核酸傳感器、其制備方法和基于該傳感器的多元檢測(cè)方法
【專利摘要】核酸傳感器、其制備方法和基于該傳感器的多元檢測(cè)方法。本發(fā)明公開(kāi)了一種基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器，將磁性納米粒子Fe3O4@SiO2@AuNPs的DNA探針，與目標(biāo)核酸分子和基于量子點(diǎn)的DNA探針，構(gòu)建夾心型熒光檢測(cè)體系，利用外加磁場(chǎng)將磁性納米粒子從檢測(cè)體系中分離，測(cè)上清液中各量子點(diǎn)的熒光殘留?？筛鶕?jù)加入的目標(biāo)核酸分子的濃度與檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度的改變量繪制濃度-響應(yīng)曲線，實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)核酸分子的同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)下限達(dá)皮摩爾級(jí)（pM）。利用量子點(diǎn)寬激發(fā)窄發(fā)射的特性，可實(shí)現(xiàn)單一激發(fā)波長(zhǎng)下多種量子點(diǎn)的同時(shí)發(fā)光，即可將多種目標(biāo)核酸分子的濃度-響應(yīng)曲線展示在同一光譜圖中。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高，可靠性好，在腫瘤早期診斷中有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】核酸傳感器、其制備方法和基于該傳感器的多元檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于功能納米材料和生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種核酸傳感器及其制備方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]功能化的磁性納米粒子具有良好的的納米尺寸效應(yīng)和生物相容性，依據(jù)其磁響應(yīng)性可對(duì)材料進(jìn)行分離和導(dǎo)向，可應(yīng)用與生物分子的分離和檢測(cè)、磁靶向給藥、免疫分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。金納米粒子與巰基DNA可形成強(qiáng)烈的金-硫鍵，金-硫鍵的鍵能大，反應(yīng)條件溫和，后處理簡(jiǎn)單，可用于DNA在納米粒子表面的固定。因此將磁性納米粒子和金納米顆粒復(fù)合，既保持了磁性納米粒子磁分離的特性，又具有金納米顆粒表面積大、易修飾的特性。
[0004]量子點(diǎn)是一種新型的半導(dǎo)體納米顆粒，是納米生物光子學(xué)重要的工具之一。量子點(diǎn)作為一種極具應(yīng)用前景的信號(hào)探針，與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比，具有寬而有效的激發(fā)譜，窄而對(duì)稱的發(fā)射譜，高的熒光量子效率，優(yōu)異的光化學(xué)穩(wěn)定性，方便靈活的表面可修飾性，以及發(fā)射波長(zhǎng)尺寸可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)?；谶@些獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，結(jié)合先進(jìn)的分析檢測(cè)技術(shù)和平臺(tái)，量子點(diǎn)在生物分析中的應(yīng)用日益廣泛，包括細(xì)胞與組織標(biāo)記、生物分子跟蹤與檢測(cè)、免疫反應(yīng)分析等方面，并取得了許多重要成果。但是，縱觀量子點(diǎn)在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用，大部分的機(jī)理都是基于生物分子之間的特異性相互作用。因此，構(gòu)建量子點(diǎn)-生物分子復(fù)合探針，使量子點(diǎn)具有特異性靶向作用的同時(shí)，保持其熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性，并且盡量減少其他生物分子的非特異性吸附，這對(duì)于量子點(diǎn)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用，起著尤為關(guān)鍵的作用。
[0005]國(guó)內(nèi)外大量研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程往往與多種核酸標(biāo)志物的表達(dá)異常有關(guān)，例如肺腺癌與miR-21、miR-486、miR-375和miR-200的表達(dá)異常相關(guān)。依靠檢測(cè)某種特定的核酸標(biāo)志物的表達(dá)水平作為診斷癌癥發(fā)生的依據(jù)是不全面的，而且由于假陽(yáng)性或假陰性信號(hào)的存在很容易導(dǎo)致誤檢，聯(lián)合檢測(cè)能顯著降低誤診的幾率，提高診斷準(zhǔn)確度。而且相對(duì)于單一組分檢測(cè)，多組分同時(shí)檢測(cè)具有樣品需求量少，分析時(shí)間短，重復(fù)步驟少，費(fèi)用相對(duì)低等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)受到越來(lái)越多科學(xué)家的關(guān)注。