用于生產(chǎn)(+)-客烯的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)(+)-客烯的方法，所述方法包含將至少一種多肽與法呢基焦磷酸酯(FPP)接觸。特別是，所述方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行以產(chǎn)生(+)-客烯，其是一種可以用作各種在香料和調(diào)味料領(lǐng)域中非常有用的化合物的前體的化合物。本發(fā)明還提供可用于本發(fā)明方法的多肽的氨基酸序列。編碼本發(fā)明多肽的核酸和含有所述核酸的表達(dá)載體也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種經(jīng)轉(zhuǎn)化以在生產(chǎn)(+)-客烯的方法中使用的非人宿主生物體或細(xì)胞。
【專利說明】用于生產(chǎn)(+)-客烯的方法
[0001]本發(fā)明是2010年5月12日申請的發(fā)明名稱為“用于生產(chǎn)(+)_客烯的方法”的第201080022036.X號發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明提供一種生產(chǎn)(+)_客烯(zizaene)的方法，所述方法包含將至少一種多肽與法呢基焦磷酸酯(FPP)接觸。特別是，所述方法可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行以產(chǎn)生(+)_客烯，其是一種可以用作在香料和調(diào)味料領(lǐng)域中非常有用的多種化合物的前體的化合物。本發(fā)明還提供可用于本發(fā)明方法的多肽的氨基酸序列。編碼本發(fā)明多肽的核酸和含有所述核酸的表達(dá)載體也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種經(jīng)轉(zhuǎn)化以在生產(chǎn)(+)_客烯的方法中使用的非人宿主生物體或細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0003]在大多數(shù)生物 體(微生物、動(dòng)物和植物)中發(fā)現(xiàn)有萜。這些化合物由稱為異戊二烯單元的五碳單元組成，并按其結(jié)構(gòu)之中存在的這些單元的數(shù)目來進(jìn)行劃分。因此單萜、倍半萜和雙萜分別是包含10、15和20個(gè)碳原子的萜。例如，倍半萜廣泛見于植物界。許多倍半萜分子因它們的風(fēng)味和香味性質(zhì)以及它們的美容、醫(yī)藥和抗菌效果而眾所周知。已經(jīng)鑒定出了超過300多種倍半萜烴類和3000多種倍半萜化合物，并且每年都鑒定出許多新的結(jié)構(gòu)。將通過不同方式如蒸汽蒸餾或溶劑萃取獲得的植物提取物用作萜源。萜分子往往原樣使用，但是有時(shí)候使用化學(xué)反應(yīng)將該萜轉(zhuǎn)化成其它的高價(jià)值分子。
[0004]萜的生物合成生產(chǎn)涉及的酶被稱為萜合酶。事實(shí)上植物界中存在大量的倍半萜合酶，其全部使用相同的底物(法呢基焦磷酸酯，F(xiàn)PP)但是具有不同的產(chǎn)物分布。編碼倍半萜合酶的基因和cDNA已經(jīng)被克隆出來并且也已對相應(yīng)的重組體酶進(jìn)行了表征。在植物中及其他生物體中的萜的生物合成已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，在此不進(jìn)一步詳述。
[0005]通常，植物天然提取物的價(jià)格和可用性取決于植物的豐度、含油率和地理來源。另外，天然提取物的可獲性和品質(zhì)極大地依賴于導(dǎo)致每年差異化的氣候及其他當(dāng)?shù)貤l件，使得某些年在高品質(zhì)香料中使用上述成分非常困難，甚至不可能使用。
[0006]巖蘭草油是這些天然提取物中的一種。其是相對昂貴的加香成分，其由倍半萜醇類、醛類和具有復(fù)雜嗅覺分布的酸類的復(fù)雜混合物組成。巖蘭草油的個(gè)體成分也可作為有用的加香成分，但是從油中對它們進(jìn)行大規(guī)模的純化是不可行的。
[0007]因此，非常需要一種獨(dú)立于植物生產(chǎn)巖蘭草油成分的方法，但是迄今為止，此類化合物的成本效益的化學(xué)合成尚不存在。
[0008](+)_客烯是天然產(chǎn)生的倍半萜分子。其可用作在香料和調(diào)味料領(lǐng)域中非常有用的各種化合物(特別是巖蘭草油的成分如客烯醇(khusimol)、客烯-12-醒(zizaen-12-al)和客烯酸(khuzenicacid))的前體。因此，合成(+)_客烯的生物化學(xué)途徑將受到極大的關(guān)注。
[0009]巖蘭草油的成分分析顯示，客烯衍生物是該油的主要組分并提供了巖蘭草氣味。參見例如，Weyerstahl等(2000)，F(xiàn)lav.Fragr.J.，15，395-412。然而，此文獻(xiàn)并沒有給出或者暗示生產(chǎn)(+)_客烯的氨基酸或核苷酸序列。
[0010]在 Del Giudice 等(2008)，The microbial community of Vetiver root and itsinvolvement into essential oil biogenesis, Environ.Microbiol., 10(10), 2824-2841 中研究了巖蘭草根中巖蘭草油的生物合成。該出版物描述了通過從巖蘭草根中分離出的微生物生產(chǎn)倍半萜，并且支持在巖蘭草倍半萜的生物合成中參與有微生物的設(shè)想。我們的結(jié)果與該文章中所做的暗示正好相反，因?yàn)槲覀兊慕Y(jié)果顯示客烯是由巖蘭草根自身表達(dá)的倍半萜合酶生產(chǎn)的，而非微生物群落所生產(chǎn)。
[0011 ] 倍半萜合酶能夠合成巖蘭草油成分的前體，特別是合成(+)-客烯，其在現(xiàn)有技術(shù)中從未公開過。
[0012]公知的倍半萜合酶與本發(fā)明的多肽之間的同一性百分比非常低。最接近于本發(fā)明的(+)-客烯合酶的蛋白質(zhì)序列是來自玉米(Zeamays)的推定職合酶(NCBI檢索號:ACG24265),其具有與本發(fā)明的(+)_客烯合酶有56%的氨基酸序列同一'丨生。目前尚未確認(rèn)由該推定萜合酶獲得的產(chǎn)物。最接近的、完全表征的合酶是來自玉米的(Ε)-β-丁子香烯合酶(NCBI檢索號:ΑΒΥ79212)，其只有51 %同一于本發(fā)明的合酶。
[0013]除序列本身之間的差異之外，還應(yīng)指出的是，由上述酶合成的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與(+)_客烯的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相差懸殊。特別是(Ε)-β-丁子香烯不適合作為生產(chǎn)巖蘭草油成分的前體。
[0014]盡管廣泛研究了萜的環(huán)化，但是由于它們的低豐度、通常的瞬時(shí)表達(dá)模式和在其表達(dá)組織中從樹脂和酚類化合物的混合物中純化它們的復(fù)雜性的原因，萜合酶的分離和表征仍然是困難的，尤 其是在植物中。
[0015]本發(fā)明的目的是，如上所指出的，提供以經(jīng)濟(jì)的方式生產(chǎn)(+)_客烯的方法。因此，本發(fā)明的目的是生產(chǎn)(+)_客烯，同時(shí)有極少浪費(fèi)、節(jié)約能源和資源的方法并同時(shí)減少對化石燃料的依賴性。本發(fā)明的另一目的是提供能夠合成可用作香料和/或芳香成分前體的(+)_客烯的酶。
[0016]使用的縮寫
[0017]bp堿基對
[0018]kb千堿基
[0019]BSA牛血清清蛋白
[0020]cDNA互補(bǔ) DNA
[0021 ] CTAB十六烷基三甲基溴化銨
[0022]DMAPP 二甲基烯丙基二磷酸酯
[0023]DNA脫氧核糖核酸
[0024]dATP脫氧腺苷三磷酸
[0025]dNTP脫氧核苷三磷酸
[0026]DTT二硫蘇糖醇
[0027]EDTA乙二胺四乙酸
[0028]FPP法呢基焦磷酸酯
[0029]GC氣相色譜[0030]idi異戊烯基二磷酸酯異構(gòu)酶
[0031]IPP異戊烯基二磷酸酯
[0032]IPTG異丙基-D-硫代半乳糖苷
[0033]LB溶菌肉湯
[0034]MOPSO3- (N-嗎啉)~2~羥基丙磺酸
[0035]MS質(zhì)譜
[0036]mvaKl甲輕戍酸激酶
[0037]mvaK2甲羥戊酸二磷酸激酶
[0038]PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
[0039]PVP聚乙烯吡咯烷酮
[0040]RMCE重組酶介導(dǎo)的盒式交換
[0041]3’ -/5’ -RACE 3’ /5’ cDNA 末端快速擴(kuò)增
[0042]RNA核糖核酸
[0043]mRNA信使核糖核酸
[0044]TE三羥甲基氨基甲烷(tris)和EDTA
[0045]YNB無氨基酵母氮源

【發(fā)明內(nèi)容】

[0046]本發(fā)明提供一種以經(jīng)濟(jì)、可靠并且可再現(xiàn)的方式生物合成生產(chǎn)(+)_客烯的方法。
[0047]“倍半萜合酶”或“具有倍半萜合酶活性的多肽”在此作為能夠催化從無環(huán)萜前體FPP合成倍半職分子或倍半職分子混合物的多肽。
[0048]作為“⑴-客烯合酶”或作為“具有⑴-客烯合酶活性的多肽”，此處我們是指能夠催化由FPP合成(+)_客烯的多肽。(+)_客烯可以是唯一的產(chǎn)物或可以是倍半萜混合物的一部分。
[0049]多肽催化合成特定倍半萜(例如(+)_客烯)的能力可以簡單地通過實(shí)施實(shí)施例3詳述的酶分析法來確認(rèn)。
[0050]根據(jù)本發(fā)明，多肽也意味著包括截短的多肽，條件是它們保持了任何上述實(shí)施方案所定義的倍半萜合酶活性并且它們與SEQ ID NO:1的相應(yīng)片段共有至少規(guī)定百分?jǐn)?shù)的同一性。
[0051]如本文以下所指出的，“通過修飾SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列而獲得的核苷酸序列”包含已經(jīng)通過使用本領(lǐng)域公知的任何方法(例如通過引入任何類型的突變?nèi)缛笔А⒉迦牖蛉〈耐蛔?改變SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 11或該兩個(gè)序列之一的互補(bǔ)序列的序列所獲得的任何序列。在與變體多肽及其制備方法有關(guān)的描述部分列舉了上述方法的實(shí)例。
