一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的pcr-hrm引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM引物和方法，該方法為先從樣品中提取病毒DNA；以病毒DNA為模板，利用所設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)和熒光飽和染料進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；最后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定犬細(xì)小病毒的基因型。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，只需PCR反應(yīng)之前加熒光飽和染料即可；檢測(cè)速度快且高通量：全部操作過(guò)程只需3小時(shí)，不需要病毒的細(xì)胞培養(yǎng)，極大縮短了分型所需時(shí)間；費(fèi)用低，不需要特異性探針，每個(gè)樣品的飽和染料成本為1.6RMB；準(zhǔn)確性高、特異性好，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確、快速、高通量地進(jìn)行分析，有利于在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】—種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM引物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒基因分型的方法，具體涉及一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM引物和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus, CPV)為單鏈小DNA病毒，是引起犬急性出血性胃腸炎和幼犬急性心肌炎的主要病原。1977年，Eugster和Nairn首次從患出血性腸炎的病犬的糞便中分離到犬細(xì)小病毒，并命名為CPV-2。自Eugster等人首次分離獲得CPV-2以來(lái)，CPV抗原性隨時(shí)間的推移而不斷發(fā)生改變，不斷有新的CPV基因型和抗原型出現(xiàn)，并在世界范圍內(nèi)廣泛傳播流行。目前已知的CPV基因型包括CPV-2a、CPV-2b和CPV_2c，而原始型CPV-2基因型已被新出現(xiàn)的抗原變異株取代。CPV-2a、CPV_2b和CPV_2c三種基因型核酸序列差異主要體現(xiàn)在VP2基因序列上2個(gè)單核苷酸多肽性(SNP)位點(diǎn)上，第一個(gè)SNP位點(diǎn)為A4062G，分別對(duì)應(yīng)CPV-2a (AAT)和CPV_2b (GAT)。第二個(gè)SNP位點(diǎn)為T(mén)4064A，分別對(duì)應(yīng) CPV-2b (GAT)和 CPV-2c (GAA)。
[0003]傳統(tǒng)的各種基因分型方法都存在各自的不足之處，如病毒分離與鑒定方法需借助3種不同單克隆抗體才能完成分型，費(fèi)時(shí)費(fèi)力不易快速區(qū)分犬細(xì)小病毒不同基因型；血凝抑制試驗(yàn)方法對(duì)犬細(xì)小病毒梯度要求較高，一般梯度大于1:64才可用相應(yīng)單克隆抗體來(lái)鑒別，而梯度小于1:32則需通過(guò)在MDCK或F81細(xì)胞上擴(kuò)增后方能用單克隆抗體來(lái)檢測(cè)；而普通PCR方法特異性不高，熒光定量PCR方法(MGB探針)雖然能準(zhǔn)確區(qū)分犬細(xì)小病毒不同基因型，但同時(shí)需要兩對(duì)探針價(jià)格昂貴，限制其在生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用等等。
[0004]傳統(tǒng)的CPV分型方法有病毒分離與鑒定(VI)、血凝抑制試驗(yàn)(HI)、普通PCR方法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)方法、MGB探針?lè)椒ê蜏y(cè)序等，其中病毒分離與鑒定方法需借助3個(gè)不同型單克隆抗體才能完成分型，費(fèi)時(shí)費(fèi)力不易快速鑒別CPV不同亞型；血凝抑制試驗(yàn)方法對(duì)CPV病毒梯度要求較高，一般梯度大于1:64才可用相應(yīng)單克隆抗體來(lái)鑒別，而梯度小于1:32則需通過(guò)在MDCK或F81細(xì)胞上擴(kuò)增后方能用單克隆抗體來(lái)檢測(cè)；PCR方法利用CPV-2b序列引物3 '末段堿基錯(cuò)配方式區(qū)分CPV-2a和CPV_2b型，此方法雖然能區(qū)分CPV-2a和CPV-2b型，但特異性不高容易同時(shí)擴(kuò)增出兩個(gè)型。此外，新出現(xiàn)的CPV變異株表明3 ,末段堿基錯(cuò)配法保守性差，易受到病毒核酸序列突變影響，因此普通PCR方法很難對(duì)CPV進(jìn)行準(zhǔn)確分型；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法能夠區(qū)分CPV-2b和CPV-2c型，但區(qū)分不了 CPV-2a和CPV-2b型，因?yàn)镸bo II酶對(duì)CPV_2a和CPV_2b酶切結(jié)果相同，此方法只能在用單克隆抗體確認(rèn)為CPV-2b的前體下才能鑒別CPV-2b和CPV-2c基因型；MGB探針?lè)椒m然能夠區(qū)分CPV不同基因型，但同時(shí)合成兩個(gè)或以上探針，價(jià)格昂貴不易在臨床檢測(cè)中使用；測(cè)序方法雖然準(zhǔn)確率高，但價(jià)格偏高所需時(shí)間長(zhǎng)，一般要24小時(shí)才能完成。
