羥基-11-甲基-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八碳-1(18)，14，16-三 烯-13-酮）、β-玉米赤霉醇（0-241^(73，113)-7，15，17-三羥基-11-甲基-12-氧雜雙環(huán) [12.4.0]十八碳-l(14)，15，17-三烯-13-酮）、玉米赤霉烯酮-14-硫酸酯(Z14S;[(2E，llS)- 15-羥基-11-甲基-7,13-二氧代-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八碳-1(18),2,14,16-四烯-17-基]硫酸氫酯）、玉米赤霉烯酮-14-糖苷(Z14G;(2E，11S)-15-羥基-11-甲基-17-[(3R，4S， 53,610-3,4,5-三羥基-6-(羥甲基）四氫吡喃-2-基]氧基-12-氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八碳-1 (18)，2，14，16-四烯-7，13-二酮）以及玉米赤霉酮(2厶1(113)-15，17-二羥基-11-甲基-12_ 氧雜雙環(huán)[12.4.0]十八碳-1(18)，14,16-三烯-7,13-二酮）。
[0008] ZEN，同樣地還有ZEN衍生物，尤其是α-ZEL、β-ZEL、Z14S、α-ZAL、β-ZAL、Z14G和ZAN， 由于其高的化學(xué)和物理穩(wěn)定性而還可以在經(jīng)加工的食品或飼料例如面包或啤酒中檢測到。
[0009] ZEN與雌激素受體結(jié)合并且可以引起激素紊亂，其中它在經(jīng)口攝取后立即被吸收， 并且被哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)變?yōu)閮蓚€(gè)立體異構(gòu)的代謝物，分別為a-ZEL和β-ZEL。在此，例如a-ZEL，還 有a-ZAL或ZAN具有比ZEN強(qiáng)得多的動(dòng)情效應(yīng)。經(jīng)綴合的ZEN衍生物有時(shí)具有比ZEN低的雌激 素活性，然而如果情況可能，ZEN可以從這些ZEN衍生物中重新被釋放到消化道中。
[0010]雖然ZEN具有相對(duì)低的急性毒性并且具有直至20，000mg/kg體重的口服LD50值，但 是在較長期攝入的情況下在動(dòng)物或人中出現(xiàn)亞急性和/或亞慢性的毒性效應(yīng)，例如致畸形 的、致癌的、動(dòng)情的和免疫抑制的效應(yīng)。被ZEN污染的飼料導(dǎo)致哺乳動(dòng)物中的發(fā)育障礙，其中 豬，特別是幼豬對(duì)于ZEN是極其敏感的。超過0.5ppm的在飼料中的ZEN濃度導(dǎo)致發(fā)育障礙，其 中例如超過1.5ppm的濃度可以導(dǎo)致豬中的超雌激素活性，和12ppm ZEN的濃度被認(rèn)為對(duì)牛 中的流產(chǎn)負(fù)責(zé)。由于玉米赤霉烯酮通過粘膜，特別是通過胃粘膜，但也通過口腔粘膜被迅速 吸收，因此立即的和尤其是定量的鈍化是必要的。在ZEN的口服給藥后30分鐘已經(jīng)可以在血 液中檢測到它們。在這種情況下，使用經(jīng)分離的針對(duì)微生物的酶具有優(yōu)點(diǎn)，例如更高的比活 性或更快的作用。由于ZEN的有害效應(yīng)，因而在歐盟存在有在食品中的強(qiáng)制性的ZEN上限以 及對(duì)于在飼料中的ZEN上限的推薦(EC N0:1881/2006)。
[0011] 為了減少食品或飼料的ZEN污染的最初策略是限制真菌生長，例如通過遵循"良好 的農(nóng)業(yè)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)"。這尤其包括，種子沒有害蟲和真菌侵染，或者及時(shí)從田地中移除農(nóng)業(yè)廢 料。此外，還可以通過使用殺真菌劑來減少田地上的真菌生長。在收獲之后，應(yīng)當(dāng)將收獲物 儲(chǔ)藏在低于15%的殘留水分含量和低的溫度下，以阻止真菌生長。同樣地，應(yīng)當(dāng)在再加工之 前去除由于真菌侵染而被污染的物料。盡管有著這一系列措施，但I(xiàn) .Rodriges和K.Naehrer (2012)仍然報(bào)道了，即使在具有最高農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的地區(qū)，例如USA和中歐，在2009年至2011年 中，分別有29 %和39 %的經(jīng)測試的玉米樣品被ZEN污染。
[0012] 用于從飼料或食品中去除ZEN的其他可能性為真菌毒素的吸附或轉(zhuǎn)化。為此所必 需的是，真菌毒素與吸附劑的結(jié)合在寬的pH范圍內(nèi)是強(qiáng)的且特異的，并且在胃腸區(qū)域內(nèi)的 整個(gè)消化過程中保持穩(wěn)定。雖然對(duì)于黃曲霉毒素可以有效地使用幾種非生物吸附劑，例如 活性炭、硅酸鹽或合成的聚合物，例如消膽胺，但是它們用于其他真菌毒素則受到限制。吸 附劑的主要缺點(diǎn)是其他有時(shí)候?qū)τ跔I養(yǎng)供給來說必需的分子的非特異性結(jié)合。在文獻(xiàn)中 同樣也描述了生物吸附劑，例如酵母或酵母提取物，然而生物吸附劑像非生物吸附劑一樣 也具有類似的限制。
[0013] 通過物理和化學(xué)處理來對(duì)ZEN進(jìn)行解毒也受到限制。通過熱處理，不能有效地使 ZEN鈍化，但是可以通過擠出和用氧化劑進(jìn)行處理，例如在80 °C下用10 %的過氧化氫溶液處 理16小時(shí)，來使ZEN含量降低83.9%。在飼料和食品的制備中擠出方法和氧化劑例如臭氧或 過氧化氫的使用，由于高的成本、品質(zhì)損失、有時(shí)候低的效率和低的特異性而受限。
[0014] 借助于微生物例如·真菌毒素絲抱酵母(Trichosporon mycotoxinivorans)、粉 紅粘帚霉(Gliocladium roseum)或枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)菌株或者從其中分 離出的酶例如水解酶或過氧化物酶來進(jìn)行ZEN的生物轉(zhuǎn)化也例如在E.Vekiru等人， Appl.and Environ.Microb.，2010,76,7,2353-2359中進(jìn)行了描述。
[0015] 從EP 0 938 575 B1中知曉了紅球菌屬（Rhodococcus)和諾卡氏菌屬(Nocardia) 的細(xì)菌，特別是球狀紅球菌(R. globerulus)、紅串紅球菌(R. erythropolis)和球形諾卡氏 菌(N · g 1 ob eru 1 a)的ZEN降解特性。
[0016] 從W0 02/076205中可獲知從粉紅粘帚霉中分離出的酶的ZEN降解作用，所述酶尤 其為α/β_水解酶、玉米赤霉烯酮水解酶1(ZHD1)，其借助于催化三元體來催化ZEN的降解。 [0017] 從W0 2012/113827中獲知重組Zonase，即ZEN降解酶，其在胃腸道中保持穩(wěn)定，特 別地在其中描述了微生物例如褐色雙歧嗜熱菌（Thermobifidia fusca)、脫葉鏈霉菌 (Streptomyces exfoliatus)、德氏食酸菌（Acidovorans delaf ieldii)和鏈霉菌屬物種 (Streptomyces sp.)〇
[0018] 能夠水解ZEN和/或至少一種ZEN衍生物的多肽或酶也可以稱為Zonase。
[0019] 下面所使用的術(shù)語取自專業(yè)用語并且總是以傳統(tǒng)的意義進(jìn)行使用，除非另外指 出。因此，術(shù)語"多核苷酸"涉及具有所有長度和序列的每一種類型的遺傳物質(zhì)，例如單鏈 和雙鏈DNA和RNA分子，包括調(diào)控元件、結(jié)構(gòu)元件、基因群、質(zhì)粒、全基因組及其片段。名稱"多 肽"包括蛋白質(zhì)，例如酶、抗體，以及具有直至500個(gè)氨基酸的多肽，例如肽抑制劑，蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)域，還有具有小的序列長度例如少于10個(gè)氨基酸的短多肽，例如受體、配體、肽激素、標(biāo) 簽等。名稱"在多核苷酸或多肽中的'位置'"涉及在所述多核苷酸或多肽的序列中單個(gè)特定 的堿基或氨基酸。
[0020] 現(xiàn)在，本發(fā)明旨在提供這樣的多肽以供使用，用所述多肽可成功實(shí)現(xiàn)將ZEN和/或 至少一種ZEN衍生物快速地且可靠地轉(zhuǎn)化為經(jīng)水解的ZEN和/或經(jīng)水解的ZEN衍生物。為了解 決該任務(wù)，本發(fā)明的特征主要在于，所述多肽是具有選自SEQ ID No.1-15的氨基酸序列或 其功能性變體的水解酶，其中在所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨基酸序列之間的序列同 一 1性為至少40%。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，名稱"序列同一性"涉及序列同一性百分比。對(duì)于氨基酸序列和核苷 酸序列，序列同一性可以目視測定，但是優(yōu)選地用計(jì)算機(jī)程序來計(jì)算出來。還在序列區(qū)段內(nèi) 進(jìn)行序列比較，其中參考序列的連續(xù)序列被理解為區(qū)段，并且優(yōu)選地包含該序列的保守區(qū) 域。
[0022] 在當(dāng)前的情況下，序列同一性借助于程序NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)來進(jìn)行測定，特別地對(duì)于多肽，用BLASTP，和對(duì)于多核苷酸，用BLASTN，其提供 在 "National Center for Biotechnology Information" 的主頁（NCBI ; http :// www·ncbi ·nlm.nih.gov/)上以供使用。因此，可能的是，根據(jù)Altschul等人，1997(Nucleic Acids Res. ,25:3389-3402)的算法，將兩個(gè)或更多個(gè)序列互相進(jìn)行比較。為了本發(fā)明的目 的，使用2013年5月15日的那個(gè)版本的程序。作為程序設(shè)置，考慮基本設(shè)置，但是特別地，對(duì) 于氨基酸序列比較："最大革G序列（max target sequence)" = 100 ; "期望閾值（expected threshold)" = 10; "字長(word size)" = 3; "矩陣（matrix)" = BL0S0M62; "缺口成本（gap costs)" = "存在（Existence) :11;延伸（Extention):l" ； "計(jì)算調(diào)整（computational adjustment)" = "條件式組成得分矩陣調(diào)整（Conditional compositional score matrix adjustment)" ；以及對(duì)于核苷酸序列比較:字長：11;期望值(Expect value): 10;缺口成本： 存在=5,延伸=2;過濾器(Filter)=低復(fù)雜度激活的（low complexity activated);匹 配/錯(cuò)配得分(Match/Mismatch Scores) :2，_3;過濾器字符串（Filter String) :L;m。
[0023]術(shù)語"功能性多肽變體"或"功能性變體" 一方面涉及多肽的"等位基因變體"和多 肽的"功能性片段"，另一方面涉及多肽的"修飾"，其中酶促功能基本上未改變。名稱"等位 基因變體"涉及這樣的多肽，所述多肽通過在自然界中隨機(jī)發(fā)生的核苷酸序列突變而產(chǎn)生 并且引起氨基酸序列的改變，其中其酶促功能未受影響。"修飾"可以例如是與多肽的C-末 端或N-末端融合物或者經(jīng)突變的多肽，其中突變可以通過至少一個(gè)氨基酸的置換、插入或 缺失來獲得，這特別地通過位點(diǎn)特異性誘變或隨機(jī)誘變、重組和/或任何其他蛋白質(zhì)工程方 法來進(jìn)行。術(shù)語"置換"、"插入"和"缺失"以在基因技術(shù)中通常的和專業(yè)人員熟悉的含義來 進(jìn)行使用。術(shù)語"功能性片段"涉及多肽的部分或部分序列或者其功能性變體的部分或部分 序列，其中酶促功能基本上得到保留。當(dāng)酶促反應(yīng)機(jī)制保持不變，即在相同的位置處水解該 真菌毒素，并且"功能性變體"相對(duì)于原始多肽而言的比殘余活性為至少5%，優(yōu)選地至少 10%，特別地至少50%時(shí)，那么基本上保留了酶促功能。具有有著SEQ ID No. 1-15的氨基酸 序列的多肽是另一個(gè)或者同一個(gè)酶的功能性等位基因變體，其中所述序列各自來源于不同 的微生物。這從下列中可清楚地看出來:借助于序列同一性百分比而測量出的接近的相互 親緣關(guān)系，以及這樣的事實(shí)，即所有多肽通過相同的降解機(jī)制作用于ZEN和ZEN衍生物。 [0024]由于具有SEQ ID No.1-15的多肽的氨基酸序列相互間的相似性，因而可能的是， 這些多肽之一的功能性變體與多于一個(gè)所要求保護(hù)的具有SEQ ID No. 1-15的多肽具有至 少40 %的序列同一性。