[0052]在兩個(gè)肽或核苷酸序列之間的同一性百分比是在這兩個(gè)序列的比對生成時(shí)，在這兩個(gè)序列中相同的氨基酸或核苷酸殘基數(shù)目的函數(shù)。相同的殘基定義為在這兩個(gè)序列中在給定的比對位置上相同的殘基。在此處使用的序列同一性的百分比是由最優(yōu)比對，通過將在兩個(gè)序列之間的相同殘基的數(shù)目除以在最短的序列中的殘基的總數(shù)然后乘以100而計(jì)算得到的。該最佳比對是同一性百分比為最高可能的比對?？梢栽谝换騼蓚€(gè)序列的比對的一個(gè)或多個(gè)位置中引入間隙以便獲得最佳比對。然后在序列同一性的百分比計(jì)算中將這些間隙作為不相同的殘基來考慮。
[0053]以測定氨基酸或核酸序列同一性百分比為目的的比對可以使用計(jì)算機(jī)程序以多種方式來實(shí)現(xiàn)，例如在萬維網(wǎng)上可獲得的公開可用的計(jì)算機(jī)程序。優(yōu)選地，可使用來自 National Center for Biotechnology Information (NCBI)的網(wǎng)址為 http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi 的 BLAST 程序(Tatianaet al, FEMS MicrobiolLett.，1999，174:247-250, 1999)，其參數(shù)設(shè)為默認(rèn)，來獲得肽或核苷酸序列的最優(yōu)比對，以及來計(jì)算序列同一性的百分比。
[0054]因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是一種生產(chǎn)(+)_客烯的方法，包含:
[0055]a)將FPP與至少一種具有(+)-客烯合酶活性的多肽接觸，該多肽包含與SEQ IDNO:1有至少50%同一性的氨基酸序列；
[0056]b)非強(qiáng)制選擇地，分離在步驟a)中產(chǎn)生的(+)_客烯。
[0057]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，該方法是以(+)_客烯作為主產(chǎn)物的生產(chǎn)方法。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，(+)_客烯占由本發(fā)明方法生產(chǎn)的產(chǎn)物的至少50%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)先至少80%、優(yōu)先至少90%。
[0058]該方法可在體外和體內(nèi)實(shí)施，其在下文中將進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0059]要與FPP在體外接觸的多肽可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或酶提取技術(shù)從表達(dá)它的任何生物體中提取 來獲得。如果宿主生物體是將本發(fā)明多肽釋放到培養(yǎng)基內(nèi)的單細(xì)胞生物或細(xì)胞，可以簡單地從該培養(yǎng)基內(nèi)收集該多肽，例如通過離心法、非強(qiáng)制選擇地隨后進(jìn)行洗滌步驟和在適合的緩沖溶液中再懸浮。如果該生物體或細(xì)胞將該多肽聚集在它的細(xì)胞之內(nèi)，該多肽可以通過破裂或溶解該細(xì)胞并進(jìn)一步從該細(xì)胞溶解產(chǎn)物提取來獲得。
[0060]然后可以將具有(+)_客烯合酶活性的多肽(或以分離形式或與其它蛋白質(zhì)一起，例如以從培養(yǎng)細(xì)胞或微生物中獲得的粗蛋白提取物的方式)懸浮在最佳PH下的緩沖溶液中。如果適當(dāng)，可以添加鹽、BSA及其他種類的酶輔助因子以便優(yōu)化酶活性。適當(dāng)?shù)臈l件將在下文的實(shí)施例中更詳細(xì)地描述。
[0061]然后可將前體FPP添加到該多肽懸浮液或溶液中，再將其在最佳的溫度下培養(yǎng)，例如在15°C和400C之間、優(yōu)選在25°C和35°C之間、更優(yōu)選在30°C下。在培養(yǎng)之后，可以非強(qiáng)制選擇地在從該溶液去除多肽之后通過標(biāo)準(zhǔn)分離工序如溶劑萃取和蒸餾將產(chǎn)生的(+)_客烯從該培養(yǎng)的溶液中分尚出來。
[0062]根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，任何上述實(shí)施方式中的方法是在體內(nèi)進(jìn)行的。在這種情況下，步驟a)包含在有利于生產(chǎn)(+)_客烯的條件下培養(yǎng)能夠生產(chǎn)FPP并且經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)至少一種多肽的非人宿主生物體或細(xì)胞，其中該多肽包含與SEQ ID NO:1有至少50%同一性的氨基酸序列并且具有(+)_客烯合酶活性。
[0063]根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，該方法還包含在步驟a)之前用編碼多肽的至少一種核酸轉(zhuǎn)化能夠生產(chǎn)FPP的非人生物體或細(xì)胞以使所述生物體表達(dá)所述多肽，該多肽包含與SEQ ID NO:1有至少50%同一性的氨基酸序列并且具有(+)_客烯合酶活性。
[0064]本發(fā)明的這些實(shí)施方案是特別有益的，因?yàn)橛锌赡茉隗w內(nèi)實(shí)施該方法，而無需預(yù)先分離多肽。該反應(yīng)直接在經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述多肽的生物體或細(xì)胞內(nèi)發(fā)生。
[0065]根據(jù)本發(fā)明一個(gè)特定的實(shí)施方式，編碼(+)_客烯合酶的該至少一種核酸包含與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列有至少50%、優(yōu)選至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一'丨生的核苷酸序列。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸由SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列組成。
[0066]根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式，任何上述實(shí)施方式中使用的該至少一種核酸包含通過修飾SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列獲得的核苷酸序列。根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式，所述至少一種核酸由通過修飾SEQ IDN0:2、SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列獲得的核苷酸序列組成。
[0067]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式,該至少一種核酸是從巖蘭草(Vetiveria zizanoide)中分離得到的。
[0068]該生物體或細(xì)胞意在“表達(dá)”多肽，條件是該生物體或細(xì)胞被轉(zhuǎn)化以包含編碼所述多肽的核酸，該核酸被轉(zhuǎn)錄成mRNA并且在該宿主生物體或細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)該多肽。術(shù)語“表達(dá)”包含“異源表達(dá)”和“過表達(dá)”，后者是 指mRNA、多肽和/或酶活性的水平超過在非轉(zhuǎn)化生物體或細(xì)胞內(nèi)測量得到的水平。隨后在致力于將上述轉(zhuǎn)化的非人宿主生物體或細(xì)胞作為本發(fā)明特定目的的說明書部分和實(shí)施例中對轉(zhuǎn)化非人宿主生物體或細(xì)胞的適合方法作更詳細(xì)地描述。
[0069]特定的生物體或細(xì)胞，當(dāng)其天然產(chǎn)生FPP時(shí)或當(dāng)其并不天然產(chǎn)生FPP但可經(jīng)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生FPP時(shí)，不管是用此處描述的核酸轉(zhuǎn)化之前還是與所述核酸一起都意味著“能夠產(chǎn)生FPP”。經(jīng)轉(zhuǎn)化的與天然存在的生物體或細(xì)胞相比產(chǎn)生更高量FPP的生物體或細(xì)胞也包括在“能夠產(chǎn)生FPP的生物體或細(xì)胞”內(nèi)。轉(zhuǎn)化生物體(例如微生物)以便它們產(chǎn)生FPP的方法已經(jīng)是本領(lǐng)域公知的。這些方法可以例如在文獻(xiàn)中找到，例如在下列出版物中:Martin, V.J., Pitera, D.J., Withers, S.T., Newman, J.D.,和 Keasling, J.D.NatBiotechnol.，2003，21 (7)，796-802 (大腸桿菌(E.coli)的轉(zhuǎn)化)；Wu, S.，Schalk, Μ.，Clark, A., Miles, R.B., Coates, R.,和 Chappell, J., Nat Biotechnol., 2006, 24 (11), 1441-1447(植物的轉(zhuǎn)化)；Takahashi, S., Yeo, Y., Greenhagen, B.T., McMul I in, T., Song, L., Maurina-Brunker, J., Rosson, R., Noel, J., Chappell, J, Biotechnology and Bioengineering, 2007,97(1)，170-181(酵母的轉(zhuǎn)化)。