[0005]上述方法均未能克服操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、費(fèi)用高等缺點(diǎn)，在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用受限。因此，目前急需一種操作相對(duì)簡(jiǎn)易、檢測(cè)結(jié)果可靠且檢測(cè)成本低廉的犬細(xì)小病毒基因分型方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述存在的問(wèn)題，本發(fā)明建立了一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM引物和方法，該方法操作簡(jiǎn)易、快速、檢測(cè)結(jié)果可靠且檢測(cè)成本低廉，有利于在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM引物。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM方法。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示:
引物 Pl:CCAGAAGGAGATTGGATTCA (SEQ ID NO:I)或其核苷酸互補(bǔ)序列，
引物 P2:TTAATGCAGTTAAAGGACCAT (SEQ ID NO:2)或其核苷酸互補(bǔ)序列。
[0010]一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM方法，包括以下步驟:
O從樣品中提取病毒DNA ； 2)以DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)和熒光飽和染料進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
3)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定病毒的基因型。
[0011]進(jìn)一步的，步驟2)中的擴(kuò)增反應(yīng)體系為:
Premix Ex-Taq 5 μ I
引物 Pl 0.4μ I 引物 Ρ2 0.4μ I 模板 0.8 μ I LC green 染料 I μ I ddH20 至 10 μ I。
[0012]進(jìn)一步的，步驟2)中的擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s ;循環(huán) 35 次；72°C終延伸 8min ;90°C變性 lmin，30°C雜交 2min，68°C到80°C以0.3°C /步的速率進(jìn)行熔解曲線分析。
[0013]進(jìn)一步的，驟3)中所述HRM分析的具體分析過(guò)程為:1)若HRM曲線中存在Tm值為73.48±0.10°C的曲線，說(shuō)明該樣品含有基因型為CPV-2a型的犬細(xì)小病毒；
2)若HRM曲線中存在Tm值為72.94±0.05°C的曲線，說(shuō)明該樣品中含有基因型為CPV-2b或CPV-2c的犬細(xì)小病毒；
3)在上述2)種情況下，往擴(kuò)增產(chǎn)物中加入以CPV-2bDNA為模板，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2為引物的PCR產(chǎn)物后，再進(jìn)行HRM曲線分析:
a.若Tm值為72.94±0.05°C的曲線形狀不發(fā)生變化，說(shuō)明該樣品含有CPV_2b基因型犬細(xì)小病毒不含有CPV_2c型病毒；
b.若Tm值為72.94±0.05°C的曲線形狀發(fā)生變化，產(chǎn)生了雜合子曲線，說(shuō)明該樣品含有CPV-2c型犬細(xì)小病毒。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:O本發(fā)明首次建立了一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM引物和方法，操作簡(jiǎn)單:只需PCR反應(yīng)之前加熒光飽和染料即可；檢測(cè)速度快且高通量:全部操作過(guò)程只需3小時(shí)，不需要病毒的細(xì)胞培養(yǎng)，極大縮短了分型所需時(shí)間；費(fèi)用低，不需要特異性探針，每個(gè)樣品的飽和染料成本為1.6 RMB ;準(zhǔn)確性高、特異性好，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確、快速、高通量地進(jìn)行分析，有利于在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
[0015]2)本發(fā)明的PCR-HRM引物，簡(jiǎn)并性好，對(duì)3種亞型的犬細(xì)小病毒均有很好地的擴(kuò)增性，有助于提高PCR的效率，減少病毒鑒別分型的時(shí)間。
[0016]3)本發(fā)明的PCR-HRM引物特異性好，除可以與3種亞型的犬細(xì)小病毒結(jié)合，不與其他常見(jiàn)犬類病毒DNA結(jié)合，特異性擴(kuò)增犬細(xì)小病毒DNA，有利于提高本發(fā)明對(duì)基因型分析的正確性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為不同基因型犬細(xì)小病毒的HRM高分辨率熔解曲線；
圖2為不同基因型犬細(xì)小病毒的雜合子HRM高分辨率熔解曲線；
圖3為實(shí)際樣品檢測(cè)中不同基因型犬細(xì)小病毒的HRM高分辨率熔解曲線；
圖4為實(shí)際樣品檢測(cè)中不同基因型犬細(xì)小病毒的雜合子HRM高分辨率熔解曲線；
圖5為特異性實(shí)驗(yàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示: 引物 Pl:CCAGAAGGAGATTGGATTCA (SEQ ID NO:I)或其核苷酸互補(bǔ)序列，
引物 P2:TTAATGCAGTTAAAGGACCAT (SEQ ID NO:2)或其核苷酸互補(bǔ)序列。
[0019]一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM方法，包括以下步驟:
O從樣品中提取病毒DNA ；
2)以DNA為模板，用上述的引物對(duì)和熒光飽和染料進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
3)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定病毒的基因型。
[0020]優(yōu)先的，步驟2)中的擴(kuò)增反應(yīng)體系為:
Premix Ex-Taq 5 μ I
引物 Pl 0.4μ I 引物 Ρ2 0.4μ I 模板 0.8 μ I LC green 染料 I μ I ddH20 至 10 μ I。