[0025]通過選擇此類氨基酸序列或其功能性變體，查明了令人驚訝地快速且完全的ZEN 和/或至少一種ZEN衍生物的水解。
[0026]如相應(yīng)于本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的進(jìn)一步發(fā)展方案那樣，所述多肽具有這樣的氨基酸 序列，其包含至少一個(gè)保守氨基酸序列區(qū)段或其功能性變體，其中所述氨基酸序列區(qū)段的 功能性變體具有至少70%，優(yōu)選地至少84%，更優(yōu)選地至少92%，和最優(yōu)選地至少98%的序 列同一性，并且所述至少一個(gè)保守氨基酸序列區(qū)段選自具有SEQ ID No. 1的序列的氨基酸 序列+24 至+50、+52至+77、+79至+87、+89至+145、+ 150至+171、+ 177至+193、+223至+228、+ 230 至+237、+239 至+247、+249 至+255、+257 至+261、+263至+270、+272至+279、+297至+301、+ 303至+313、+24至328、+1至+328。通過至少一個(gè)此類保守氨基酸序列區(qū)段的存在，可成功提 供這樣的多肽以供使用，所述多肽除了 ZEN和/或至少一種ZEN衍生物的快速且完全的水解 外，還具有相比于迄今已知的ZEN降解多肽而言特別高的活性值。
[0027]當(dāng)如相應(yīng)于本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步改造方案那樣，所述功能性變體具有至少一個(gè)選 自一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失和插入的氨基酸修飾時(shí)，依然可以取得良好的結(jié)果。 [0028] 通過如此地進(jìn)一步改造本發(fā)明，即使得所述多肽具有至少0.01U/mg，優(yōu)選地至少 0.1U/mg，特別地至少lU/mg的比活性，和/或具有最高50μΜ，優(yōu)選地最高3.5μΜ，特別地最 高0.5μΜ的以水解方式裂解ΖΕΝ的Km值，和/或具有至少0.058+ 1，優(yōu)選地至少0.，特別地 至少的以水解方式裂解ZEN的1^*值，和/或具有至少Ο.ΟΟΟΟΙμΜ^ΕΓ 1，優(yōu)選地至少 0.0001μΜ-1，特別地至少〇. 〇〇1μΜ-1的以水解方式裂解ΖΕΝ的vmax值，ΖΕΝ和/或ΖΕΝ衍生 物可以被特別快速且完全地水解，特別是解毒。
[0029] 如相應(yīng)于本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的進(jìn)一步發(fā)展方案那樣，所述多肽包含選自SEQ ID No. 2、5-7、9、11、12和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個(gè)所 述氨基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在pH 5.0下的pH穩(wěn)定性為至少 15%，優(yōu)選地50%，和特別優(yōu)選地至少90%。通過這樣的進(jìn)一步發(fā)展方案可以確保，所述多 肽在酸性介質(zhì)中，因此例如在哺乳動(dòng)物的胃中的情況下，也將玉米赤霉烯酮和/或至少一種 玉米赤霉烯酮衍生物裂解或解毒。在此，將多肽的pH穩(wěn)定性定義為所述多肽在pH 5.0下的 殘余活性百分比，相對(duì)于在各自最佳pH下的活性而言。
[0030] 如相應(yīng)于本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的進(jìn)一步發(fā)展方案那樣，所述多肽包含選自SEQ ID No.l、2、5-7、9、ll和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個(gè)所 述氨基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在30 °C和75°C之間，優(yōu)選地38°C 和55°C之間，特別優(yōu)選地38°C和52 °C之間的溫度范圍內(nèi)具有最高的酶促活性。通過這樣的 本發(fā)明的進(jìn)一步發(fā)展方案確保了，玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物在中 溫溫度下，特別是在人和有用動(dòng)物的體溫下，也被所述多肽水解或解毒。將所述多肽具有最 高酶促活性時(shí)所處的溫度定義為所述多肽的最佳溫度。
[0031 ]如相應(yīng)于本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的進(jìn)一步發(fā)展方案那樣，所述多肽包含選自SEQ ID No. 1、5、6、9、11、12和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個(gè)所 述氨基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽是溫度穩(wěn)定的，直至90°C，優(yōu)選地 75°C，和特別優(yōu)選地60°C的溫度。由此確保了，所述多肽和其酶促功能即使在提高的溫度負(fù) 荷下(例如這可以是在容器中進(jìn)行運(yùn)輸期間或在飼料粒化期間的情況)也基本上保持完整。 多肽的溫度穩(wěn)定性被定義為這樣的溫度，在該溫度下所述多肽在15分鐘的預(yù)溫育后具有 50 %的殘余活性，相比于在各自最佳溫度下的活性而言。
[0032]因此，所述多肽可以如此地來進(jìn)行選擇，從而它是對(duì)于不依賴于氧和無輔因子地 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或ZEN衍生物的酯基團(tuán)來說合適的α/β-水解酶，其具有催 化所述水解式裂解的氨基酸三元體，該三元體由絲氨酸，一種選自谷氨酸和天冬氨酸的酸 性氨基酸，特別是天冬氨酸，以及組氨酸組成，并且該催化三元體為例如S128、D264和Η303， 其中描述了相對(duì)于SEQ ID No. 1的定位。
[0033]用SEQ ID No. 1-15的多肽中的每一個(gè)可成功按照下述反應(yīng)機(jī)制在玉米赤霉稀酮 或其衍生物的酯基團(tuán)處實(shí)現(xiàn)ZEN和ZEN衍生物的水解：
[0034]
[0035] ZEN至無毒的經(jīng)水解的玉米赤霉烯酮(HZEN)或經(jīng)水解的ZEN衍生物的水解通過根 據(jù)本發(fā)明的多肽，特別是所述α/β_水解酶來進(jìn)行。HZEN至經(jīng)脫羧的經(jīng)水解的ZEN (DHZEN)或 經(jīng)脫羧的經(jīng)水解的ΖΕΝ衍生物的進(jìn)一步的脫羧通常自發(fā)地進(jìn)行。
[0036]特別地，借助于上面提及的催化三元體，可成功實(shí)現(xiàn)完全水解ΖΕΝ和ΖΕΝ衍生物，其 中該降解反應(yīng)具有良好的pH穩(wěn)定性，特別是在酸性范圍內(nèi)的pH值下。
[0037] 令人驚訝地已證實(shí)，用在由上面提及的催化三元體的絲氨酸之前的3個(gè)氨基酸和 之后的3個(gè)氨基酸組成的序列區(qū)段中包含至少一個(gè)選自Y、Q、N、T、K、R、E、D的極性氨基酸和 至少一個(gè)選自？、1丄、1、￥^、6、？的非極性氨基酸的多肽，可成功取得依然良好的結(jié)果并且 此外還改善至少一個(gè)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
[0038] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的進(jìn)一步改造方案中，所述多肽在至少一個(gè)下列位置處具有 關(guān)于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一個(gè)突變：22、23、25、26、27、29、31、32、35、37、42、 43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、132、141、 146、148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、196、197、 198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、229、231、 233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、277、280、 281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、319、321、 323、325和326。這些位置得自具有SEQ ID No.l的多肽和與該序列具有高的同一性程度和 特別地有活性的具有SEQ ID No.2-6的多肽之間的序列差異。通過在這些位置中的至少一 個(gè)處如此地改變具有SEQ ID No.l的多肽，即在該位置處采用SEQ ID No.2-6的氨基酸變 體，可成功顯示，這些位置對(duì)于所述多肽的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)具有顯著的影響，并且此外，SEQ ID No.l與具有高的序列同一性程度的SEQ ID No.2-6的組合導(dǎo)致更高的活性。
[0039]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步改造方案，所述多肽在關(guān)于SEQ ID No.l的氨基酸序列 中具有至少一個(gè)選自下列的突變:D22A、S23Q、S23L、N25D、I26V、F27Y、F27H、S29P、R31A、 F32Y、R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、S69G、 P72E、V73A、A78S、N80H、F84Y、I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、L132V、 A141S、I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、L170R、 A172G、A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、V197C、 V197R、E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、Q209R、 L210A、L210S、AP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、K222Q、 G229A、A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、S248T、 S248N、S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、E269H、 E269N、L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、I285L、 I286M、R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、D309A、 A311P、A314V、L317F、S319Q、S319P、S319R、S321A、S321T、T323A、P325A、A326P。用這樣的多 肽，可成功實(shí)現(xiàn)在短的時(shí)間內(nèi)完全水解ZEN，特別是使其解毒，其中所述多肽的比活性為至 少6.00U/mg，優(yōu)選地至少7.00U/mg，特別地至少8.00U/mg。單位"U"或者"Uni t"是絕對(duì)催化 活性的量度，并且通過在32°C下在50mMTris-HCl緩沖液(pH8.2)中水解lμMOlZEN/分鐘 來定義，其中"催化活性"是指在確定的反應(yīng)條件下底物的酶促轉(zhuǎn)化，和"比活性"是指催化 活性與多肽質(zhì)量濃度(質(zhì)量/體積單位)之比。