[0070]為了在體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明，在有利于生產(chǎn)(+)_客烯的條件下培養(yǎng)宿主生物體或細(xì)胞。因此，如果該宿主是轉(zhuǎn)基因植物，則提供最佳的生長條件，例如，如最佳的光、水和營養(yǎng)條件。如果該宿主是單細(xì)胞生物，有利于生產(chǎn)(+)_客烯的條件可以包含在宿主的培養(yǎng)基內(nèi)添加適合的輔助因子。另外，可以選擇培養(yǎng)基，以便最大化(+)_客烯的合成。在下列實(shí)施例中更詳細(xì)地描述了最佳的培養(yǎng)條件。
[0071]適合于在體內(nèi)進(jìn)行本發(fā)明方法的非人宿主生物體可以是任何非人的多細(xì)胞或單細(xì)胞生物體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于在體內(nèi)進(jìn)行本發(fā)明的非人宿主生物體是植物、原核生物或真菌?？梢允褂萌魏沃参?、原核生物或真菌。特別有用的植物是天然產(chǎn)生高含量職的植物。在一個(gè)更優(yōu)選的方式中，該植物選自爺科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、碟形花科(Fabaceae)、錦奏科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)。例如，該植物選自煙草屬(Nicotiana)、爺屬(Solanum)、高粱屬(Sorghum)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica(油菜))、苜猜屬(Medicago(紫花苜猜))、棉屬(Gossypium(棉花))、蒿屬(Artemisia)、鼠尾草屬(Salvia)和薄荷屬(Mentha)。優(yōu)選地，該植物屬于煙草(Nicotianatabacum)種。
[0072]在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于在體內(nèi)進(jìn)行本發(fā)明方法的非人宿主生物體是微生物?？梢允褂萌魏挝⑸?，但是根據(jù)更加優(yōu)選的實(shí)施方式，所述微生物是細(xì)菌或酵母。最優(yōu)選地，所述細(xì)菌是大腸桿菌(E.coli),而所述酵母是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
[0073]這些生物體中的一些天生不會(huì)產(chǎn)生FPP。為了適于進(jìn)行本發(fā)明的方法，必須將這些生物體轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生所述前體。如以上所述，可以在如上述任何實(shí)施方式描述的用核酸修飾之前或者同時(shí)將它們進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0074]還可以使用分離的高等真核細(xì)胞代替完整生物體作為宿主以便在體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明的方法。適合的真核細(xì)胞可以是任何非人的細(xì)胞，但是優(yōu)選植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
[0075]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，在上述任何實(shí)施方式中使用的或由任何上述實(shí)施方式中使用的核酸編碼的、具有(+)_客烯合酶活性的至少一種多肽包含與SEQ ID NO:1有至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一'丨生的氨基酸序列。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多肽由SEQ ID NO:1組成。
[0076]根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式,在上述任何實(shí)施方式中使用的或由上述任何實(shí)施方式中使用的核酸編碼的、具有(+)_客烯合酶活性的至少一種多肽包含通過基因工程獲得的SEQ ID NO:1的變體氨基酸序列。換句話說，所述多肽包含通過修飾SEQ ID NO: 2、SEQ IDNO: 11或它們的互補(bǔ)序列獲得的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方式，在上述任何實(shí)施方式中使用的或由上述任何實(shí)施方式中使用的核酸編碼的、具有(+)_客烯合酶活性的至少一種多肽由通過基因工程獲得的SEQ ID NO:1的變體氨基酸序列組成，SP，通過修飾SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列獲得核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
[0077]在此處所使用的多肽指的是包含此處確定的氨基酸序列的多肽或肽片段、以及截短的或變體多肽，條件是它們保持如以上定義的活性而且它們與相應(yīng)的SEQ ID NO:1片段共有至少定義的百分比的同一性。
[0078]變體多肽的實(shí)例是由選擇性mRNA剪接或此處所述形成多肽的蛋白酶剪切而得到的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?？蓺w因于蛋白水解的變體包括，例如，當(dāng)在不同類型的宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，由于從本發(fā)明多肽上蛋白水解移除一個(gè)或多個(gè)末端氨基酸而導(dǎo)致在N末端或C末端的差異。本發(fā)明也包含如其后所描述的用由本發(fā)明核酸的天然或人工突變而獲得的核酸編碼的多肽。例如，如以下實(shí)施例4所詳述的，SEQ ID NO: 11是通過人工突變SEQ ID NO: 2所獲得的SEQ ID NO:2的變體，產(chǎn)生在大腸桿菌(E.coli)中的表達(dá)被優(yōu)化的并且編碼與SEQID NO: 2相同的(+)_客烯合酶的核苷酸序列(即SEQ ID NO:1) ο序列SEQ ID NO: 2與SEQ IDNO: 11有76%的同一性。
[0079]由在氨基末端和羧基末端融合額外的肽序列而產(chǎn)生的多肽變體也可用于本發(fā)明的方法。尤其是這樣的融合:可以提高多肽的表達(dá)，在期望的環(huán)境或表達(dá)系統(tǒng)中有利于蛋白質(zhì)的提純或多肽酶活性的 改善。這種額外的肽序列例如可以是信號肽。因此，本發(fā)明包含使用變體多肽的方法，例如通過與其它寡肽或多肽融合而獲得的多肽和/或與信號肽連接的多肽。在本發(fā)明的方法中還可以有利地使用由與另外的功能蛋白(例如來源于萜生物合成路徑的另外的蛋白質(zhì))融合而產(chǎn)生的多肽。
[0080]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，在上述任一實(shí)施方式中使用的或由上述任一實(shí)施方式中使用的核苷酸編碼的、具有(+)_客烯合酶活性的至少一種多肽是從巖蘭草(Vetiveriazizanoide)中分離出來的。
[0081]實(shí)施本發(fā)明方法的重要工具為多肽本身。因此，具有(+)_客烯合酶活性的并且包含與SEQ ID NO:1有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽是本發(fā)明的另一目的。
[0082]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，該多肽能夠生產(chǎn)作為主要產(chǎn)物的(+)_客烯。根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式，其能夠生產(chǎn)倍半萜混合物，其中(+)_客烯占產(chǎn)生的倍半萜的至少60%、優(yōu)選地至少80%、優(yōu)選地至少90%。
[0083]根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，該多肽具有(+)_客烯合酶活性。
[0084]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，多肽包含與SEQ ID NO:1有至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一'丨生的氨基酸序列。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，該多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，該多肽由SEQ IDNO:1組成。
[0085]根據(jù)另一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方式，多肽包含由基因工程獲得的SEQ ID NO:1的變體氨基酸序列。換句話說，所述多肽包含通過修飾SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列獲得的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方式，具有(+)_客烯合酶活性的多肽由通過基因工程獲得的SEQ ID NO:1的變體氨基酸序列組成，即，通過修飾SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列獲得核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
[0086]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式,多肽是從巖蘭草(Vetiveria zizanoide)中分離得到的。
[0087]在此處所使用的多肽指的是包含此處確定的氨基酸序列的多肽或肽片段、以及截短的或變體多肽，條件是它們保持如以上定義的活性而且它們與相應(yīng)的SEQ ID NO:1片段共有至少定義的百分比的同一性。