因此我們?cè)O(shè)計(jì)了一種基于功能化磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs和量子點(diǎn)構(gòu)建核酸傳感器的方法同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)核酸分子，提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明提供一種靈敏、可靠、簡(jiǎn)捷、經(jīng)濟(jì)的基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器，同時(shí)提供了一種該核酸傳感器的制備方法和基于該核酸傳感器的多兀檢測(cè)方法。
技術(shù)方案:本發(fā)明的基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器為夾心型結(jié)構(gòu)，由基于量子點(diǎn)的DNA探針、目標(biāo)核酸分子和基于磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs的DNA探針通過(guò)堿基互補(bǔ)雜交得到，量子點(diǎn)為水分散性量子點(diǎn)。
[0008]本發(fā)明基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器的優(yōu)選方案中，基于量子點(diǎn)的DNA探針和目標(biāo)核酸分子均為多個(gè)，且數(shù)量相等，每個(gè)量子點(diǎn)的DNA探針均對(duì)應(yīng)一個(gè)目標(biāo)核酸分子，構(gòu)成一組互補(bǔ)雜交雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0009]本發(fā)明基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器的優(yōu)選方案中，目標(biāo)核酸分子為DNA或RNA，多個(gè)目標(biāo)核酸分子的序列均不相同。
[0010]本發(fā)明基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器的優(yōu)選方案中，基于量子點(diǎn)的DNA 探針的量子點(diǎn)為 ZnO、Zn S、ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, PbSe、InP、InCaAs、ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/Hg、CdS/PbS、CdS/Cd (OH) 2、CdCe/ZnS、CdCe/ZnSe、CdCe/CdS、CdTe/CdS、ZnS/CdS/ZnS、CdCe/ HgSe/ CdCe、ZnS: Cu、ZnS: Mn、CdS: Cu、CdS: Mn 中的任一種。
[0011]本發(fā)明基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器的優(yōu)選方案中，多個(gè)基于量子點(diǎn)的DNA探針的量子點(diǎn)發(fā)射波長(zhǎng)不同,相鄰量子點(diǎn)的波長(zhǎng)間距50-80 nm。
[0012]本發(fā)明基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器的優(yōu)選方案中，基于量子點(diǎn)的DNA探針是按照以下方法制備得到:通過(guò)在室溫下，水相中進(jìn)行配體交換，在熒光量子點(diǎn)表面修飾巰基DNA。
[0013]本發(fā)明基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器的優(yōu)選方案中，基于磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs的DNA探針包括由內(nèi)至外的磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs核層、中間層和殼層，磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs核層包含I個(gè)或多個(gè)Fe3O4粒子，粒徑為30-50nm ;中間層為SiO2，厚度為10-20 nm ;殼層為粒徑為5-20 nm的金納米顆粒構(gòu)成。
[0014]本發(fā)明基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器的優(yōu)選方案中，基于磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs的DNA探針中，多個(gè)巰基DNA通過(guò)金-硫鍵固定于金納米顆粒的表面，金納米顆粒表面的非特異性活性位點(diǎn)用巰基己醇封閉。
[0015]本發(fā)明的制備上述基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器的方法，包括如下具體步驟:
(1)基于量子點(diǎn)的DNA探針的制備:將量子點(diǎn)與巰基DNA混合后，加入TriS-HCl緩沖液，混合均勻后，放置恒溫振蕩器上輕微震蕩，避光反應(yīng)24-36小時(shí)，使巰基DNA分子與量子點(diǎn)表面的巰基丙酸發(fā)生配體交換，然后超濾離心，除去未連接到量子點(diǎn)上的DNA分子，超濾所得的截留液用磷酸鹽緩沖液稀釋，即為基于量子點(diǎn)的DNA探針；
(2)基于磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs的DNA探針的制備:將磁性納米粒子Fe3O4OSiO2OAuNPs溶液磁分離，除去上清液，復(fù)溶于超純水中，加入與目標(biāo)核酸互補(bǔ)配對(duì)的巰基DNA,室溫下反應(yīng)8-10小時(shí)；然后每隔1-2小時(shí)加入NaCl溶液,老化后進(jìn)行磁分離,然后用磷酸鹽緩沖液清洗，除去未反應(yīng)的巰基DNA ;離心所得沉淀物用磷酸鹽緩沖液溶解后加入巰基己醇，封閉金納米顆粒表面的非特異性活性位點(diǎn)，最后對(duì)溶液依次進(jìn)行磁分離，用磷酸鹽緩沖液清洗后，沉淀物用磷酸鹽溶解，即為基于磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs的DNA探針；
(3)目標(biāo)核酸分子的檢測(cè):分別移取步驟(1)所得量子點(diǎn)DNA探針和步驟(2)所得基于磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs的DNA探針，加入到磷酸鹽緩沖液中，然后將所得混合溶液加入目標(biāo)核酸分子溶液，混合均勻，錫紙避光，置于恒溫振蕩器上輕微震蕩，雜交反應(yīng)，磁分離后即得到基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器。
[0016]本發(fā)明的基于上述基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器進(jìn)行多元檢測(cè)的方法，包括如下步驟:
分別取基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器加入多組磷酸鹽緩沖液，對(duì)每一種目標(biāo)核酸分子，將濃度值為10 PM，100 PM，I nM，10 nM的四組分別對(duì)應(yīng)加入一組磷酸鹽緩沖液中，然后于37°C條件下在恒溫振蕩器上避光輕微振蕩反應(yīng)后磁分離，取上層清液檢測(cè)剩余量子點(diǎn)-DNA的熒光強(qiáng)度，對(duì)目標(biāo)核酸分子濃度和相應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度分別作出核酸傳感器的工作曲線，并計(jì)算傳感器對(duì)這種目標(biāo)核酸分子的線性范圍和檢測(cè)下限。
[0017]有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明制備方法利用磁性納米粒子Fe304@Si02@AuNPs通過(guò)金-硫鍵構(gòu)建磁性納米粒子功能化的DNA探針，相比于共價(jià)偶聯(lián)、生物素-鏈霉親和素連接等納米粒子標(biāo)記生物分子的方式，金-硫鍵性形成具有反應(yīng)條件溫和，DNA分子在粒子表面標(biāo)記的穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)；采用的磁性納米粒子在生物分離提純方面優(yōu)勢(shì)明顯，相比于高速離心等分離方式，磁性納米粒子只需一個(gè)外加磁場(chǎng)即可實(shí)現(xiàn)生物分子的快速分離，分離時(shí)間只需幾十秒，而且設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單；目前，國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)多為利用有機(jī)熒光染料作為熒光信號(hào)來(lái)源，由于其激發(fā)譜范圍窄，故不能現(xiàn)實(shí)同一激發(fā)波長(zhǎng)下多種熒光染料同時(shí)發(fā)光，即不能在同一激發(fā)波長(zhǎng)下實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)分子同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明利用量子點(diǎn)寬激發(fā)窄發(fā)射的特性，可實(shí)現(xiàn)單一激發(fā)波長(zhǎng)下多種量子點(diǎn) 的同時(shí)發(fā)光，即可將多種目標(biāo)核酸分子的濃度-響應(yīng)曲線展示在同一光譜圖中。
[0018]
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為功能化磁性納米材料Fe3O4OSiO2IgAuNPs的透射電子顯微鏡圖。
[0020]圖2為三種量子點(diǎn)的紫外和熒光譜圖。
[0021]圖3為三種量子點(diǎn)混合時(shí)測(cè)得熒光譜圖。
[0022]
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不限于所舉的實(shí)施例。
[0024]本發(fā)明采用的量子點(diǎn)既包括單核量子點(diǎn)(例如CdTe、CdS、CdSe等)，也包括核殼型量子點(diǎn)(例如CdCe/ZnS、CdCe/ZnSe、ZnS/CdS/ZnS等)，還包括摻雜型量子點(diǎn)(例如ZnS: Cu、ZnS:Mn、CdS: Cu 等)。