[0040] 通過如此地產(chǎn)生所述多肽，即包含至少一個(gè)具有SEQ ID No. 32-50的下列氨基酸 基序，可成功提供這樣的多肽以供使用，該多肽具有至少7.00U/mg，優(yōu)選地至少8.00U/mg的 比活性。令人驚訝地已顯示，當(dāng)包含至少一個(gè)具有有著SEQ ID No.51-58的序列的下列氨基 酸基序時(shí)，所述多肽的酶促活性更進(jìn)一步增加，例如相對(duì)于包含7個(gè)氨基酸的基序而言。當(dāng) 包含至少一個(gè)具有有著SEQ ID No.59-69的序列的下列氨基酸基序時(shí)，達(dá)到更加高的比活 性。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步改造方案，所述多肽在至少一個(gè)位置處包含至少一個(gè)保 守氨基酸置換，其中所述保守氨基酸置換選自：G至A;或A至G、S;或V至1、1^^、1\3 ;或1至￥、 L、M;或L至I、M、V;或 Μ至L、I、V;或P至A、S、N;或F至Y、W、H;或Y至F、W、H;或W至Y、F、H;或R 至K、 E、D;或K至R、E、D;或H至Q、N、S;或D或N、E、K、R、Q ;或E至Q、D、K、R、N;或S至T、A;或T至S、V、A; 或C至S、T、A;或N至D、Q、H、S;或Q至E、N、H、K、R的置換。其中名稱"保守氨基酸置換"涉及氨基 酸由被專業(yè)人員視為保守的（即具有類似的特殊特性的)其他氨基酸來進(jìn)行的置換。此類特 殊特性為例如氨基酸的大小、極性、疏水性、電荷或PK值。保守突變是指例如將一個(gè)酸性氨 基酸置換成另一個(gè)酸性氨基酸，將一個(gè)堿性氨基酸置換成另一個(gè)堿性氨基酸，或者將一個(gè) 極性氨基酸置換成另一個(gè)極性氨基酸。
[0042] 用這樣的保守氨基酸置換，可成功制備出功能性多肽變體，其比活性相比于親本 多肽而言大約一樣強(qiáng)，然而優(yōu)選地增加了至少0.1U/mg。
[0043] 此外，本發(fā)明還旨在，提供分離的多核苷酸以供使用，用所述多核苷酸可成功制備 出用于快速且可靠地以水解方式裂解ZEN和/或至少一種ZEN-衍生物的多肽。
[0044] 為了解決該任務(wù)，本發(fā)明的特征在于，所述分離的多核苷酸具有編碼多肽的核苷 酸序列，其中所述多肽具有水解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的特性； 并且所述核苷酸序列編碼至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至11之一的多肽;和/或所述核苷酸序列 與至少一種選自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列具有序列同一性程度，其中所選擇的核苷 酸序列為至少40%;和/或所述核苷酸序列在中等嚴(yán)緊條件下與至少一種選自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列雜交，和/或與具有至少200個(gè)核苷酸，特別是至少100個(gè)核苷酸的其 部分序列雜交，和/或與上述核苷酸序列或其部分序列的互補(bǔ)鏈雜交。
[0045] 待表達(dá)的核苷酸序列，特別是其三聯(lián)體(密碼子），通常隨著宿主細(xì)胞而變化，從而 密碼子偏倚性隨著宿主細(xì)胞而優(yōu)化。這導(dǎo)致，具有遠(yuǎn)低于80 %，還有低于70%或低于60 %的 序列同一性程度的多核苷酸也可以編碼同一種多肽。用于確定序列同一性程度的序列比較 還必須在序列區(qū)段內(nèi)進(jìn)行，其中區(qū)段是指參考序列的連續(xù)序列。對(duì)于核苷酸序列，序列區(qū)段 的長度通常為15至600。
[0046] 借助于現(xiàn)有的分離的核苷酸序列或序列區(qū)段，可成功產(chǎn)生具有通常至少15、30或 40個(gè)核苷酸的長度的核酸探針。借助于此類探針(其通常另外還例如用咕、 3￥、358、生物素或 抗生物素蛋白進(jìn)行標(biāo)記)可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法來鑒定編碼具有降解ZEN和/或ZEN衍生物 的作用的多肽的核苷酸序列。作為用于鑒定此類序列的起始材料，可以考慮例如單個(gè)微生 物的DNA、RNA或cDNA，基因組DNA文庫，或者cDNA文庫。
[0047] 對(duì)于具有至少100個(gè)核苷酸的長度的核苷酸序列或核苷酸探針，中等嚴(yán)緊條件被 定義為在42°C下在包含0.3 %十二烷基硫酸鈉（SDS)、200μg/ml經(jīng)剪切和變性的鮭精DNA和 35% 甲酰胺的配備有5XNaCl的Na-EDTA緩沖液（SSPE，0.9M NaCl，60mM NaH2P〇4,6mM EDTA) 中的預(yù)雜交和雜交，隨后為標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡條件，其中最后將載體材料用2 X的氯化鈉-檸檬酸鹽緩沖液(SSC，300mM NaCl和30mM檸檬酸三鈉，0.2%SDS)在55°C下洗滌15分鐘，進(jìn) 行二次。
[0048] 對(duì)于具有15個(gè)核苷酸至100個(gè)核苷酸的長度的核苷酸序列或核苷酸探針，中等嚴(yán) 緊條件被定義為在由0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH = 7.6、6mM EDTA、0.5%NP-40、1X Denhardt溶液、ImM焦磷酸鈉、ImM磷酸二氫鈉、Ο. ImM ATP和0.2mg/ml酵母RNA組成的緩沖液 中的預(yù)雜交和雜交，其中在比計(jì)算出的解鏈溫度(Tm)低5°C至10°C的溫度下進(jìn)行預(yù)雜交和 雜交，其中Tm通過按照Bolton和McCarthy(1962,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,48:1390)進(jìn)行的計(jì)算來確定。隨后，該試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡條件下 繼續(xù)進(jìn)行（J · Sambrook，E.F.Fritsch 和 T. Man iati s ,1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor,New York)。最后，將載體材料用包含 0.1 % SDS的6 X SCC緩沖液洗滌15分鐘，進(jìn)行一次;和在各自處于比計(jì)算出的Tm低5°C至10°C 的溫度下用6 X SSC緩沖液洗滌15分鐘，進(jìn)行兩次。
[0049] 此外，本發(fā)明還旨在，提供添加劑以供使用，用所述添加劑可成功實(shí)現(xiàn)在確定的或 復(fù)雜的基質(zhì)中，例如在飼料或食品中，快速且可靠地以水解方式裂解ZEN和/或至少一種ZEN 衍生物。
[0050] 為了解決該任務(wù)，提供了以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉 烯酮衍生物的添加劑以供使用，其中所述添加劑包含至少一種具有選自SEQ ID No. 1-15的 氨基酸序列或其功能性變體的多肽，其中在所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨基酸序列之 間的序列同一性為至少40% ;并且任選地包含助劑。
[00511用這樣的添加劑，可成功實(shí)現(xiàn)ZEN和/或至少一種ZEN衍生物向經(jīng)水解的ZEN和/或 經(jīng)水解的ZEN衍生物的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化。例如對(duì)于在工業(yè)過程中ZEN和/或ZEN衍生物的立體選 擇性水解，也可以考慮該添加劑。
[0052]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的進(jìn)一步改造方案中，如此地產(chǎn)生所述添加劑，即所述助劑 選自至少一種惰性載體，以及任選地，其他成分，例如維生素和/或礦物質(zhì)和/或酶和/或其 他用于使真菌毒素解毒的組分。通過使用這樣的添加劑，可以例如在飼料或食品中確保，所 任選地包含的ZEN和/或ZEN衍生物的量安全可靠地被水解特別是解毒至如此程度，從而對(duì) 于攝取這些飼料或食品的受試者的機(jī)體沒有有害效應(yīng)。
[0053] 在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明的多肽也可以存在于酶制劑中，所述酶制劑除了包含 至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽外，還包含至少一種酶，所述酶例如參與蛋白質(zhì)的降解，例如蛋 白酶，或者所述酶參與淀粉或纖維或脂肪或糖原的代謝，例如淀粉酶、纖維素酶或葡聚糖 酶，以及例如水解酶、脂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、植酸酶、木聚糖酶和/或其 組合。
[0054] 本發(fā)明的其他使用范圍為酶制劑，其除了包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽外，還 包含至少一種用于使真菌毒素解毒的組分，例如真菌毒素降解酶，例如黃曲霉毒素氧化酶、 麥角胺水解酶、麥角胺酰胺酶、玉米赤霉烯酮酯酶、玉米赤霉烯酮內(nèi)酯酶、赭曲毒素酰胺酶、 串珠鐮孢菌素羧酸酯酶、串珠鐮孢菌素氨基轉(zhuǎn)移酶、氨基多元醇氨基氧化酶、脫氧瓜萎鐮菌 醇環(huán)氧化物水解酶;和/或至少一種降解真菌毒素的微生物，例如枯草芽孢桿菌;和/或至少 一種結(jié)合真菌毒素的組分，例如微生物細(xì)胞壁或無機(jī)材料例如膨潤土。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的進(jìn)一步改造方案，在所述添加劑中，所述多肽以最 高10，000U/g，優(yōu)選地最高1，000U/g，更優(yōu)選地最高100U/g，和最優(yōu)選地最高10U/g的濃度包 含在其中，由此可成功實(shí)現(xiàn)將ZEN和/或ZEN衍生物快速地，和特別地在其由消耗了被污染的 飼料或食品的受試者(特別是哺乳動(dòng)物）的身體吸收之前，已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒或低毒的代謝 物，特別是HZEN和DHZEN。
[0056]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步改造方案，所述多肽以經(jīng)包囊或經(jīng)包衣的形式存在，其 中對(duì)于所述包囊或包衣過程，可以考慮標(biāo)準(zhǔn)方法，例如在W0 92/12645中所描述的那些。通 過所述包囊或包衣過程，可成功實(shí)現(xiàn)將所述多肽運(yùn)輸至其使用位點(diǎn)，而沒有改變，特別是沒 有降解或損害，從而在保護(hù)殼溶解(例如在動(dòng)物的消化道中）之后，所述多肽才開始起作用， 由此在酸性的、富含蛋白酶的和缺氧的介質(zhì)中也可以達(dá)到ZEN和/或ZEN衍生物的更加有針 對(duì)性的、快速的和完全的降解。此外，通過所述包囊或包衣過程，還可成功提高在所述添加 劑中所述多肽的溫度穩(wěn)定性。