[0088]變體多肽的實(shí)例是由選擇性mRNA剪接或此處所述形成多肽的蛋白酶剪切而得到的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。可歸因于蛋白水解的變體包括，例如，當(dāng)在不同類型的宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，由于從本發(fā)明多肽上蛋白水解移除一個(gè)或多個(gè)末端氨基酸而導(dǎo)致在N末端或C末端的差異。本發(fā)明也包含如其后所描述的用由本發(fā)明核酸的天然或人工突變而獲得的核酸編碼的多肽。例如，如以下實(shí)施例4所詳述的，SEQ ID NO: 11是通過人工突變SEQ ID NO: 2所獲得的SEQ ID NO:2的變體，產(chǎn)生在大腸桿菌中的表達(dá)被優(yōu)化的并且編碼與SEQ ID NO:2相同的(+)_客烯合酶的核苷酸序列(即SEQ ID NO:1) ο序列SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 11有76%的同一性。
[0089]由額外的肽序列在氨基和羧基末端融合而產(chǎn)生的多肽變體也包含于本發(fā)明的多肽之中。尤其是這樣的融合:可以在期望的環(huán)境或表達(dá)系統(tǒng)中提高多肽的表達(dá)，利于蛋白質(zhì)的提純或多肽酶活性的改善。這種額外的肽序列例如可以為信號肽。因此，本發(fā)明包括本發(fā)明的多肽變體，例如通過與其它寡肽或多肽融合而獲得的多肽變體和/或與信號肽連接的那些多肽變體。本發(fā)明的多肽還可以包括由與另外的功能蛋白(例如來源于萜生物合成路徑的另外的蛋白質(zhì))融合而產(chǎn)生的多肽。
[0090]如上所述，編碼本發(fā)明多肽的核酸是修飾在體內(nèi)進(jìn)行該方法時(shí)意欲使用的非人宿主生物體或細(xì)胞的有效手段。
[0091]因此，編碼任何上述實(shí)施方式所述的多肽的核酸也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
[0092]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，該核酸包含與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列有至少50%、優(yōu)選至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，該核酸包含SEQ ID NO: 2、SEQID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列。根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式，該核酸由SEQ ID NO:2,SEQ IDNO: 11或它們的互補(bǔ)序列組成。
[0093]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式,該核酸是從巖蘭草(Vetiveriazizanoide)中分離得到的。
[0094]本發(fā)明的核酸可以定義為包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸聚合物或核糖核苷酸聚合物(DNA和/或RNA)。術(shù)語“核苷酸序列”也應(yīng)該被理解為包含分離片段形式的聚核苷酸分子或寡核苷酸分子或作為較大核酸組分。本發(fā)明的核酸還包含某些分尚的核苷酸序列，該核苷酸序列包括基本上無污染內(nèi)源材料的那些核苷酸序列。本發(fā)明的核酸可以是截短的，條件是其編碼本發(fā)明包含的如上所述的多肽。
[0095]根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式，任一上述實(shí)施方式所述的至少一種核酸包含通過修飾SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列獲得的核苷酸序列。優(yōu)選地所述核酸由通過修飾SEQ ID NO : 2、SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列獲得的核苷酸序列組成。
[0096]本發(fā)明包括含有通過使SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列突變獲得的序列的核酸，條件是該核酸包含的該序列與SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 11或它們互補(bǔ)序列的相應(yīng)片段有至少所定義百分比的同一性、并且該核酸編碼如上任何實(shí)施方式所定義的具有(+)-客烯合酶活性的多肽。突變可以是這些核酸任何種類的突變，如點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變和/或移碼突變?？梢灾苽渥凅w核酸以便使其核苷酸序列適應(yīng)特異性表達(dá)系統(tǒng)。例如，已知細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)在由優(yōu)選的密碼子編碼氨基酸時(shí)更有效地表達(dá)多肽。由于遺傳密碼的簡并性，其中多于一個(gè)的密碼子可以編碼相同的氨基酸，多個(gè)DNA序列可以編碼相同的多肽，本發(fā)明包含所有這些DNA序列。
[0097]另一個(gè)用于轉(zhuǎn)化適于在體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明方法的宿主生物體或細(xì)胞的重要工具是包括本發(fā)明任何實(shí)施方式的核酸的表達(dá)載體。因此，這種載體也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
[0098]此處所使用的“表達(dá)載體”包括任何直鏈的或環(huán)狀的重組載體，其包括但不限于病毒載體、曬菌體和質(zhì)粒。技術(shù)人員能夠根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)選擇適合的載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，該表達(dá)載體包括本發(fā)明的核酸并非強(qiáng)制選擇地包括至少一種選擇標(biāo)記，該核酸可操作地與至少一種調(diào)控序列連接，該調(diào)控序列控制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的開始和/或終止，如轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、操縱子或增強(qiáng)子，或mRNA核糖體的結(jié)合部位。當(dāng)該調(diào)控序列功能上與本發(fā)明的核酸相關(guān)時(shí)，則核苷酸序列是“可操作地連接的”。
[0099]如下述公開中，本發(fā)明的表達(dá)載體可用于制備基因轉(zhuǎn)化的宿主生物體和/或細(xì)胞的方法中，用于包含本發(fā)明核酸的宿主生物體和/或細(xì)胞中、和用于生產(chǎn)或制備具有(+)-客烯合酶活性的多肽的方法中。
[0100]經(jīng)轉(zhuǎn)化以包含本發(fā)明至少一種核酸以便使其異源表達(dá)或過表達(dá)本發(fā)明至少一種多肽的重組非人宿主生物體和細(xì)胞也是實(shí)施本發(fā)明方法的十分有用的工具。因此，這種非人宿主生物體和細(xì)胞是本發(fā)明的另一個(gè)目的。
[0101]任何上述實(shí)施方式所述的核酸都可用于轉(zhuǎn)化非人宿主生物體和細(xì)胞并且所表達(dá)的多肽可以是任何上述的多肽。
[0102]本發(fā)明的非人宿主生物體可以是任何非人的多細(xì)胞或單細(xì)胞生物體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，非人宿主生物體是植物、原核生物或真菌。任何植物、原核生物或真菌都是適合于本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化。特別有用的植物是那些天然產(chǎn)生大量萜的植物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該植物選自爺科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、錦奏科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)類。例如，該植物選自煙草屬(Nicotiana)、爺屬(Solanum)、高粱屬(Sorghum)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica(油菜))、苜猜屬(Medicago (紫花苜猜))、棉屬(Gossypium(棉花))、蒿屬(Artemisia)、鼠尾草屬(Salvia)和薄荷屬(Mentha)。優(yōu)選地，該植物屬于煙草(Nicotianatabacum)種。
[0103]在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該非人宿主生物體是微生物。任何微生物都適合于本發(fā)明，但是根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式，所述微生物是細(xì)菌或酵母。最優(yōu)選地，所述細(xì)菌是大腸桿菌，而所述酵母是釀酒酵母。
[0104]還可以將分離的高等真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化以代替完整的生物體。作為高等真核細(xì)胞，這里我們是指除酵母細(xì)胞之外的任何非人真核細(xì)胞。優(yōu)選的高等真核細(xì)胞是植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
[0105]術(shù)語“經(jīng)轉(zhuǎn)化”是指宿主經(jīng)過遺傳工程以便使其包含上述任何實(shí)施方式中所需要的每個(gè)核酸的一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的事實(shí)。優(yōu)選地，術(shù)語“經(jīng)轉(zhuǎn)化”涉及異源表達(dá)由該核酸編碼的多肽以及過表達(dá)所述多肽的宿主，該宿主經(jīng)所述核酸轉(zhuǎn)化。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物體，其中該多肽的表達(dá)量高于未經(jīng)如此轉(zhuǎn)化的相同生物體的表達(dá)量。