[0025]參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0026]實(shí)施例1:
(O量子點(diǎn)-DNA探針的制備
采用實(shí)驗(yàn)組的程序控制微波輔助水相直接合成水分散性單核量子點(diǎn)(例如CdTe、CdS、CdSe等),將I nmol量子點(diǎn)與10 nmol巰基DNA混合；加入一定體積的100 mM的Tris-HCl緩沖液，使最終的反應(yīng)緩沖液為10 mM的Tris-HCl溶液；反應(yīng)溶液混勻后，置于恒溫振蕩器上輕微震蕩，25°C下避光反應(yīng)24小時(shí)，使巰基DNA分子與量子點(diǎn)表面的巰基丙酸充分配體交換。
[0027]離心超濾，除去未反應(yīng)的巰基DNA分子，即將反應(yīng)溶液移入10 K超濾管中在5500rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，超濾5次，超濾液為500 μ L的磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，pH 7.4)緩沖液。量子點(diǎn)-DNA截留，而游離的巰基DNA透過(guò)分離膜除去。濾液測(cè)紫外-可見(jiàn)光譜，260nm處基本無(wú)吸收。制備的量子點(diǎn)-DNA探針溶于磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，0.1 M NaCl，pH 7.4)緩沖液中，4 °C冰箱中避光保存。
[0028](2)磁性納米粒子-DNA探針的制備
取10 mg/mL的磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs (其中Fe3O4粒徑為30 nm, SiO2層厚度為10 nm, AuNPs粒徑為5 nm)溶液I mL，磁分離5分鐘，除去上清液，沉淀復(fù)溶于I mL超純水中，依次加入三種100 μ M的巰基DNA溶液100 μ L，混勻，室溫下反應(yīng)8小時(shí)。每隔I小時(shí)加入適量體積的I M的NaCl溶液，使NaCl的終濃度為0.1 Μ，老化12小時(shí)。磁分離，I mL磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，pH 7.4)緩沖液清洗三次，除去未反應(yīng)的巰基DNA。沉淀物用I mL磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，0.1 M NaCl，pH 7.4)緩沖液溶解。向此探針溶液中加入100 μ L，100μ M的巰基己醇溶液，封閉金納米粒子表面未反應(yīng)的非特異性活性位點(diǎn)。25°C下反應(yīng)20分鐘。磁分離，除去上清液，I mL磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，pH 7.4)清洗三次。沉淀物最終復(fù)溶于I mL磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，0.1 M NaCl，pH 7.4)緩沖液中，4°C冰箱中保存。
[0029](3)目標(biāo)生物分子的檢測(cè)
研究構(gòu)建的核酸傳感器對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)靈敏度，三種目標(biāo)分子的濃度范圍均為10PM~10 nM。以下所有溶液均采用經(jīng)高溫高壓滅菌的超純水配制，實(shí)驗(yàn)耗材均經(jīng)高溫高壓滅菌處理，操作均在生物安全柜中進(jìn)行。
[0030]分別移取步驟(1)所得三種量子點(diǎn)-DNA探針各10 μ L，移取步驟(2)所得磁性納米粒子-DNA探針10 μ L，然后對(duì)每一種目標(biāo)核酸分子，將濃度值為10 ρΜ，100 pM，I nM，10ηΜ的四組分別對(duì)應(yīng)加入一組磷酸鹽緩沖液中，雜交體系中，量子點(diǎn)-DNA探針的終濃度為30ηΜ,磁性納米粒子-DNA探針的終濃度為500 μ g/mL,于37°C條件下在恒溫振蕩器上避光輕微振蕩反應(yīng)1.5小時(shí)后，磁分離5分鐘，取上層清液檢測(cè)剩余量子點(diǎn)-DNA的熒光強(qiáng)度，對(duì)目標(biāo)核酸分子濃度和相應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度分別作出核酸傳感器的工作曲線，并計(jì)算傳感器對(duì)這種目標(biāo)核酸分子的線性范圍和檢測(cè)下限。
[0031]熒光測(cè)定條件:激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm，掃速為2nm/s，掃描范圍500~700 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。
[0032]實(shí)施例2:
(O量子點(diǎn)-DNA探針的制備
采用實(shí)驗(yàn)組的程序控制微波輔助水相直接合成水分散性核殼型量子點(diǎn)(例如CdCe/ZnS、CdCe/ZnSe、ZnS/CdS/ZnS 等)，將 I nmol 量子點(diǎn)與 10 nmol 巰基 DNA 混合；加入一定體積的100 mM的Tris-HCl緩沖液，使最終的反應(yīng)緩沖液為10 mM的Tris-HCl溶液；反應(yīng)溶液混勻后，置于恒溫振蕩器上輕微震蕩，25°C下避光反應(yīng)30小時(shí)，使巰基DNA分子與量子點(diǎn)表面的巰基丙酸充分配體交換。