[0057]此外，本發(fā)明還旨在，所述添加劑用于以水解方式裂解在飼料（其特別地用于豬、 家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖）中、在食物中或在干酒糟中的玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮 衍生物的用途。通過根據(jù)本發(fā)明來使用所述添加劑，可成功實(shí)現(xiàn)將在食物或飼料中或者在 干酒糟中所包含的ZEN和/或ZEN衍生物水解或解毒，其中在大約lU/g被污染的飼料或食物 的多肽濃度的情況下已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了這樣的解毒。
[0058]此外，本發(fā)明還旨在，提供這樣的方法以供使用，用所述方法使得ZEN和/或至少一 種ZEN衍生物的快速且可靠的水解式裂解成為可能。
[0059] 為了解決該任務(wù)，如此地來施行所述方法，從而玉米赤霉稀酮和/或至少一種玉米 赤霉烯酮衍生物被具有選自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性變體的多肽水解，其 中在所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40%。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步改造方案，如此地來施行所述方法，從而其中在相應(yīng)于 本發(fā)明的添加劑中使用所述多肽。
[0061] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的進(jìn)一步發(fā)展方案，如此地來施行所述方法，從而其中將所述多肽 或添加劑與被玉米赤霉烯酮和/或被至少一種玉米赤霉烯酮衍生物污染的飼料或食物相摻 混，使所述被污染的飼料或食物與濕氣相接觸，并且所述多肽或添加劑水解在所述被污染 的飼料或食物中所包含的玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物。在濕潤的飼 料或食物例如麥芽漿或糊漿的情況下，玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物 的水解在經(jīng)口攝取之前在該濕潤的飼料或食物中發(fā)生。通過該方法可以確保，最大程度地 消除玉米赤霉烯酮和玉米赤霉烯酮衍生物對(duì)于人和動(dòng)物的有害效應(yīng)。在此，濕氣是指水或 含水液體的存在，其中例如唾液或其他在消化道中存在的液體也屬于該范疇。消化道被定 義為口腔、咽（咽喉）、食管和胃腸道或者其等價(jià)物，其中在動(dòng)物中可以存在不同的名稱或者 個(gè)別成分可以不存在于動(dòng)物的消化道中。
[0062] 本發(fā)明的方法還可以如此地來施行，從而將所述飼料或食物在經(jīng)口攝取之前進(jìn)行 粒化。
[0063]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步改造方案，如此地來施行所述方法，從而至少70%，優(yōu)選 地至少80 %，特別優(yōu)選地至少90 %的所述玉米赤霉稀酮和/或至少一種玉米赤霉稀酮衍生 物被水解。由此可以預(yù)防在動(dòng)物或人中的亞急性和/或亞慢性的毒性效應(yīng)，例如致畸形的、 致癌的、動(dòng)情的和免疫抑制的效應(yīng)。
[0064]下面將依據(jù)實(shí)施例以及附圖更詳細(xì)地闡明本發(fā)明。其中：
[0065]圖1顯示了通過具有SEQ ID No.1的多肽來進(jìn)行的ZEN的隨時(shí)間的降解以及代謝物 HZEN和DHZEN的增加，其中在圖1A中，所述多肽未加標(biāo)簽，在圖1B中，所述多肽具有C-末端6 XHis標(biāo)簽，和在圖1C中，所述多肽具有N-末端6XHis標(biāo)簽。
[0066] 圖2顯示了具有SEQ ID No. 1的多肽的米-曼(Michaelis-Menten)動(dòng)力學(xué)。
[0067] 圖3顯示了通過經(jīng)純化的具有SEQ ID No.l(圖3A)、SEQ ID No.2(圖3B)、SEQ ID Νο·5(圖3C)、SEQ ID Νο·6(圖3D)、SEQ ID Νο·7(圖3E)、SEQ ID Νο·9(圖3F)、SEQ ID No.ll (圖3G)、SEQ ID No.12(圖3H)和SEQ ID No.15(圖31)的多肽來進(jìn)行的ZEN的隨時(shí)間的降解 以及代謝物HZEN和DHZEN的增加，其中所有序列均具有C-末端6 X Hi s標(biāo)簽。
[0068]實(shí)施例1:編碼能夠以水解方式裂解ZEN和/或至少一種ZEN衍生物的多肽的多核苷 酸的修飾、克隆和表達(dá)
[0069] 按照說明書，使用"Quick-change Site-directed Mutagenesis Kits" (Stratagene)，借助于PCR，通過核苷酸序列的突變來進(jìn)行氨基酸置換、插入或缺失。備選 地，為此還購進(jìn)了完整的核苷酸序列(GeneArt)。借助于PCR誘變而產(chǎn)生的或從GeneArt購進(jìn) 的核苷酸序列在氨基酸水平上可選地另外還包含C-末端或N-末端6 X His標(biāo)簽，并且借助 于標(biāo)準(zhǔn)方法將其整合到用于在大腸桿菌(E. col i)或巴斯德畢赤酵母(P. pastor is)中進(jìn)行 表達(dá)的表達(dá)載體之中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌或巴斯德畢赤酵母中，以及在大腸桿菌或巴斯德畢 赤酵母中進(jìn)行表達(dá)（J.M.Cregg，Pichia Protocols,第二版，ISBN-10:1588294293、2007; J · Sambrook等人，2012，Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor)，其中也可以為該任務(wù)考慮任何其他合適的宿主細(xì)胞。
[0070] 名稱"表達(dá)載體"涉及能夠在體內(nèi)或在體外表達(dá)基因的DNA構(gòu)建體。特別地，該名稱 涵蓋這樣的DNA構(gòu)建體，其適合于將編碼所述多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，以便在 那里整合到基因組中或者游離地存在于染色體外空間中，并且在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)編碼所述多肽 的核苷酸序列和任選地從細(xì)胞中提取出所述多肽。
[0071] 名稱"宿主細(xì)胞"涉及所有這樣的細(xì)胞，其要么包含待表達(dá)的核苷酸序列，要么包 含表達(dá)載體，并且能夠制備根據(jù)本發(fā)明的多肽。特別地，該名稱涵蓋原核細(xì)胞和/或真核細(xì) 胞，優(yōu)選地巴斯德畢赤酵母，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，鏈霉菌屬(Streptomyces)，漢遜酵母 屬（Hansenula)，木霉屬（Trichoderma)，乳桿菌屬（Lactobacillus)，曲霉屬 (Aspergillus)，植物細(xì)胞，和/或芽孢桿菌屬(Bacillus)、木霉屬或曲霉屬的孢子。
[0072] 為了測定多肽的催化特性，在大腸桿菌的情況下考慮可溶的細(xì)胞裂解物，或者在 巴斯德畢赤酵母的情況下考慮培養(yǎng)物上清液。為了測定Km值、v max UP比活性，借助于標(biāo) 準(zhǔn)方法以色譜法方式通過鎳-Sepharose柱選擇性地富集所述多肽。蛋白質(zhì)濃度的測定借助 于標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行，要么采用BCA方法(Pierce BCA Protein Assay KitProd#23225)，然而 優(yōu)選地采用用關(guān)于各自蛋白質(zhì)的比消光系數(shù)來實(shí)施的光度法，所述比消光系數(shù)用在 http: //web · expasy · org/protparam上在線可用的程序 "ProtParam" 來計(jì)算（Gasteiger E · 等人，Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server,John M. Walker(編輯）：The Proteomics Protocols Handbook,Humana Press,2005,第571-607 頁)。
[0073] 實(shí)施例2:序列同一性以及保守氨基酸序列區(qū)段的確定
[0074]在具有有著SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列的多肽的總多肽長度上的相互之間的 序列同一性百分比（表1)的確定可以借助于程序BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)，特別是用可以在"國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)" 的主頁(NCBI;http: //www.ncbi .nlm.nih. gov/)上使用的BLASTP來進(jìn)行。因 此，可能的是，根據(jù)Altschul等人，1997(Nucleic Acids Res. (1997)25:3389-3402)的算 法，將兩個(gè)或更多個(gè)序列互相進(jìn)行比較。作為程序設(shè)置，考慮基本設(shè)置，但是特別地："最大 靶序列" =100; "期望閾值" =10; "字長" =3; "矩陣" =BLOSOM62; "缺□成本"="存在：11; 延伸：Γ ; "計(jì)算調(diào)整"="條件式組成得分矩陣調(diào)整"。
[0075] 為了確定保守氨基酸序列區(qū)段，借助于軟件⑶BALT(J. S.Papadopoulos和 R.Agarwala,2007,COBALT:constraint-based alignment tool for multiple protein sequences ,Bioinformatics23:1073-79)來調(diào)節(jié)對(duì)準(zhǔn)相互之間具有至少70%的序列同一性 的具有SEQ ID No. 1 -6的多肽，其中考慮標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，特別是下列參數(shù)（"缺口罰分" ：-11，-1; "末端缺口罰分"：-5，-l;"使用RPSBLAST(UseRPSBLAST)" ：on;"BlastE-值"：0·003;"發(fā) 現(xiàn)保守列和重新計(jì)算（Find Conserved columns and Recompute)" ：on; "使用查詢聚族 (use query clusters)''：on; "字長"：4;"可能聚族距離''（may cluster distance) :0·8; "字母表"：常規(guī)；"同源性保守設(shè)置(Homology conversation setting) :3bits)。該分析的 結(jié)果描繪出了保守氨基酸。保守氨基酸序列區(qū)段被定義為具有至少5個(gè)連續(xù)的保守氨基酸 的下列區(qū)域：即關(guān)于具有SEQ ID No. 1的序列，位置+24至位置+50的區(qū)段A、位置+52至位置 +77的區(qū)段B、位置+79至位置+87的區(qū)段C、位置+89至位置+145的區(qū)段D、位置+150至位置+ 171的區(qū)段E、位置+177至位置+193的區(qū)段F、位置+223至位置+228的區(qū)段G、位置+230至位置 +237的區(qū)段H、位置+239至位置+247的區(qū)段I、位置+249至位置+255的區(qū)段J、位置+257至位 置+261的區(qū)段K、位置+263至位置+270的區(qū)段L、位置+272至位置+279的區(qū)段M、位置+297至 位置+301的區(qū)段N和位置+303至位置+313的區(qū)段0。
[0076]如上面所描述的那樣，進(jìn)行多肽相互之間的以及獨(dú)個(gè)多肽的保守氨基酸序列區(qū)段 相對(duì)于具有SEQ ID No. 1的序列的保守氨基酸序列區(qū)段而言的序列同一性百分比的測定。 結(jié)果呈現(xiàn)在表1和2中。