[0106]現(xiàn)有技術(shù)中已知有多種方法用于生成轉(zhuǎn)基因宿主生物體或細(xì)胞，如植物、真菌、原核生物或高等真核細(xì)胞的培養(yǎng)物。適用于細(xì)菌、真菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主的克隆和表達(dá)載體的描述參見，例如，Pouwels等，Cloning Vectors:A LaboratoryManual,1985,Elsevier, New York 和 Sambrook 等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press。尤其用于高等植物和/或植物細(xì)胞的克隆和表達(dá)載體是技術(shù)人員可以得到的。參見例如Schardl等Gene61:1-11, 1987。
[0107]轉(zhuǎn)化宿主生物體或細(xì)胞以使其包含轉(zhuǎn)基因核酸的方法為技術(shù)人員所熟知。對于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，例如通用的方法包括:植物原生質(zhì)體的電穿孔法、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、粒子轟擊法、植物細(xì)胞的顯微注射法和應(yīng)用病毒的轉(zhuǎn)化法。
[0108]在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的DNA被整合到非人宿主生物體和/或細(xì)胞的染色體中，從而得到穩(wěn)定的重組體系統(tǒng)。本領(lǐng)域中任何公知的染色體整合方法可以應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)踐中，包括但不限于重組酶介導(dǎo)的盒式交換(RMCE)、病毒位點(diǎn)特異性染色體插入法、腺病毒法和原核注射法。[0109]為了在體外實(shí)施如上所述生產(chǎn)(+)_客烯的方法，提供一種制備如本發(fā)明任何實(shí)施方式所述的至少一種具有(+)_客烯合酶活性的多肽的方法是非常有利的。因此，本發(fā)明提供一種本發(fā)明任何實(shí)施方式所述的至少一種多肽的生產(chǎn)方法，包含:
[0110]a)培養(yǎng)本發(fā)明任何實(shí)施方式所述的非人宿主生物體或細(xì)胞；
[0111]b)從步驟a)中培養(yǎng)的非人宿主生物體或細(xì)胞中分離多肽。
[0112]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述方法還包含在步驟a)之前，用至少一種本發(fā)明任何實(shí)施方式所述的核酸轉(zhuǎn)化非人宿主生物體或細(xì)胞，以便所述生物體表達(dá)所述核酸編碼的多肽。
[0113]可以使用任何上述實(shí)施方式所述的核酸。
[0114]可以用如上所述的在體內(nèi)生產(chǎn)(+)_客烯的方法來轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)非人宿主生物體或細(xì)胞。可以使用本領(lǐng)域公知的任何技術(shù)從生物體或細(xì)胞中分離出特定多肽以實(shí)施步驟b)。
[0115]“多肽變體”這里指的是這樣一種多肽，其具有(+)-客烯合酶活性且基本上與任何上述實(shí)施方式的多肽同源，但是其具有的氨基酸序列因?yàn)橐惶幓蚨嗵幦笔А⒉迦牖蛉〈煌谟杀景l(fā)明任何核酸序列所編碼的氨基酸序列。
[0116]變體可以包含保守取代序列，意味著 某一特定氨基酸殘基被一具有類似理化特性的殘基所取代。保守取代的實(shí)例包括:用一個(gè)脂肪族殘基取代另一個(gè)脂肪族殘基，例如Ile、Val、Leu或Ala之間相互取代；或者用一個(gè)極性殘基取代另一個(gè)極性殘基，例如在Lys和Arg之間、Glu和Asp之間或Gln和Asn之間相互取代。參見Zubay, Biochemistry, 1983, Addison-ffesley Pub.Co。這類取代的效果可以用取代打分矩陣(如Altschul, J.Mol.Biol.，1991，219，555-565 中所述的 PAM-120、PAM_200 和 PAM-250)計(jì)算得出。其他這類保守取代，例如具有近似疏水性特性的完整區(qū)域的取代，已為本領(lǐng)域熟知。
[0117]天然產(chǎn)生的肽變體也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。這種變體的實(shí)例是由于選擇性mRNA剪接或者本文所述多肽的蛋白酶剪切而得到的蛋白質(zhì)。蛋白水解引起的變體包括，例如，在不同類型宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，由本發(fā)明序列編碼的多肽由于蛋白水解移除了一個(gè)或多個(gè)末端氨基酸而導(dǎo)致N末端或C末端的差異。
[0118]本發(fā)明多肽的變體可以用于獲得例如期望的增強(qiáng)的或減弱的酶活性、改性的區(qū)域化學(xué)(regiochemistry)或立體化學(xué)、或者改變的底物利用或者產(chǎn)物分布、底物親和力的增加、改進(jìn)了特異性的一種或多種目標(biāo)化合物的生產(chǎn)方法、酶反應(yīng)速率的增加、在特定環(huán)境(pH、溫度、溶劑等等)中的更高活性或穩(wěn)定性、或者在目標(biāo)表達(dá)系統(tǒng)中的改進(jìn)的表達(dá)水平。變體或定位突變體可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來生成。天然多肽的變體和衍生物能夠通過分離其它或相同植物品系或物種的天然產(chǎn)生的變體或者變體的核苷酸序列來獲得，或者通過對編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列進(jìn)行人工規(guī)劃突變來獲得。天然氨基酸序列的改變可通過多種傳統(tǒng)方法中的任一種完成。
[0119]由附加的肽序列在本發(fā)明多肽的氨基和羧基末端融合產(chǎn)生的多肽變體可用于增強(qiáng)多肽的表達(dá)，在期望的環(huán)境或表達(dá)系統(tǒng)中利于蛋白的純化或提高多肽的酶活性。這種附加的肽序列例如可以是信號肽。因此，本發(fā)明包括本發(fā)明多肽的變體，例如通過與其它寡肽或多肽和/或連接到信號肽上的多肽融合獲得的那些變體。包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的融合多肽還包含由融合其它功能蛋白質(zhì)(如來自萜生物合成路徑的其它蛋白質(zhì))而產(chǎn)生的融合多肽。[0120]因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種上述任何實(shí)施方式所述的具有(+)-客烯合酶活性的變體多肽的制備方法，包含步驟:
[0121](a)選擇上述任何實(shí)施方式所述的核酸；
[0122](b)修飾所選擇的核酸以獲得至少一種突變核酸；
[0123](C)用該突變核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或單細(xì)胞生物以表達(dá)該突變核酸序列編碼的多肽；
[0124](d)按照至少一種修飾的性質(zhì)篩選該多肽；和，
[0125](e)非強(qiáng)制選擇地，如果該多肽不具有期望的變體(+)_客烯合酶活性，則重復(fù)步驟(a)至(d)直到獲得具有所期望的變體(+)_客烯合酶活性的多肽；
[0126](f)非強(qiáng)制選擇地，如果在步驟(d)中鑒別出具有所期望的變體(+)_客烯合酶活性的多肽，則分離在步驟(C)中獲得的相應(yīng)突變核酸。
[0127]根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所制備的變體多肽能夠生產(chǎn)作為主產(chǎn)物的(+)_客烯。根據(jù)一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式，其能夠生產(chǎn)倍半萜混合物，其中(+)_客烯占有生產(chǎn)的倍半萜的至少60 %、優(yōu)選至少80 %、優(yōu)選至少90 %。
[0128]在步驟(b)中，例如通過隨機(jī)誘變、位點(diǎn)特異性誘變或DNA改組方法可生成大量的突變核酸序列。基因改組的詳細(xì)的步驟可在Stemmer的DNA shuffling by randomfragmentation and reassembly:1n vitro recombination for molecular evolution.ProcNatl Acad Sci USA.，1994，91 (22): 10747 - 1075中找到。總之，DNA改組指的是已知序列在體外的隨機(jī)重組的方法，其包括選擇至少兩種核酸用于重組。例如能夠通過合成含有突變序列的寡聚核苷酸在特定位點(diǎn)引入突變，與能夠連接到天然序列片段的限制性位點(diǎn)側(cè)面相連。連接之后，得到的重構(gòu)序列編碼具有期望的氨基酸插入、置換或缺失的類似物。另外，可使用寡聚核苷酸-定點(diǎn)特異性誘變步驟以提供改變的基因，其中預(yù)先確定的密碼子可通過置換、缺失或插入來改變。
[0129]因此，包含SEQ ID NO:1的多肽可與任何其它編碼核酸的倍半萜合酶例如從除巖蘭草之外的有機(jī)體中分離出來的倍半萜合酶進(jìn)行重組。因此，可獲得并分離出突變核酸，其可根據(jù)例如本實(shí)施例公開的標(biāo)準(zhǔn)步驟來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