[0033]離心超濾，除去未反應(yīng)的巰基DNA分子，即將反應(yīng)溶液移入10 K超濾管中在5500rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，超濾5次，超濾液為500 μ L的磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，pH 7.4)緩沖液。量子點(diǎn)-DNA截留，而游離的巰基DNA透過(guò)分離膜除去。濾液測(cè)紫外-可見(jiàn)光譜，260nm處基本無(wú)吸收。制備的量子點(diǎn)-DNA探針溶于磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，0.1 M NaCl，pH 7.4)緩沖液中，4 V冰箱中避光保存。
[0034](2)磁性納米粒子-DNA探針的制備
取10 mg/mL的磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs (其中Fe3O4粒徑為40 nm, SiO2層厚度為15 nm, AuNPs粒徑為10 nm)溶液I mL，磁分離5分鐘，除去上清液，沉淀復(fù)溶于I mL超純水中，依次加入三種100 μ M的巰基DNA溶液100 μ L，混勻，室溫下反應(yīng)9小時(shí)。每隔1.5小時(shí)加入適量體積的I M的NaCl溶液，使NaCl的終濃度為0.1 Μ，老化12小時(shí)。磁分離，ImL磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，pH 7.4)緩沖液清洗三次，除去未反應(yīng)的巰基DNA。沉淀物用I mL磷酸鹽(IOmM磷酸鹽，0.1 M NaCl，pH 7.4)緩沖液溶解。向此探針溶液中加入100 μ L，100μ M的巰基己醇溶液，封閉金納米粒子表面未反應(yīng)的非特異性活性位點(diǎn)。25°C下反應(yīng)20分鐘。磁分離，除去上清液，I mL磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，pH 7.4)清洗三次。沉淀物最終復(fù)溶于I mL磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，0.1 M NaCl，pH 7.4)緩沖液中，4°C冰箱中保存。
[0035](3)目標(biāo)生物分子的檢測(cè) 研究構(gòu)建的核酸傳感器對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)靈敏度，三種目標(biāo)分子的濃度范圍均為10PM~10 ηΜ。以下所有溶液均采用經(jīng)高溫高壓滅菌的超純水配制，實(shí)驗(yàn)耗材均經(jīng)高溫高壓滅菌處理，操作均在生物安全柜中進(jìn)行。
[0036]分別移取步驟(1)所得三種量子點(diǎn)-DNA探針各10 μ L，移取步驟(2)所得磁性納米粒子-DNA探針10 μ L，然后對(duì)每一種目標(biāo)核酸分子，將濃度值為10 ρΜ，100 pM，I ηΜ, 10ηΜ的四組分別對(duì)應(yīng)加入一組磷酸鹽緩沖液中，雜交體系中，量子點(diǎn)-DNA探針的終濃度為30ηΜ,磁性納米粒子-DNA探針的終濃度為500 μ g/mL,于37°C條件下在恒溫振蕩器上避光輕微振蕩反應(yīng)1.5小時(shí)后，磁分離5分鐘，取上層清液檢測(cè)剩余量子點(diǎn)-DNA的熒光強(qiáng)度，對(duì)目標(biāo)核酸分子濃度和相應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度分別作出核酸傳感器的工作曲線，并計(jì)算傳感器對(duì)這種目標(biāo)核酸分子的線性范圍和檢測(cè)下限。
[0037]熒光測(cè)定條件:激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm,掃速為2 nm/s,掃描范圍500~700 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。
[0038]實(shí)施例3:
(O量子點(diǎn)-DNA探針的制備
采用實(shí)驗(yàn)組的程序控制微波輔助水相直接合成水分散性摻雜型量子點(diǎn)(例如ZnS:Cu、ZnS:Mn> CdS: Cu等),將I nmol量子點(diǎn)與10 nmol巰基DNA混合；加入一定體積的100 mM的Tris-HCl緩沖液，使最終的反應(yīng)緩沖液為10 mM的Tris-HCl溶液；反應(yīng)溶液混勻后，置于恒溫振蕩器上輕微震蕩，25°C下避光反應(yīng)36小時(shí)，使巰基DNA分子與量子點(diǎn)表面的巰基丙酸充分配體交換。
[0039]離心超濾，除去未反應(yīng)的巰基DNA分子，即將反應(yīng)溶液移入10 K超濾管中在5500rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，超濾5次，超濾液為500 μ L的磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，pH 7.4)緩沖液。量子點(diǎn)-DNA截留，而游離的巰基DNA透過(guò)分離膜除去。濾液測(cè)紫外-可見(jiàn)光譜，260nm處基本無(wú)吸收。制備的量子點(diǎn)-DNA探針溶于磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，0.1 M NaCl，pH 7.4)緩沖液中，4 °C冰箱中避光保存。