[0077]表1:多肽相互之間的序列同一性百分比。
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]表2:保守氨基酸序列區(qū)段A至0的序列同一性百分比。
[0083]
[0084]
[0085]
[0086]
[0087] 實(shí)施例3:通過在細(xì)胞裂解物中的多肽來水解ZEN
[0088] 為了測定其將ZEN降解為非毒性或低毒性的代謝物HZEN和DHZEN的能力，如在實(shí) 施例1中所描述的那樣，在大腸桿菌中制備由具有SEQ ID No. 17的核苷酸序列所編碼的具 有SEQ ID No.l的多肽，所述多肽就這樣地和以具有C-末端或N-末端6XHis標(biāo)簽的方式來 進(jìn)行制備。將有著由具有SEQ ID No. 18-31的核苷酸序列所編碼的具有SEQ ID No.2-15的 氨基酸序列的多肽僅在C-末端標(biāo)記上6 X His。各將100ml的具有2.0-2.5的光密度 (0D600nm)的大腸桿菌培養(yǎng)物通過在4°C下離心來進(jìn)行收獲，并且重懸浮在20ml Brunner礦 質(zhì)培養(yǎng)基(DSMZ微生物培養(yǎng)基編號(hào)462,2012)中。通過用弗氏壓碎器在20,000psi下處理3次 來將細(xì)胞懸浮液裂解。將如此獲得的細(xì)胞裂解物以1: 1〇、1:100或1:1，〇〇〇的稀釋物進(jìn)行使 用，所述稀釋物在包含〇. lmg/ml BSA(牛血清白蛋白）的Brunner礦質(zhì)培養(yǎng)基中制備。對(duì)于 ZEN降解試驗(yàn)，使用9.9ml的包含0. lmg/ml BSA的Brunner礦質(zhì)培養(yǎng)基、0. lml的經(jīng)稀釋的細(xì) 胞裂解物和31μ1的ZEN底物儲(chǔ)液?？傊虼藢⒓?xì)胞裂解物以1:1，000、1:10,000或1:100， 〇〇〇進(jìn)行了稀釋。2.08mM ΖΕΝ溶液(40體積％的ACN+60體積％的出0)用作ΖΕΝ底物儲(chǔ)液。為了 制備該溶液，相應(yīng)地稱量以晶體形式的ZEN(Romer Labs的生物純標(biāo)準(zhǔn)品，商品編號(hào)001109， 純度為至少98%)并裝瓶，并且將其溶解。每個(gè)降解批次在25ml玻璃小瓶中進(jìn)行，并且在25 °C下在以lOOrprn進(jìn)行搖動(dòng)的情況下溫育總共120小時(shí)。在時(shí)間點(diǎn)0、0.5、1、2、5、24、47、72和 120小時(shí)，各取lml的樣品，將多肽在99°C下加熱失活10分鐘并貯存于-20°C。在樣品解凍后， 通過離心分離開不溶性成分。借助于LC/MS/MS來分析ZEN、HZEN和DHZEN。為此，借助于尺寸 為250mmX 3mm和顆粒大小為5μηι的Phenomenex Luna C18(2)柱通過色譜法來將代謝物分 開。具有l(wèi)ml/Ι的甲酸濃度的乙腈-水混合物用作流動(dòng)相。在270nm下記錄UV-信號(hào)。電噴霧離 子化(ESI)用作離子化源。借助于QTrap/LC/MS/MS(三重四極，Applied Biosystems)以"增 強(qiáng)模式"來對(duì)ZEN、HZEN和DHZEN進(jìn)行定量。在最遲24小時(shí)后，在批料中不再檢測到重大量的 ZEN。大部分(超過80 % )的ZEN被轉(zhuǎn)變成HZEN或DHZEN。
[0089] 在圖1中看到，示例性地關(guān)于經(jīng)1:10,000稀釋的細(xì)胞裂解物溶液，對(duì)于未加標(biāo)簽的 (圖1A)以及對(duì)于加有C-末端6 X His標(biāo)簽的（圖1B)和加有N-末端6 X His標(biāo)簽的（圖1C)具有 SEQ ID No. 1的多肽，ZEN的隨時(shí)間的降解和HZEN及DHZEN的隨時(shí)間的增加。從中清楚地顯而 易見的是：1.ZEN的轉(zhuǎn)化立即且完全地進(jìn)行，這是因?yàn)樵谟谠囼?yàn)開始后立即抽取的第一個(gè)樣 品（0小時(shí)）中，就已經(jīng)幾乎不再能夠檢測到ZEN;和2.通過附加 C-末端或N-末端的標(biāo)簽，未出 現(xiàn)值得注意的活性損失。
[0090] 實(shí)施例4:通過在細(xì)胞裂解物中的多肽來水解ZEN衍生物
[0091]為了測定多肽將除了 ZEN外還有ZEN衍生物轉(zhuǎn)化為非毒性或低毒性的代謝物的能 力，如在實(shí)施例3中所描述的那樣，以具有C-末端His標(biāo)簽的方式制備具有SEQ ID No. 1-15 的多肽，并且作為在"降解15"中的細(xì)胞裂解物，考慮各自的具有有著SEQ ID No. 17-31的序 列的合成核苷酸序列。
[0092]降解試驗(yàn)如在實(shí)施例3中所描述的那樣來進(jìn)行，其中每種多肽用選自α-ZEL、β-ZEL、a-ZAL、0-ZAL、Z14G、Z14S和ZAN的每種ZEN衍生物來進(jìn)行測試。以1:10，000的總稀釋度 來使用細(xì)胞裂解物。作為底物儲(chǔ)液，使用等摩爾的（即2.08mM的）ZEN衍生物溶液，以代替 2 · 08mM ZEN溶液（40體積 ％ 的ACN+60體積 ％ 的出0)。a-ZEL、β-ZEL、a-ZAL、β-ZAL和ZAN從 Sigma購進(jìn)并且作為關(guān)于該分析的標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行使用。按照諸如在P.Krenn等人，2007 (Mykotoxin Research，23，4，180-184)和Μ· Sulyok等人，2007(Anal · Bioanal · Chem. 289， 1505-1523)中所描述的方法，以至少90%的純度來制備Z14G和Z14S，并且將其作為關(guān)于該 分析的標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行使用。與實(shí)施例3的另一個(gè)差別是，僅取一個(gè)樣品，即在24小時(shí)后。在降 解試驗(yàn)期間ZEN衍生物濃度的降低借助于LC/MS/MS來進(jìn)行定量。a-ZEL、f3-ZEL、Z14G和Z14S 按照Μ·Sulyok等人（2010,Food Chemistry，119,408-416)的方法來進(jìn)行測量;a-ZAL、P_ZAL 和ZAN按照P.Songsermaskul等人（2011，J.of Animal Physiol .and Animal Nutr. ,97， 155-161)的方法來進(jìn)行測量。令人驚訝地表明，在所有降解試驗(yàn)中，在24小時(shí)的溫育后，僅 僅存在ZEN衍生物的起始量的0%至最大13%。
[0093]實(shí)施例5:多肽以及其變體的比活性以及酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)
[0094]多肽以及其變體的比活性的測定通過光度法來進(jìn)行，其中所有所使用的多肽具有 C-末端6 XHis標(biāo)簽。多肽或其變體的制備、富集和純化如在實(shí)施例1中所描述的那樣來進(jìn) 行。ZEN至HZEN的降解通過在315nm的波長下吸光度的下降來測量。ZEN和HZEN的摩爾消光系 數(shù)[ε ]通過實(shí)驗(yàn)來測定，并且為0.00788951^111014011-1和0.0 OSOSSTLymorVm-1。消光系數(shù)是 強(qiáng)烈地pH依賴性的，并因此必須總是在精確相同的pH值下，優(yōu)選地甚至在相同的基質(zhì)中進(jìn) 行活性測量。在32°C下，在UV-VIS光度計(jì)(Hitachi U-2001)中，在200至2500nm的波長范圍 內(nèi)，在石英比色皿中，在50mM Tris-HCl(pH=8.2)緩沖溶液中進(jìn)行測量。
[0095] 2.08mM ZEN溶液(40體積％的厶0糾60體積％的出0)用作ZEN底物儲(chǔ)液。為了制備該 溶液，相應(yīng)地稱量以晶體形式的ZEN(Romer Labs的生物純標(biāo)準(zhǔn)品，商品編號(hào)001109，純度為 至少98%)并裝瓶，并且將其溶解。用50mM Tris-HCl(pH=8.2)來制備ZEN底物稀釋物(0.79 μΜ、1·57μΜ、2·36μΜ、3·14μΜ、4·71μΜ、6·28μΜ、7·85μΜ、9·42μΜ、10·99μΜ、12·56μ 厘、14.134厘、15.714厘、17.284厘、18.85以厘）。將多肽溶液用5〇111]\11^8-!1(：1緩沖液(口!1 = 8.2)稀釋至大約70ng/ml的終濃度。將ZEN底物稀釋物在水浴中預(yù)熱至32 °C。
[0096]給100μΙ的各個(gè)ZEN底物稀釋物摻入0.2μ1的多肽溶液，并且測量吸光度5分鐘，其 中測量每個(gè)"多肽溶液-ΖΕΝ底物稀釋物"組合至少兩次。
[0097]通過考慮ΖΕΝ和ΗΖΕΝ的消光系數(shù)，經(jīng)由隨時(shí)間進(jìn)程的吸光度的斜率，計(jì)算出關(guān)于每 個(gè)底物濃度的反應(yīng)速率。
[0098]名稱"Km值"或"米-曼常數(shù)"涉及用于描述酶親和力的參數(shù)，其具有單位[μΜ]或 [mM]，并且按照H.Bisswang(2002,Enzyme Kinetics, ISBN 3-527-30343-Χ,第 19頁）借助于 線性Hane s標(biāo)繪圖來計(jì)算，其中為此優(yōu)選地使用程序S i gmaP 1 〇 t 12.0的函數(shù)"酶動(dòng)力學(xué)，單 一底物"。名稱"酶反應(yīng)的催化常數(shù)"或"krat值"涉及用于描述多肽或酶的轉(zhuǎn)化速度的參數(shù)， 其以[sr 1給出，并且優(yōu)選地借助于程序SigmaPlot 12.0的函數(shù)"酶動(dòng)力學(xué)，單一底物"來計(jì) 算。"最大酶速率"或"vmax值"以單位[μΜ/s]或[mM/s]給出，并且類似于Km值，借助于線性 Hanes標(biāo)繪圖來測算，其中為此優(yōu)選地使用程序SigmaPlotl 2.0的函數(shù)"酶動(dòng)力學(xué)，單一底 物"。
[0099] 借助于Vmax和所使用的酶濃度，根據(jù)下述公式來計(jì)算比活性，
[0100]
[0101] 其中一個(gè)單位被定義為在32°C下在50mM Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.2)中每分鐘 水解 1μπι〇1 ZEN。
[0102] 下面，示例性地對(duì)于具有SEQ ID Ν0:1的多肽，列舉出關(guān)于酶參數(shù)KM、vmax、kcat以及 比活性的測定的原始數(shù)據(jù)。表3顯示了在各個(gè)ZEN底物濃度下的反應(yīng)速率，圖2顯示了各自所 屬的米-曼圖，和在表4中給出了相應(yīng)的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。所使用的酶溶液具有68ng/l的濃度。
[0103] 表3:在不同的ZEN濃度下，具有SEQ ID NO: 1的多肽的反應(yīng)速率。
[0104]
[0105] 表4:具有SEQ ID No. 1的多肽的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
[0106]
[0107] 所研究的多肽的比活性為：8·25U/mg，對(duì)于SEQIDNo·l;10·56U/mg，對(duì)于SEQID No.2;8.36U/mg，對(duì)于SEQ ID No.3;8.33U/mg，對(duì)于SEQ ID No.4;8.56U/mg，對(duì)于SEQ ID No.5;9.95U/mg，對(duì)于SEQ ID No.6;3.83U/mg，對(duì)于SEQ ID No.7;2.57U/mg，對(duì)于SEQ ID No.8;4.87U/mg，對(duì)于SEQ ID No.9;5.12U/mg，對(duì)于SEQ ID No.lO;3.88U/mg，對(duì)于SEQ ID No·ll;2·78U/mg，對(duì)于SEQIDNo·12;6·43U/mg，對(duì)于SEQIDNo·13 ;3·33U/mg，對(duì)于SEQID No·14;和7·76U/mg，對(duì)于SEQIDNo·15。