[0130]在步驟(d)中，對步驟(C)中獲得的多肽進(jìn)行至少一種修飾的特性例如期望改變的酶活性的篩選。對表達(dá)的多肽進(jìn)行活性篩選所期望的酶活性的實(shí)例包括由Km或Vmax值度量的增強(qiáng)或減弱的酶活性、修飾的區(qū)域化學(xué)或立體化學(xué)、和改變的底物利用或產(chǎn)物分布。酶活性的篩選可根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的步驟以及在本實(shí)施例中公開的步驟來實(shí)施。
[0131]提供步驟(e)以重復(fù)步驟(a)~(d)的過程，優(yōu)選其可平行操作。因此，通過生成大量的突變核酸，可同時(shí)用不同的突變核酸將多個(gè)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使較多數(shù)量的多肽進(jìn)行隨后的篩選。因此獲得期望的多肽變體的機(jī)會(huì)隨技術(shù)人員意愿增加。
[0132]本申請中提及的所有出版物均以參照的方式并入于此，以公開并描述與所引用出版物有關(guān)的方法和/或材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0133]凰1:由巖蘭草( +)_客烯合酶(VzZS)產(chǎn)生的倍半萜的GC-MS分析。A:總離子色譜圖。B:主峰⑴的質(zhì)譜。C:真實(shí)(+)_客烯標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜。經(jīng)鑒定峰I為(+)_客烯。峰2、3和4分別鑒定為前客烯(prezizaene)、α -柏木職烯和β-柏木職烯。用S標(biāo)注的峰為未鑒定的倍半萜化合物。
[0134]S1:由巖蘭草(+)_客烯合酶(VzZS)產(chǎn)生的主要倍半萜化合物的結(jié)構(gòu)。
[0135]由體外(A)和體內(nèi)(B)生產(chǎn)(+)_客烯所獲得的產(chǎn)物分布。各分析中的主峰為(+)-客烯。
【具體實(shí)施方式】
[0136]現(xiàn)在將通過下列實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0137]實(shí)施例1
[0138]RNA提取及cDNA f庫構(gòu)律
[0139]巖蘭草植物來自植物苗圃(TheAustral Plants Company, Les Avirons, TheReunion Island,法國)。在Lullier Agronomy研究所(瑞士)的溫室中、在盆中培養(yǎng)該植物，并且通過劃分為六個(gè)月至一年生的簇進(jìn)行無性繁殖。將植物從盆中取出并用自來水沖洗以收獲其根部。
[0140]為制備cDNA文庫，將從若干植物獲取的根部收集在一起:將幼苗(繁殖后4~6個(gè)月)、具有良好發(fā)育的茂密 的根系統(tǒng)的老植物(繁殖后I~2年)和從盆中取出之后在室溫下干燥24~36小時(shí)的幼苗。將根部從植物的地上部分切下并于液氮中冷凍。首先，使用 Waring Blendor (Waring Laboratory, Torrington, USA)在液氮中將其粗部切碎，然后使用研缽和碾槌將其研磨成細(xì)粉。按照Kolosova等(Kolosova, Miller, Ralph, Ellis, Douglas, Ritland and Bohlmann, Isolation of high-quality RNA from gymnosperm andangiosperm trees.J.Biotechniques, 36 (5), 821-4，2004)中描述的步驟使用下列改進(jìn)以提取總RNA。每2克磨碎的組織使用20ml體積的提取緩沖液，并且該提取緩沖液添加有2% (w/v)的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，Sigma-Aldrich)。對于CTAB(十六烷基三甲基溴化銨，Sigma-Aldrich)提取,將核酸顆粒重懸浮于2ml的TE緩沖液(IOmM Tris-HCl, pH8, ImMEDTA)中，并且用2ml的5M NaCl和lmll0% CTAB來實(shí)施該提取。對于異丙醇沉淀，將核酸顆粒溶于500 μ I TE中。將最終RNA顆粒重懸浮于50 μ I水中。
[0141]根據(jù)制造商手冊，使用SMARTtmPCR cDNA合成試劑盒(ClontechLaboratories, Mountain View, CA)制備雙鏈cDNA文庫，并且在逆轉(zhuǎn)錄步驟中使用SuperScript?II RNAse H-逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)。使用 Iyg 的巖蘭草地下組織總RNA作為cDNA合成的模板，將擴(kuò)增步驟進(jìn)行15個(gè)循環(huán)。將文庫裝載于I %的瓊脂糖凝膠上，洗脫出1.3~3Kb范圍大小的片段。取270ng該cDNA文庫用于測序。
[0142]實(shí)施例2
[0143]倍半萜合酶cDNA的cDNA f庫測序及擴(kuò)增
[0144]將由Illumina(San Diego, California)開發(fā)的小DNA片段的大規(guī)模并行測序技術(shù)用于整個(gè)cDNA文庫的測序。制備測序用DNA,通過Fasteris SA (Plan-les-Ouates,瑞士 )實(shí)施對讀出序列(read)的測序和組裝。接著用Genomic Sample Prep Kit (Illumina)處理cDNA文庫并在基因組分析系統(tǒng)(Genome Analyzer system) (Illumina)上進(jìn)行測序?？偣搏@得4千2百萬35bp讀出序列(其中的3千6百萬為單一序列)。使用EDENA2.1.1對這些讀出序列進(jìn)行拼接，該軟件用于發(fā)現(xiàn)讀出序列間的重疊并將從頭重疊群(de novo contig)進(jìn)行拼接(Hernandez D., Francois P., Farinelli L., 0steras Μ.,和 Schrenzel J., Denovo bacterial genome sequencing !Millions of very short reads assembled ona desktopcomputer.Genome Res.18(5)，802 - 809, 2008)。在排除短于 100喊基的重疊群(contig)后，獲得最大長度為1882bp的4324個(gè)單一重疊群。另一拼接使用Velvetl.0程序(Zerbinoand Birney (2008), Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijngraphs.Genome Res.18 (5)，821-829)，得到 100 ~2006 之間堿基長度的 9264 個(gè)單一重疊群。
[0145]使用Blastx 算法(Altschul 等的 J.Mol.Biol.215，403-410，1990)將產(chǎn)生的所有重疊群與蛋白序列數(shù)據(jù)庫(含有甄選的7000種植物蛋白質(zhì)序列)進(jìn)行比較。將顯示出與植物倍半萜合酶具有顯著的序列同源性的重疊群保留下來，并且通過對每個(gè)選出的重疊群在NCBI非冗余蛋白質(zhì)序列(NCBI ；http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中進(jìn)行blast檢索以進(jìn)一步確認(rèn)其同源性。如此，15個(gè)重疊群被確認(rèn)為編碼cDNA的倍半萜片段。
[0146]選出的重量疊群之一(VzCtg306，SEQ ID NO: 3)為1090bp長度，并且其與全長萜合酶的序列比較顯示缺失了 3’末端和5’末端。由該序列設(shè)計(jì)出了兩個(gè)正向引物(ctg306-3Rl (SEQ ID NO: 4)和 ctg306_3R2 (SEQ ID NO: 5))和兩個(gè)反向引物(ctg306-5Rl (SEQ ID NO:6)和 ctg306_5R2, (SEQ ID NO: 7))，并將這些引物用于 cDNA 末端的快速擴(kuò)增(RACE)。將 SMART? RACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒(Clontech Laboratories, MountainView, CA)與PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa Bio, Shiga,日本)一起使用。因此，各從 1.2 μ g巖蘭草根總 RNA 制備了 SMART?5’RACE-Ready cDNA 和 SMART?3 ’ RACE-Ready cDNA 池。對于5’RACE，使用 UPM 引物(Clontech Laboratories)和 ctg306_5Rl 引物(SEQ ID NO:6)進(jìn)行第一輪 PCR，接著使用 NUP 引物(Clontech Laboratories)和 ctg306_5R2 引物(SEQ ID NO: 7)進(jìn)行第二輪PCR。對于 3’RACE，使用 UPM 引物(Clontech Laboratories)和 ctg306_3Rl (SEQID NO:4)引物進(jìn)行第一輪 PCR，接著使用 NUP 引物(Clontech Laboratories)和 ctg306_3R2引物(SEQIDN0:5)進(jìn)行第二輪PCR。該擴(kuò)增是在制造商手冊(Clontech)中詳細(xì)描述的條件下進(jìn)行的。
[0147]5’和3’ RACE的結(jié)合可以重構(gòu)含有開放閱讀框1668bp(SEQ ID NO:2)的1925bpcDNA(VzZS, SEQ ID NO: 8)，該開放閱讀框可用于編碼555氨基酸長度的蛋白質(zhì)(SEQ IDNO:1)。
[0148]實(shí)施例3
[0149]異源表汰和酶的表征
[0150]使用引物ctg306-啟動(dòng)(SEQ ID NO:9)和 ctg306_ 終止(SEQ ID NO: 10)從SMART?5’RACE-Ready cDNA 池?cái)U(kuò)增出全長 VzZS 開放閱讀框(VzZS-ORF, SEQ ID NO: 2) ? 表達(dá)構(gòu)造體的該cDNA的擴(kuò)增是使用Pfu DNA聚合酶(Promega, Madison, WI, USA)，在含有5 μ I的Pfu DNA聚合酶10Χ緩沖液、各200 μ M的dNTP、正向弓丨物和反向弓丨物各0.4 μ M、2.9單位Pfu DNA聚合酶和2.5 μ I的cDNA (如上所述進(jìn)行制備)的終體積為50 μ I的條件下進(jìn)行的。熱循環(huán)條件如下:95°C下1.5分鐘；95°C下45秒、54°C下30秒和72°C下4分鐘，30個(gè)循環(huán)；和72°C下10分鐘。