[0040](2)磁性納米粒子-DNA探針的制備取10 mg/mL的磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs (其中Fe3O4粒徑為50 nm, SiO2層厚度為20 nm, AuNPs粒徑為20 nm)溶液I mL，磁分離5分鐘，除去上清液，沉淀復(fù)溶于I mL超純水中，依次加入三種100 μ M的巰基DNA溶液100 μ L，混勻，室溫下反應(yīng)10小時(shí)。每隔2小時(shí)加入適量體積的I M的NaCl溶液，使NaCl的終濃度為0.1 Μ，老化12小時(shí)。磁分離，ImL磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，pH 7.4)緩沖液清洗三次，除去未反應(yīng)的巰基DNA。沉淀物用I mL磷酸鹽(IOmM磷酸鹽，0.1 M NaCl，pH 7.4)緩沖液溶解。向此探針溶液中加入100 μ L，100μ M的巰基己醇溶液，封閉金納米粒子表面未反應(yīng)的非特異性活性位點(diǎn)。25°C下反應(yīng)20分鐘。磁分離，除去上清液，I mL磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，pH 7.4)清洗三次。沉淀物最終復(fù)溶于I mL磷酸鹽(10 mM磷酸鹽，0.1 M NaCl，pH 7.4)緩沖液中，4°C冰箱中保存。
[0041](3)目標(biāo)生物分子的檢測(cè) 研究構(gòu)建的核酸傳感器對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)靈敏度，三種目標(biāo)分子的濃度范圍均為10PM~10 ηΜ。以下所有溶液均采用經(jīng)高溫高壓滅菌的超純水配制，實(shí)驗(yàn)耗材均經(jīng)高溫高壓滅菌處理，操作均在生物安全柜中進(jìn)行。
[0042]分別移取步驟(1)所得三種量子點(diǎn)-DNA探針各10 μ L，移取步驟(2)所得磁性納米粒子-DNA探針10 μ L，然后對(duì)每一種目標(biāo)核酸分子，將濃度值為10 ρΜ，100 pM，I ηΜ, 10ηΜ的四組分別對(duì)應(yīng)加入一組磷酸鹽緩沖液中，雜交體系中，量子點(diǎn)-DNA探針的終濃度為30ηΜ,磁性納米粒子-DNA探針的終濃度為500 μ g/mL,于37°C條件下在恒溫振蕩器上避光輕微振蕩反應(yīng)1.5小時(shí)后，磁分離5分鐘，取上層清液檢測(cè)剩余量子點(diǎn)-DNA的熒光強(qiáng)度，對(duì)目標(biāo)核酸分子濃度和相應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度分別作出核酸傳感器的工作曲線，并計(jì)算傳感器對(duì)這種目標(biāo)核酸分子的線性范圍和檢測(cè)下限。
[0043]熒光測(cè)定條件:激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm,掃速為2 nm/s,掃描范圍500~700 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。
[0044]應(yīng)理解上述實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)方案的【具體實(shí)施方式】，而不用于限制本發(fā)明的范圍。在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等同形式的修改和替換均落于本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器，其特征在于，該傳感器為夾心型結(jié)構(gòu)，由基于量子點(diǎn)的DNA探針、目標(biāo)核酸分子和基于磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs的DNA探針通過(guò)堿基互補(bǔ)雜交得到，所述量子點(diǎn)為水分散性量子點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器，其特征在于，所述基于量子點(diǎn)的DNA探針和目標(biāo)核酸分子均為多個(gè)，且數(shù)量相等，每個(gè)量子點(diǎn)的DNA探針均對(duì)應(yīng)一個(gè)目標(biāo)核酸分子，構(gòu)成一組互補(bǔ)雜交雙鏈結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器，其特征在于，所述目標(biāo)核酸分子為DNA或RNA，多個(gè)目標(biāo)核酸分子的序列均不相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器，其特征在于，所述基于量子點(diǎn)的DNA探針的量子點(diǎn)為ZnO、ZnS、ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe,HgTe、PbSe、InP、InCaAs、ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/Hg、CdS/PbS、CdS/Cd (OH) 2、CdCe/ZnS、CdCe/ZnSe、CdCe/CdS、CdTe/CdS、ZnS/CdS/ZnS、CdCe/ HgSe/ CdCe、ZnS:Cu、ZnS:Mn、CdS: Cu、CdS:Mn 中的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器，其特征在于，所述多個(gè)基于量子點(diǎn)的DNA探針的量子點(diǎn)發(fā)射波長(zhǎng)不同,相鄰量子點(diǎn)的波長(zhǎng)間距50-80 nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器，其特征在于，所述基于量子點(diǎn)的DNA探針是按照以下方法制備得到:通過(guò)在室溫下，水相中進(jìn)行配體交換，在熒光量子點(diǎn)表面修飾巰基DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器，其特征在于，所述基于磁性納米粒子 Fe304@Si02@AuNPs的DNA探針包括由內(nèi)至外的磁性納米粒子Fe3O4OSiO2OAuNPs核層、中間層和殼層，所述磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs核層包含I個(gè)或多個(gè)Fe3O4粒子，粒徑為30-50 nm ;所述中間層為SiO2，厚度為10-20 nm ;所述殼層為粒徑為5-20nm的金納米顆粒構(gòu)成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器，其特征在于，所述基于磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs的DNA探針中，多個(gè)巰基DNA通過(guò)金-硫鍵固定于金納米顆粒的表面，所述金納米顆粒表面的非特異性活性位點(diǎn)用巰基己醇封閉。
9.一種制備權(quán)利要求1至8任一權(quán)利要求所述基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器的方法，其特征在于，該方法包括如下具體步驟: (1)基于量子點(diǎn)的DNA探針的制備:將量子點(diǎn)與巰基DNA混合后，加入Tris-HCl緩沖液，混合均勻后，放置恒溫振蕩器上輕微震蕩，避光反應(yīng)24-36小時(shí)，使巰基DNA分子與量子點(diǎn)表面的巰基丙酸發(fā)生配體交換，然后超濾離心，除去未連接到量子點(diǎn)上的DNA分子，超濾所得的截留液用磷酸鹽緩沖液稀釋，即為基于量子點(diǎn)的DNA探針； (2)基于磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs的DNA探針的制備:將磁性納米粒子Fe3O4OSiO2OAuNPs溶液磁分離，除去上清液，復(fù)溶于超純水中，加入與目標(biāo)核酸互補(bǔ)配對(duì)的巰基DNA,室溫下反應(yīng)8-10小時(shí)；然后每隔1-2小時(shí)加入NaCl溶液,老化后進(jìn)行磁分離,然后用磷酸鹽緩沖液清洗，除去未反應(yīng)的巰基DNA ;離心所得沉淀物用磷酸鹽緩沖液溶解后加入巰基己醇，封閉金納米顆粒表面的非特異性活性位點(diǎn)，最后對(duì)溶液依次進(jìn)行磁分離，用磷酸鹽緩沖液清洗后，沉淀物用磷酸鹽溶解，即為基于磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs的DNA探針；(3)目標(biāo)核酸分子的檢測(cè):分別移取步驟(1)所得量子點(diǎn)DNA探針和步驟(2)所得基于磁性納米粒子Fe3O4OSiO2IgAuNPs的DNA探針，加入到磷酸鹽緩沖液中，然后將所得混合溶液加入目標(biāo)核酸分子溶液，混合均勻，錫紙避光，置于恒溫振蕩器上輕微震蕩，雜交反應(yīng)，磁分離后即得到基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器。
10.一種基于權(quán)利要求1至8任一權(quán)利要求所述基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器進(jìn)行多元檢測(cè)的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: 分別取基于磁性納米粒子和量子點(diǎn)的核酸傳感器加入多組磷酸鹽緩沖液，對(duì)每一種目標(biāo)核酸分子，將濃度值為10 PM，100 PM，I nM，10 nM的四組分別對(duì)應(yīng)加入一組磷酸鹽緩沖液中，然后于37°C條件下在恒溫振蕩器上避光輕微振蕩反應(yīng)后磁分離，取上層清液檢測(cè)剩余量子點(diǎn)-DNA的熒光強(qiáng)度，對(duì)目標(biāo)核酸分子濃度和相應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度分別作出核酸傳感器的工作曲線，并計(jì)算傳感器 對(duì)這種目標(biāo)核酸分子的線性范圍和檢測(cè)下限。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK104004642SQ201410179409
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】汪聯(lián)輝, 蘇邵, 范錦偉, 宇文力輝, 宋春元 申請(qǐng)人:南京郵電大學(xué)