[0108]所研究的多肽變體的比活性在表5和表6中列出。
[0109]表5:具有SEQ ID No. 1的多肽的功能性變體的比活性；突變所位于的保守氨基酸 序列區(qū)段;和功能性變體相對(duì)于具有SEQ ID No.1的親本序列而言的序列同一性。相對(duì)于具 有SEQ ID No. 1的氨基酸序列而言給出了突變的位置。如在實(shí)施例2中所描述的那樣，借助 于BLAST來測算序列同一性。
[0110]
[0116]
[0117]表6:具有SEQ ID No.2的多肽的功能性變體的比活性。突變的位置是相對(duì)于具有 SEQ ID No.2的氨基酸序列而言的。如在實(shí)施例2中所描述的那樣，借助于BLAST來測算序列 同一性。
[0118]
[0119]實(shí)施例6:在被污染的玉米中的ZEN和ZEN衍生物的降解
[0120]為了測定多肽在復(fù)雜基質(zhì)中和在低pH值下降解天然存在的ZEN和ZEN衍生物的能 力，每次給被污染的玉米摻入不同濃度的具有SEQ ID No. 1-6的多肽中的一種，并且追蹤 ZEN和ZEN衍生物的降解。
[0121]碾磨被污染的玉米并且將其在降解試驗(yàn)中使用，其中批料由lg經(jīng)碾磨的被污染的 玉米、8.9ml 100mM乙酸鹽緩沖液(pH = 4.0)和0.1ml多肽溶液組成。如在實(shí)施例5中所描述 的那樣，制備經(jīng)富集和經(jīng)純化的多肽溶液，其中將其稀釋至10mU/ml、100mU/ml或l，000mU/ ml的濃度。因此，在批料中以絕對(duì)方式使用lmU( = lmU/克玉米）、10mU( = 10mU/克玉米)或 100mU( = 100mU/克玉米）。每個(gè)降解批料以25ml來實(shí)施制備，并且在37°C下在以lOOrpm進(jìn)行 搖動(dòng)的情況下進(jìn)行溫育。在酶添加之前和在1小時(shí)的溫育后，分別取出lml的樣品，將多肽 在99°C下加熱失活10分鐘，并且將樣品貯存于-20°C。在樣品解凍后，通過離心分離開不溶 性成分。如在M. Sulyok等人(2007，Anal .Bioanal · Chem.，289，1505-1523)中所描述的那樣， 借助于LC/MS/MS來測量ZEN以及ZEN衍生物的濃度。在該玉米中ZEN和ZEN衍生物的含量為： 238ppb，對(duì)于ZEN; 15ppb，對(duì)于α-ZEL; 23ppb，對(duì)于β-ZEL; 32ppb，對(duì)于Z14G;和8lppb，對(duì)于 Z14S。在表7中呈現(xiàn)了在所述降解試驗(yàn)中ZEN和ZEN衍生物含量下降的百分比。
[0122]表7:不同多肽和多肽量的降解試驗(yàn)的相對(duì)于起始含量而言的以百分比表示的ZEN 和ZEN衍生物的減少。
[0123]
[0124] 實(shí)施例7:用于以水解方式裂解ZEN和/或ZEN衍生物的包含多肽的添加劑
[0125] 為了制備用于以水解方式裂解ZEN的添加劑，借助于微量過濾和超濾(排阻極限： 10kDa)在標(biāo)準(zhǔn)條件下純化經(jīng)由巴斯德畢赤酵母表達(dá)的具有SEQ ID No. 1、2、6和13的多肽的 發(fā)酵上清液，并且將其濃縮至大約9重量％的干物質(zhì)濃度。隨后，用噴霧干燥器（Bilchi的 Mini B290)同樣在標(biāo)準(zhǔn)條件下將該含多肽的溶液進(jìn)一步加工成干粉末。將這四種粉末相繼 地命名為Z1、Z2、Z6和Z13。此外，將Z1、Z2、Z6或Z13與平均粒度為大約Ιμπι的膨潤土，以1重 量％的添加劑21、22、26或213和99重量％的膨潤土的比例，在向上式搖動(dòng)器中進(jìn)行混合。將 如此獲得的添加劑命名為添加劑21上、22.8、26上和213.8。此外，將21、22、26和213與膨潤 土和維生素-微量元素濃縮物，以0.1重量％的21、Ζ2、Ζ6或Ζ13，0.9重量％的維生素-微量元 素濃縮物，和99重量％的膨潤土的比例，在向上式搖動(dòng)器中進(jìn)行混合。將如此獲得的添加劑 命名為添加劑 21.8￥5、22.8￥5、26上￥5和213.8￥5。10(^的添加劑21.8￥5、22.8￥5、26.8￥5和 Ζ13 · BVS包含200mg硫酸鐵、50mg硫酸銅、130mg氧化鋅、130mg氧化猛、2 · 55mg碳酸|丐、160mg 維生素 E、6 · 5mg維生素 K3、6 · 5mg維生素 Bl、14mg維生素 B2、15mg維生素 B6、0 · 15mg維生素 B12、150mg煙酸、30mg泛酸和5 · 3mg葉酸。
[0126] 將所述添加劑在50mM Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)中抽提30分鐘，并且在同一緩沖 液中如此地進(jìn)一步稀釋，從而使得多肽的終濃度位于大約70ng/ml。
[0127] 隨后，如在實(shí)施例5中所描述的那樣，測定這些溶液的降解玉米赤霉烯酮的效應(yīng)。 相應(yīng)的活性為:8 · 230U/g，對(duì)于Z1; 9 · 310U/g，對(duì)于Z2; 9 · 214U/g，對(duì)于Z6; 83U/g，對(duì)于Z1 · B; 92U/g，對(duì)于Z2 · B; 90U/g，對(duì)于Z2 · C; 57U/g，對(duì)于Z13 · B; 8U/g，對(duì)于Z1 · BVS; 9U/g，對(duì)于 Z2 · BVS; 9U/g，對(duì)于Z6 · BVS;和6U/g，對(duì)于Z13 · BVS。
[0128] 如在實(shí)施例4中所描述的那樣來施行添加劑Z1、Z2、Z6、Z13、Z1.B、Z2.B、Z6.B、 Z13 · B、Z1 · BVS、Z2 · BVS、Z6 · BVS和Z13 · BVS 降解 ZEN 衍生物α-ZEL、β-ZEL、α-ZAL、β-ZAL、Z14G、 Z14S和ZAN的能力，但是使用100μΙ的具有大約70ng/ml的多肽濃度的多肽溶液來代替100μΙ 的細(xì)胞裂解物。在6小時(shí)的溫育后，起始量的僅僅最大15 %作為未水解的ZEN衍生物存在。
[0129] 實(shí)施例8:最佳溫度
[0130] 為了測定具有SEQ ID N〇.l、2、5、6、7、9、ll、12和15的多肽的最佳溫度，如在實(shí)施 例1中所描述的那樣，將它們以具有c-末端6 XHis標(biāo)簽的方式進(jìn)行克隆，在大腸桿菌中表 達(dá)，并純化。在初步試驗(yàn)中，對(duì)于每種多肽，測算出那個(gè)濃度，在所述濃度下在試驗(yàn)條件 (Teorell Stenhagen 緩沖液（Teorell 和 Stenhagen，Ein Universal puffer fiir den pH-Bereich 2.0bis 12.0.Biochem Ztschrft, 1938,299:第416-419頁），pH 7.5,具有O.lmg/ ml BSA，在30°C下）下在3小時(shí)的試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間后可以確保ZEN的完全轉(zhuǎn)化。以所測算出的濃 度在用于測定最佳溫度的降解批料中使用所述制備物。該試驗(yàn)在PCR循環(huán)儀(Eppendorf) 中，通過使用溫度梯度函數(shù)，在20°C+/-10°C下，在40°C+/-10°C下，和如果需要，在60°C+/_ 10°C下(在各自范圍內(nèi)10個(gè)溫度;預(yù)先確定的PCR循環(huán)儀的溫度)來進(jìn)行。對(duì)于批料，在各自 最佳pH下給Teorell-Stenhagen緩沖液摻入相應(yīng)的酶濃度以及0. lmg/ml BSA和5ppm ZEN。 具有0. lmg/ml BSA和5ppm ZEN而沒有酶添加的批料用作陰性對(duì)照。在0小時(shí)、0.5小時(shí)、1小 時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)的溫育時(shí)間后，對(duì)于每個(gè)溫育溫度各自抽取一個(gè)樣品，在99°C下加熱失活 10分鐘，并且貯存于_20°C。在解凍后，將樣品轉(zhuǎn)移到HPLC小瓶中。借助于HPLC-DAD來分析 ZEN、HZEN和DHZEN。為此，借助于尺寸為4.6mmX150mm和顆粒大小為5μm的ZorbaxSB-Aq C18柱通過色譜法來將代謝物分開。具有5mM乙酸銨的甲醇-水混合物用作流動(dòng)相。在274nm 下記錄UV-信號(hào)。代謝物的定量通過包括所攜帶的標(biāo)準(zhǔn)品系列來進(jìn)行。最佳溫度的測算通過 測算出的降解曲線的斜率來進(jìn)行，其中將斜率為最大時(shí)所處的溫度定義為最佳溫度。最佳 溫度顯示在表8中。
[0131] 表8:多肽的最佳溫度。
[0132]
[0133] 實(shí)施例9:溫度穩(wěn)定性
[0134] 為了測定具有SEQ ID No.l、2、5、6、7、9、ll、12和15的多肽的溫度穩(wěn)定性，如在實(shí) 施例1中所描述的那樣，將它們以具有c-末端6XHis標(biāo)簽的方式進(jìn)行克隆，在大腸桿菌中表 達(dá)，并純化。將它們?cè)诰哂刑荻群瘮?shù)的PCR循環(huán)儀中在各自的最佳溫度+/-HTC下進(jìn)行溫育。 在0分鐘、15分鐘、30分鐘和60分鐘后，對(duì)于每個(gè)批料和每個(gè)溫度抽取一個(gè)樣品。隨后，在降 解試驗(yàn)中，在具有〇· lmg/ml BSA和5ppm ZEN的處于各自最佳pH下的Teorell-Stenhagen緩 沖液中，在批料中使用這些經(jīng)預(yù)溫育的樣品。在初步試驗(yàn)中，對(duì)于每種多肽，測算出那個(gè)濃 度，在所述濃度下在試驗(yàn)條件(Teorell Stenhagen緩沖液，pH 7.5,具有O.lmg/ml BSA，在 30°C下）下在3小時(shí)的試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間后可以確保ZEN的完全轉(zhuǎn)化。在批料中使用各自所測算 出的酶濃度。在30 °C下溫育所述降解批料。在0小時(shí)、0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)的溫育 時(shí)間后進(jìn)行取樣。隨后，將多肽在99 °C下加熱失活10分鐘，并且將樣品貯存于_20°C。在解凍 后，將樣品轉(zhuǎn)移到HPLC小瓶中，并且如在實(shí)施例8中所描述的那樣借助于HPLC-DAD來進(jìn)行分 析。
[0135] 將溫度穩(wěn)定性定義為這樣的溫度，在所述溫度下多肽在15分鐘的預(yù)溫育后具有 50%的殘余活性，相比于最佳溫度而言。作為對(duì)于活性的量度，考慮降解曲線的斜率。溫度 穩(wěn)定性顯不在表9中。
[0136] 表9:多肽的溫度穩(wěn)定性(在15分鐘的預(yù)溫育后50%的殘余活性）。
[0137]
[0138] 實(shí)施例10:最佳pH
[0139] 為了測定具有SEQ ID如.1、2、5、6、7、9、11、12和15的多肽的最佳?!1，如在實(shí)施例1 中所描述的那樣，將它們以具有C-末端6XHis標(biāo)簽的方式進(jìn)行克隆，在大腸桿菌中表達(dá)，并 純化。在初步試驗(yàn)中，對(duì)于每種多肽，測算出那個(gè)濃度，在所述濃度下在試驗(yàn)條件(Teorel 1 Stenhagen緩沖液，pH 7.5，具有0. lmg/ml BSA，在30°C下）下在3小時(shí)的試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間后可 以確保ZEN的完全轉(zhuǎn)化。在批料中使用各自的酶濃度。所述降解批料在處于3.0、4.0、5.0、 5·5、6·0、6·5、7·0、7·5、8·0、8·5、9·0、9·5、10·0、11·0和12.0 的pH 值下的Stenhagen 緩沖液 中實(shí)施制備。為了進(jìn)行降解，將具有〇. lmg/ml BSA和5ppm ZEN的降解批料在30°C下進(jìn)行溫 育。在具有O.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的處于pH 3·0、ρΗ 7.0和pH 12.0下的Teorell-Stenhagen緩沖液中的批料用作陰性對(duì)照。在0小時(shí)、0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)的溫育 時(shí)間后進(jìn)行取樣。隨后，將多肽在99 °C下加熱失活10分鐘，并且將樣品貯存于_20°C。在解凍 后，將樣品轉(zhuǎn)移到HPLC小瓶中，并且如在實(shí)施例8中所描述的那樣借助于HPLC-DAD來進(jìn)行分 析。最佳pH的測算通過測算出的降解曲線的斜率來進(jìn)行，其中將在斜率為最大時(shí)所處的pH 值定義為最佳pH。最佳pH顯示在表10中。