[0151]按照制造商手冊，使用Champion pETlOl Directional T0P0表達(dá)試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)將PCR產(chǎn)物插入至pET101/D_T0P0載體中。篩選出若干克隆體并對質(zhì)粒插入物進(jìn)行測序以確認(rèn)該序列與由RACE獲得的序列相同。
[0152]使用質(zhì)粒ρΕΤΙΟΙ-VzZS 轉(zhuǎn)化 B121(DE3)大腸桿菌細(xì)胞(Novagen, Madison, WI)。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞的單菌落接種于5ml的LB培養(yǎng)基中。在37°C下培育5~6小時(shí)后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至20°C的培養(yǎng)箱中并放置平衡I小時(shí)。然后，加入ImM IPTG以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，將培養(yǎng)物在20°C培育過夜。第二天，通過離心收集細(xì)胞，并將其重懸浮于0.1體積的50mM MOPSOpH7和10%的丙三醇中，超聲使其溶解。離心(20，OOOg下30分鐘)凈化提取物，將含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。
[0153]將含有重組蛋白質(zhì)的粗大腸桿菌蛋白質(zhì)提取物用于酶活性的表征。按Keller，R.K.和 Thompson, R., J.Chromatogr.645 (I), 161-167，1993 所述來合成法呢基二憐酸酷(FPP)。該測定是在10~100 μ M底物和0.1~0.5mg粗蛋白質(zhì)的存在下，在I~4mL的50111]\?0?5(^!17、10%丙三醇、1111101'1'和IOmMMgCl2中進(jìn)行的。將試管在30°C下培育12~24小時(shí)，并用I體積戊烷萃取兩次。在氮?dú)饬飨聺饪s，用GC和GC-MS對提取物進(jìn)行分析，并與對照蛋白質(zhì)提取物的測試進(jìn)行對比。該GC分析是使用0.25mm內(nèi)徑X 30m的SPB-1毛細(xì)管柱(Supelco, Bellefonte, PA)、在配置有火焰離子化檢測器的Agilent6890Series GC系統(tǒng)上進(jìn)行的。載氣是以lmL/min恒流的He。初始爐溫為80°C (保持I分鐘)，隨后以10°C /分鐘的梯度升至300°C。GC-MS分析是在同樣的條件下進(jìn)行的，并且在Agilent5975質(zhì)量檢測器上記錄圖譜。
[0154]在這些條件下，由VzZS cDNA編碼的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的一種主要倍半萜占所生產(chǎn)的倍半萜混合物的75%。通過將質(zhì)譜和保留指數(shù)與可靠的標(biāo)準(zhǔn)樣和公開數(shù)據(jù)(Joulain, D., and Konig ,Ik., The Atlas of Spectral Data of SesquiterpeneHydrocarbons, EB Verlag, Hamburg, 1998)的對比，該主產(chǎn)物鑒定為(+)-客烯。該酶還生產(chǎn)了 6.9%的前客烯(prezizaene)、2.8%的α -柏木職烯、2.7%的β_柏木職烯和比例在 0.85~8.7%間的至少3種其它倍半萜(圖2)。因此，從巖蘭草分離得到的VzZS cDNA編碼生產(chǎn)巖蘭草根部中最豐富倍半萜的烴前體(客烯醇、客烯-12-醛和客烯酸)的(+)-客烯合酶(SEQ ID NO:1)。該酶還產(chǎn)生了作為第二產(chǎn)物的若干巖蘭草根部的次要成分的前體。
[0155]實(shí)施例4
[0156]重組VzZS蛋白質(zhì)在細(xì)菌中體內(nèi)生產(chǎn)(+)_客烯的應(yīng)用
[0157]為了在大腸桿菌中VzZS的最佳表達(dá)，考慮到宿主密碼子的使用以及影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯的其它參數(shù)，重新設(shè)計(jì)了了 VzCtg306cDNA的ORF的DNA序列。設(shè)計(jì)并用NdeI和KpnI限制性內(nèi)切位點(diǎn)以及3’和5’末端合成了優(yōu)化序列(VzZS-opt，SEQID NO: 11) (DNA2.0, Menlo Park, CA, USA)，并且將該序列亞克隆至 pETDuet-Ι 質(zhì)粒(Novagene, Madison, WI)中，獲得質(zhì)粒 pETDuet-VzZS-opt。
[0158]為了評估體內(nèi)(+)_客烯的生產(chǎn)，用pETDuet-VzZS-opt質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞,并且評估由內(nèi)源性FPP池對倍半萜的生產(chǎn)。為了提高細(xì)胞的生產(chǎn)率，將FPP合酶和編碼部分甲羥戊酸路徑的基因在同一細(xì)胞中表達(dá)。將后者這些基因編排在單個(gè)的操縱子中并編碼甲羥戊酸激酶(mvaKl)、磷酸甲羥戊酸激酶(mvaK2)、甲羥戊酸二磷酸酯脫羧酶(MvaD)和異戊烯基二磷酸酯異構(gòu)酶(idi)和轉(zhuǎn)化的外源性甲羥戊酸至FPP合酶的兩個(gè)底物:異戊烯基二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)。
[0159]酵母FPP合酶基因是從釀酒酵母基因組DNA使用引物FPPy_NcoI (SEQ IDNO: 12)和 FPPy-Eco (SEQ ID NO: 13)擴(kuò)增得到的。該基因組 DNA 是使用 Qiagen RNA/DNAMaxi Kit (Qiagen AG, Basel,瑞士)從釀酒酵母中分離得到的。PCR是使用Pfu DNA聚合酶(Promega AG, Dubendorf,瑞士)，在終體積為50 μ I含有各引物0.4 μ 1、200 μ MdNTPs、0.5μ I DNA聚合酶和5μ I釀酒酵母基因組DNA中進(jìn)行的。該P(yáng)CR循環(huán)條件如下:95°C下90秒；95°C下45秒、54°C下30秒和72°C下4分鐘，28個(gè)循環(huán)；72°C下10分鐘。在T7啟動(dòng)子的控制下，將擴(kuò)增的DNA作為Nde1-EcoRI片段連接在pACYCDuet_l質(zhì)粒(Novagen, Madison, WI)的第一多克隆位點(diǎn)(MCSl)上，獲得包含有FPPs的質(zhì)粒pACYCDuet-FPPs。
[0160]使用引物MVA-upl-start (SEQ ID NO: 14)和 MVA-up2_stop (SEQ ID NO: 15)從肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) (ATCC BAA-334, LGC Standards, Mo I she im,法國)的基因組DNA擴(kuò)增出了含有編碼mvaKl、mvaK2、MvaD和idi的基因的操縱子。使用PfuUltra?IIFusion HS DNA 聚合酶(Stratagene, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)進(jìn)行PCR。根據(jù)制造商手冊混合PCR混合物的組分。其熱循環(huán)條件為:95°C下2分鐘；95°C下20秒、58°C下20秒和72°C下90秒，30個(gè)循環(huán)；和72°C下3分鐘。在瓊脂糖凝膠上純化該3.8Kb片段，并且使用 In-Fusion?Dry-Down PCR Cloning Kit (Clontech Laboratories)將其連接至用NdeI和XhoI消化過的pACYCDuet-FPPs質(zhì)粒的第二 MCS上，獲得質(zhì)粒pACYCDuet-4506。對該兩個(gè)插入物的序列進(jìn)行完全測序以排除任何突變。
[0161]用質(zhì)粒pETDuet-VzZS-opt轉(zhuǎn)化或用該質(zhì)粒與質(zhì)粒pACYQ)uet-4506共轉(zhuǎn)化BL21Star?(DE3)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)。在羧節(jié)青霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的LB-瓊脂糖平板上篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。將單個(gè)菌落接種至添加有相同抗生素的5mL液體LB培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物在37°C培育過夜。第二天，取0.2mL該過夜培養(yǎng)物接種至2mL添加有相同抗生素的TB培養(yǎng)基中。在37°C培育6小時(shí)后，將培養(yǎng)物冷卻至28°C，然后向每管加入ImM IPTG、2mg/mL甲羥戊酸(將甲羥戊酸內(nèi)酯(Sigma)溶于0.5NNaOH制備濃度為lg/mL 并將該溶液在37°C培育30分鐘)和0.2ml癸烷。在28°C將培養(yǎng)物培育48小時(shí)。然后用2體積的乙酸乙酯萃取該培養(yǎng)物兩次，將有機(jī)相濃縮至500 μ L并按以上實(shí)施例3中所述進(jìn)行GC-MS分析。用生產(chǎn)(+)_客烯合酶、FPP合酶和四種甲羥戊酸路徑酶的細(xì)胞，獲得了 0.lmg/mL的生產(chǎn)率，并且其產(chǎn)物分布與體外測試所觀察到的分布相同(圖 3)。