[0140] 表10:多肽的最佳pH。
[0141]
[0142] 實(shí)施例11:在pH 5.0下的pH穩(wěn)定性
[0143]為了測定pH穩(wěn)定性，將來自實(shí)施例10的多肽在處于pH 5.0和各自最佳pH下的 Teroell-Stenhagen緩沖液中在25°C下溫育1小時(shí)。在降解試驗(yàn)中，以與對(duì)于測定最佳pH所 使用的濃度相同的各自多肽的濃度，在具有〇.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的處于各自最佳pH下 的lOOmM Tris-HCl緩沖液中，在批料中使用這些經(jīng)預(yù)溫育的樣品。在0小時(shí)、0.5小時(shí)、1小 時(shí)、2小時(shí)和3小時(shí)的溫育時(shí)間后進(jìn)行取樣。隨后，將多肽在99°C下加熱失活10分鐘，并且將 樣品貯存于-20°C。在解凍后，將樣品轉(zhuǎn)移到HPLC小瓶中，并且如在實(shí)施例8中所描述的那樣 借助于HPLC-DAD來進(jìn)行分析。將pH穩(wěn)定性定義為在pH 5.0下多肽的殘余活性百分比，相對(duì) 于在各自最佳pH下的活性而言。對(duì)于pH 5.0的pH穩(wěn)定性顯示在表11中。
[0144] 表11:在pH 5.0下多肽的pH穩(wěn)定性。
[0145]
[0146] 實(shí)施例12: ZEN降解試驗(yàn)
[0147] 示例性地對(duì)于具有SEQ ID No·l、2、5、6、7、9、ll、12和15的多肽，進(jìn)行ZEN至HZEN和 DHZEN的降解。所述降解批料在具有O.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的Teorell Stenhagen緩沖液 (pH 7.5)中實(shí)施制備。在30°C下溫育所述降解批料。在0小時(shí)、0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)和3小 時(shí)的溫育時(shí)間后進(jìn)行取樣。隨后，將多肽在99°C下加熱失活10分鐘，并且將樣品貯存于-20 °C。在解凍后，將樣品轉(zhuǎn)移到HPLC小瓶中，并且如在實(shí)施例8中所描述的那樣借助于HPLC-DAD來進(jìn)行分析。如此地來選擇多肽濃度，從而在大約3小時(shí)后達(dá)到完全的降解。降解動(dòng)力學(xué) 描繪在圖3中，其中y軸顯示了以微摩爾/升(μπιο 1 /1)表示的ZEN、HZEN和DHZEN的濃度，和X軸 顯示了以小時(shí)(h)表示的溫育時(shí)間。
[0148] *μ Μ表示微體積摩爾濃度，并且相應(yīng)于單位μπι。1/1。
[0149] 本發(fā)明的一些實(shí)施方案如下：
[0150] 1.以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其 特征在于，所述多肽是具有選自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性變體的水解酶， 其中在所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40%。
[0151] 2.根據(jù)實(shí)施方案1的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一個(gè)保守氨基酸序列區(qū) 段或其功能性變體，其中所述氨基酸序列區(qū)段的功能性變體具有至少70%，優(yōu)選地至少 84%，更優(yōu)選地至少92%，和最優(yōu)選地至少98%的序列同一性，并且所述至少一個(gè)保守氨基 酸序列區(qū)段選自具有SEQ ID No.l的序列的氨基酸序列+24至+50、+52至+77、+79至+87、+89 至+145、+150 至+171、+177至+193、+223至+228、+230至+237、+239至+247、+249至+255、+257 至+261、+263至+270、+272至+279、+297至+301、+303至+313、+24至328、+1至+328。
[0152] 3.根據(jù)實(shí)施方案1或2的多肽，其特征在于，所述功能性變體具有選自下列的氨基 酸修飾:各自一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失和插入。
[0153] 4.根據(jù)實(shí)施方案1、2或3之一的多肽，其特征在于，所述多肽具有至少0.01U/mg，優(yōu) 選地至少0.1U/mg，特別地至少lU/mg的比活性，和/或具有最高50μΜ，優(yōu)選地最高3.5μΜ， 特別地最高〇. 5μΜ的以水解方式裂解玉米赤霉烯酮的ΚΜ值，和/或具有至少0. Οδ?Γ1，優(yōu)選地 至少Ο.θ?Γ1，特別地至少5(1的以水解方式裂解玉米赤霉烯酮的1^值，和/或具有至少 Ο.ΟΟΟΟΙμΜ^ΕΓ1，優(yōu)選地至少〇.〇〇〇1μΜ?，特別地至少Ο.ΟΟΙμΜ^ΕΓ1的以水解方式裂解 玉米赤霉稀酮的v max值。
[0154] 5.根據(jù)實(shí)施方案1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自SEQ ID No. 2、 5、6、7、9、11和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨基 酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在pH 5.0下的pH穩(wěn)定性為至少15%，優(yōu) 選地50 %，和特別優(yōu)選地至少90 %。
[0155] 6.根據(jù)實(shí)施方案1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自SEQ ID No. 1、 2、5、6、7、9、11、15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨 基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在30°C和75°C之間，優(yōu)選地38°C和55 °C之間，特別優(yōu)選地38°C和52°C之間的溫度范圍內(nèi)具有最高的酶促活性。
[0156] 7.根據(jù)實(shí)施方案1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自SEQ ID No. 1、 5、6、9、11、12和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨 基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽是溫度穩(wěn)定的，直至90°C，優(yōu)選地75 °C，和特別優(yōu)選地60 °C的溫度。
[0157] 8.根據(jù)實(shí)施方案1至7之一的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一個(gè)選自下列的 位置處具有關(guān)于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一個(gè)突變:22、23、25、26、27、29、31、32、 35、37、42、43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、 132、141、146、148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、 196、197、198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、 229、231、233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、 277、280、281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、 319、321、323、325和326。
[0158] 9.根據(jù)實(shí)施方案8的多肽，其特征在于，所述多肽具有選自下列的關(guān)于SEQ ID 吣.1的氨基酸序列的至少一個(gè)突變:〇22厶、5230、5231^、呢^)、126￥、？27￥小27!1、529?、1?31八、 F32Y、R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、S69G、 P72E、V73A、A78S、N80H、F84Y、 I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、L132V、 A141S、I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、L170R、 A172G、A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、V197C、 V197R、E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、Q209R、 L210A、L210S、AP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、K222Q、 G229A、A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、S248T、 S248N、S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、E269H、 E269N、L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、I285L、 I286M、R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、D309A、 A311P、A314V、L317F、S319Q、S319P、S319R、S321A、S321T、T323A、P325A、A326P。
[0159] 10.根據(jù)實(shí)施方案1至8之一的多肽，其特征在于，包含至少一個(gè)選自SEQ ID No. 32-69的下列氨基酸基序。
[0160] 11.根據(jù)實(shí)施方案9的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一個(gè)位置處包含至少一 個(gè)保守氨基酸置換，并且所述保守氨基酸置換選自：G至A;或A至G、S;或V至I、L、A、T、S;Sl 至V、L、M;或L至I、M、V;或Μ至L、I、V;或P至A、S、N;或 F至Y、W、H;或Y 至 F、W、H;或W至Y、F、H;或R 至K、E、D;或K至R、E、D;或Η至Q、N、S;或D或N、E、K、R、Q;或E至Q、D、K、R、N;或 S至T、A;或T至S、 V、A;或C至S、T、A;或 N 至D、Q、H、S;或Q至E、N、H、K、R的置換。
[0161] 12.分離的多核苷酸，其具有編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有水解玉米 赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的特性，其特征在于，所述核苷酸序列編碼至 少一種根據(jù)實(shí)施方案1至11之一的多肽；和/或所述核苷酸序列與至少一種選自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列具有序列同一性程度，其中所選擇的核苷酸序列為至少40%;和/ 或所述核苷酸序列在中等嚴(yán)緊條件下與至少一種選自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列雜 交，和/或與具有至少200個(gè)核苷酸，特別是至少100個(gè)核苷酸的其部分序列雜交，和/或與上 述核苷酸序列或其部分序列的互補(bǔ)鏈雜交。