[0162]本實(shí)施例顯示用本發(fā)明所定義的(+)_客烯合酶轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞能夠生產(chǎn)(+)_客烯。用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的其它酶對于生產(chǎn)(+)_客烯并不是必需的。事實(shí)上，當(dāng)只用(+)_客烯合酶轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞時(shí)，其也能生產(chǎn)(+)_客烯，只是產(chǎn)量較低。用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的其它酶的加入只是為了增加可用于(+)_客烯合酶的前體的量的目的。
[0163]實(shí)施例5
_4] 重組VzZS蛋白質(zhì)在酵母中體內(nèi)生產(chǎn)(+)_客烯的應(yīng)用
[0165]為了在酵母細(xì)胞體內(nèi)生產(chǎn)倍半萜，通過將原有的ERG9啟動(dòng)子替換為MET3啟動(dòng)子而下調(diào)釀酒酵母菌株(YNP5)中的ERG9基因(用于編碼鯊烯合酶，該酶將FPP轉(zhuǎn)化為鯊烯)的表達(dá)，從而獲得具有弱化麥角留醇生物合成和提高的可用于倍半萜合酶的FPP池的菌株(Asadollahi, M.A., Maury, J., M0ller., K, Nielsen, K.F., Schalk, Μ., Clark, A.,和Nielsen, J., Biotechnology and Bioengineering99(3), 666-677，2008)。[0166]使用Ctg306_start_opt(SEQ ID NO:16)和 Ctg306_stop_opt(SEQ ID NO:17)從pETDuet-VzZS-opt質(zhì)粒擴(kuò)增出VzZS cDNA。使用Pfu DNA聚合酶(Promega)和下列熱循環(huán)條件進(jìn)行該P(yáng)CR:94°C下90秒；94°C下30秒、55 °C下30秒、72 °C下4分鐘，35個(gè)循環(huán)；和72°C下10分鐘。將擴(kuò)增的cDNA純化并在0.2mM dATP和IU HotStart Taq DNA聚合酶的存在下
于72°C在適當(dāng)緩沖液(Qiagen)中培育15分鐘以添加3’A突出端。使用pYES2.1 TOPOi0TA 表達(dá)試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)將該 cDNA 連接至 pYES2.l/V5_His-TOPO*質(zhì)粒上。以插入物的正確的序列和取向?qū)|(zhì)粒進(jìn)行篩選，并使用S.c.EasyComp?轉(zhuǎn)化試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化YNP5酵母細(xì)胞。
[0167]取該轉(zhuǎn)化酵母菌株的一個(gè)單一菌落接種20ml添加有2%葡萄糖的YNB培養(yǎng)基(5g/L (NH4)2SO4 ；3g/L KH2PO4 ；0.5g/L MgSO4.7H20 ；lmL/L 痕量金屬溶液)。在 28°C下培育該培養(yǎng)物24小時(shí)。通過離心回收細(xì)胞并重懸浮于20mL添加有2%半乳糖的YNB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)1小時(shí)后，向培養(yǎng)物中加入終濃度為0.5mM的甲硫氨酸和2mL癸烷。在28°C下培育24小時(shí)后，用乙酸乙酯萃取該培養(yǎng)物并按實(shí)施例3所述進(jìn)行GC-MS分析。在這些條件下由酵母細(xì)胞生產(chǎn)的倍半萜的總質(zhì)量估計(jì)為25mg/L。
【權(quán)利要求】
1.具有(+)-客烯合酶活性的多肽，該多肽包含與SEQID NO:1有至少50%同一性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于包含與SEQID NO:1有至少70%、優(yōu)選至少90%同一性的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于包含氨基酸序列SEQID NO:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于由SEQID NO:1組成。
5.編碼權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的多肽的核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸，其特征在于包含與SEQID NO:2、SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列有至少50%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少90%同一性的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸，其特征在于包含核苷酸序列SEQID NO: 2,SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸，其特征在于由SEQID NO:2、SEQ ID NO: 11或它們的互補(bǔ)序列組成。
9.包含權(quán)利要求5~8中任一項(xiàng)所述的核酸的表達(dá)載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體，其為病毒載體、噬菌體或質(zhì)粒的形式。
11.根據(jù)權(quán)利要求9 或10所述的表達(dá)載體，包括本發(fā)明的核酸并非強(qiáng)制選擇地包括至少一種選擇標(biāo)記，該核酸可操作地與至少一種調(diào)控序列連接，該調(diào)控序列控制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的開始和/或終止，如轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、操縱子或增強(qiáng)子或mRNA核糖體的結(jié)合部位。
12.—種非人宿主生物體或細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)化以包含至少權(quán)利要求5~8中任一項(xiàng)所述的核酸，從而其異源表達(dá)或過表達(dá)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的至少一種多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的非人宿主生物體，其特征在于為植物、原核生物或真菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的非人宿主生物體，其特征在于為微生物，優(yōu)選細(xì)菌或酵母。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的非人宿主生物體，其特征在于所述細(xì)菌為大腸桿菌并且所述酵母為釀酒酵母。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的高等真核細(xì)胞，其特征在于為植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
17.生產(chǎn)(+)_客烯的方法，包含: a)將FPP與權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的至少一種多肽接觸； b)非強(qiáng)制選擇地，分離在步驟a)中產(chǎn)生的(+)_客烯。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于步驟a)包含在有助于生產(chǎn)(+)_客烯的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12~15中任一項(xiàng)所述的非人宿主生物體或細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于還包含在步驟a)之前用權(quán)利要求5~8任一項(xiàng)所述的至少一種核酸轉(zhuǎn)化能夠生產(chǎn)FPP的非人宿主生物體或細(xì)胞以使所述生物體表達(dá)由所述核酸編碼的多肽。
20.生產(chǎn)權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的至少一種多肽的方法，包含: a)培養(yǎng)權(quán)利要求12~15任一項(xiàng)所述的非人宿主生物體或細(xì)胞； b)從步驟a)中培養(yǎng)的非人宿主生物體或細(xì)胞中分離多肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于還包含在步驟a)之前用權(quán)利要求5~8任一項(xiàng)所述的至少一種核酸轉(zhuǎn)化能夠生產(chǎn)FPP的非人宿主生物體或細(xì)胞，以使所述生物體表達(dá)由所述核酸編碼的多肽。
22.制備具有(+)_客烯合酶活性的變體多肽的方法，包含步驟: (a)選擇權(quán)利要求5~8任一項(xiàng)所述的核酸； (b)修飾所選擇的核酸以獲得至少一種突變核酸； (c)用該突變核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或單細(xì)胞生物以表達(dá)由該突變核酸序列編碼的多肽； (d)按照至少一種修飾的性質(zhì)篩選該多肽；和， (e)非強(qiáng)制選擇地，如果該多肽不具有期望的變體(+)_客烯合酶活性，則重復(fù)步驟(a)至(d)直到獲得具有所期望的變體(+)_客烯合酶活性的多肽； (f)非 強(qiáng)制選擇地，如果在步驟(d)中鑒別出具有所期望的變體(+)_客烯合酶活性的多肽，則分離在步驟(C)中獲得的相應(yīng)突變核酸。
【文檔編號】C12N15/60GK104017794SQ201410200220
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2009年5月20日
【發(fā)明者】M·沙爾克, F·德蓋里 申請人:弗門尼舍有限公司