[0162] 13.以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的添加劑， 其特征在于，所述添加劑包含至少一種具有選自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性 變體的多肽，其中在所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少 40% ;并且任選地包含助劑。
[0163] 14.根據(jù)實(shí)施方案13的添加劑，其特征在于，包含至少一種根據(jù)實(shí)施方案1至11之 一的多肽。
[0164] 15.根據(jù)實(shí)施方案13或14之一的添加劑，其特征在于，所述助劑選自：至少一種惰 性載體，以及任選地，其他成分，例如維生素和/或礦物質(zhì)和/或酶和/或其他用于使真菌毒 素解毒的組分。
[0165] 16.根據(jù)實(shí)施方案13、14或15之一的添加劑，其特征在于，在所述添加劑中，以最高 10，000U/g，優(yōu)選地最高1，000U/g，更優(yōu)選地最高100U/g，和最優(yōu)選地最高10U/g的濃度包含 至少一種根據(jù)實(shí)施方案1至11之一的多肽。
[0166] 17.根據(jù)實(shí)施方案13至16之一的添加劑，其特征在于，所述添加劑以經(jīng)包囊或經(jīng)包 衣的形式存在。
[0167] 18.根據(jù)實(shí)施方案13至17之一的添加劑用于以水解方式裂解在飼料中、在食物中 或在中的玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的用途，所述飼料特別地為用 于豬、家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料。
[0168] 19.用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的方 法，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物被具有選自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性變體的多肽水解，其中在所述功能性變體與至少一個(gè)所 述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40%。
[0169] 20.根據(jù)實(shí)施方案19的方法，其特征在于，在根據(jù)實(shí)施方案14至17之一的添加劑中 使用所述多肽。
[0170] 21.根據(jù)實(shí)施方案20的方法，其特征在于，將所述多肽或添加劑與被玉米赤霉烯酮 和/或被至少一種玉米赤霉烯酮衍生物污染的飼料或食物相摻混，使所述被污染的飼料或 食物與濕氣相接觸，并且所述多肽或添加劑水解在所述被污染的飼料或食物中所包含的玉 米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物。
[0171] 22.根據(jù)實(shí)施方案19至21之一的方法，其特征在于，至少70 %，優(yōu)選地至少80%，特 別優(yōu)選地至少90%的所述玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物被水解。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其特征 在于，所述多肽是具有SEQ ID No. 1的氨基酸序列或其功能性變體的水解酶，其中在所述功 能性變體與所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少70%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一個(gè)保守氨基酸序列區(qū)段或 其功能性變體，其中所述氨基酸序列區(qū)段的功能性變體具有至少70%，優(yōu)選地至少84%，更 優(yōu)選地至少92%，和最優(yōu)選地至少98%的序列同一性，并且所述至少一個(gè)保守氨基酸序列 區(qū)段選自具有SEQ ID No.l的序列的氨基酸序列+24至+50、+52至+77、+79至+87、+89至+ 145、 +150 至+171、+177至+193、+223至+228、+230至+237、+239至+247、+249至+255、+257至+ 261、+263 至+270、+272 至+279、+297 至+301、+303 至+313、+24 至 328、+1 至+328。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一個(gè)選自下列的位置處具 有關(guān)于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一個(gè)突變:22、23、25、26、27、29、31、32、35、37、42、 43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、132、141、 146、 148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、196、197、 198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、229、231、 233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、277、280、 281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、319、321、 323、325和326。4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3之一的多肽，其特征在于，所述多肽具有選自下列的關(guān)于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一個(gè)突變：D22A、S23Q、S23L、N25D、I26V、F27Y、F27H、S29P、 R31A、F32Y、R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、 S69G、P72E、V73A、A78S、N80H、F84Y、I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、 L132V、A141S、I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、 L170R、A172G、A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、 V197C、V197R、E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、 Q209R、L210A、L210S、AP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、 K222Q、G229A、A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、 S248T、S248N、S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、 E269H、E269N、L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、 I285L、I286M、R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、 D309A、A311P、A314V、L317F、S319Q、S319P、S319R、S321A、S321T、T323A、P325A、A326P。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的多肽，其特征在于，包含至少一個(gè)選自SEQ ID No.32-69的 下列氨基酸基序。6. 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物從而產(chǎn)生用于 豬、家禽或水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料的添加劑，所述添加劑用于添加至食品或干酒糟，其特征在于， 所述添加劑包含至少一種具有SEQ ID No.l的氨基酸序列或其功能性變體的多肽，其中在 所述功能性變體與所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少70% ;并且任選地包含助劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6的添加劑，其特征在于，包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至5之一的多 肽。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7之一的添加劑，其特征在于，所述助劑選自：至少一種惰性載體， 以及任選地，其他成分，例如維生素和/或礦物質(zhì)和/或酶和/或其他用于使真菌毒素解毒的 組分。9. 根據(jù)權(quán)利要求6、7或8之一的添加劑，其特征在于，在所述添加劑中，以最高10，000U/ g，優(yōu)選地最高1，〇〇〇U/g，更優(yōu)選地最高100U/g，和最優(yōu)選地最高10U/g的濃度包含至少一種 根據(jù)權(quán)利要求1至5之一的多肽。10. 根據(jù)權(quán)利要求6至9之一的添加劑，其特征在于，所述添加劑以經(jīng)包囊或經(jīng)包衣的形 式存在。11. 至少一種具有SEQ ID No. 1的氨基酸序列或其功能性變體的多肽用于以水解方式 裂解在飼料中、在食物中或在干酒糟中的玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生 物的用途，所述飼料特別地為用于豬、家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料，其中所述功能性變體與所述 氨基酸序列之間的序列同一性為至少70%。12. 用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的方法，其 特征在于，所述玉米赤霉稀酮和/或至少一種玉米赤霉稀酮衍生物被具有SEQ ID No. 1的氨 基酸序列或其功能性變體的多肽水解，其中在所述功能性變體與所述氨基酸序列之間的序 列同一性為至少70 %。13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于，在根據(jù)權(quán)利要求6至10之一的添加劑中使用 所述多肽。14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于，將所述多肽或添加劑與被玉米赤霉烯酮和/ 或被至少一種玉米赤霉烯酮衍生物污染的飼料或食物相摻混，使所述被污染的飼料或食物 與濕氣相接觸，并且所述多肽或添加劑水解在所述被污染的飼料或食物中所包含的玉米赤 霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物。15. 根據(jù)權(quán)利要求12至14之一的方法，其特征在于，至少70%，優(yōu)選地至少80%，特別優(yōu) 選地至少90 %的所述玉米赤霉稀酮和/或至少一種玉米赤霉稀酮衍生物被水解。
【文檔編號(hào)】C12N15/55GK106085983SQ201610373145
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2014年8月27日
【發(fā)明人】S·弗魯豪夫, M·薩姆海塞爾, M·費(fèi)菲爾, D·摩爾, G·沙特茲邁爾, E·M·賓德
【申請(qǐng)人】愛爾伯股份公司