[0021]優(yōu)選的，步驟2)中的擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸 30s ;循環(huán) 35 次；72°C終延伸 8min ;90°C變性 lmin，30°C雜交 2min，68°C 到80°C以0.30C /步的速率進(jìn)行熔解曲線分析。 [0022]優(yōu)選的，步驟3)中所述HRM分析的具體分析過(guò)程為:
I)若HRM曲線中存在Tm值為73.48±0.10°C的曲線，說(shuō)明該樣品含有基因型為CPV_2a型的犬細(xì)小病毒；2)若HRM曲線中存在Tm值為72.94±0.05°C的曲線，說(shuō)明該樣品中含有基因型為CPV-2b或CPV-2c的犬細(xì)小病毒；
3)在上述2)種情況下，往擴(kuò)增產(chǎn)物中加入以CPV-2bDNA為模板，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2為引物的PCR產(chǎn)物后，再進(jìn)行HRM曲線分析；
a.若Tm值為72.94±0.05°C的曲線形狀不發(fā)生變化，說(shuō)明該樣品含有CPV_2b基因型犬細(xì)小病毒不含有CPV_2c型病毒；
b.若Tm值為72.94±0.05°C的曲線形狀發(fā)生變化，產(chǎn)生了雜合子曲線，說(shuō)明該樣品含有CPV-2c型犬細(xì)小病毒。
[0023]實(shí)施例1
(I)PCR-HRM 引物
經(jīng)過(guò)對(duì)所設(shè)計(jì)的大量引物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)引物堿基序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2對(duì)PCR-HRM法區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的效果最好，其堿基序列如下所示。
[0024]Pl: 5’ - CCAGAAGGAGATTGGATTCA -3’(SEQ ID NO:1)，
P2:5’ - TTAATGCAGTTAAAGGACCAT -3’( SEQ ID NO: 2 )。
[0025]其中，引物Pl在犬細(xì)小病毒VP2基因第4014~4033位點(diǎn)上，引物P2在犬細(xì)小病毒VP2基因第4138~4158位點(diǎn)上(該基因在Genbank中的登錄號(hào)為M38245 )。 [0026](2)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品的構(gòu)建及其PCR-HRM分析
I)犬細(xì)小病毒DNA的提取:
用試劑盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0提取病料樣品中的犬細(xì)小病毒DNA。病料樣品可以是全血、糞便、直腸面拭子等易于獲得且對(duì)動(dòng)物體無(wú)嚴(yán)重傷害的樣品O
[0027]2 )標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品的制備:
為了驗(yàn)證本發(fā)明方法可行性與可靠性，同時(shí)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，保存各基因型質(zhì)粒序列(經(jīng)序列測(cè)定正確)，之后擴(kuò)增保存的質(zhì)粒序列進(jìn)行HRM分析作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品的制備步驟如下:
取經(jīng)過(guò)測(cè)序確定分別為CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c基因型的犬細(xì)小病毒毒株，以Pl和P2為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化；并用TaKaRa公司的試劑盒將純化后的DNA連接至pMD_18T載體中，
載體連接反應(yīng)體系(10 μ I):
Ligallom Seliiti 纖 I 5μΙ
' 純化的 cDNA: 4.5pl
pMD-lST vector 0.5μΙ.總體和:Wpl
反應(yīng)條件:16°C，4h以上。
[0028]取_70°C凍存的感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化后，加入連接產(chǎn)物5μ1，輕輕混勻，冰浴30min。42°C水浴熱激90sec，再迅速放回冰上2min。加入400μ1 LB液體培養(yǎng)基，37°C 200r/min-220r/min振蕩培養(yǎng)45min后，以恢復(fù)質(zhì)粒的抗性。4°C 4000r/min離心5min,棄去上清400μ1，將剩余的100μΙ菌液混勻后涂氨芐平板，37°C培養(yǎng)30min (平皿正放)，待菌液吸收完全，再將平皿倒置培養(yǎng)約12h - 16h，至單菌落出現(xiàn)。用滅菌牙簽挑取單菌落于5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中12h — 16h,并用TIANprep Mini Plasmid Kit質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。
[0029]通過(guò)上述方法，分別獲得含CPV_2a、CPV_2b、CPV_2c基因型犬細(xì)小病毒的目的基因片斷的質(zhì)粒，作為后續(xù)研究的陽(yáng)性對(duì)照樣品。
[0030]3 )陽(yáng)性質(zhì)粒樣品的PCR-HRM操作步驟
分別以上述獲得的三種陽(yáng)性質(zhì)粒樣品為DNA模板，分別進(jìn)行PCR-HRM擴(kuò)增反應(yīng)和分
析；
PCR反應(yīng)體系:10μ 1:
【權(quán)利要求】
1.一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示: 引物 Pl:CCAGAAGGAGATTGGATTCA (SEQ ID NO: I)或其核苷酸互補(bǔ)序列， 引物 P2:TTAATGCAGTTAAAGGACCAT (SEQ ID NO:2)或其核苷酸互補(bǔ)序列。
2.一種快速區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒的PCR-HRM方法，其特征在于:包括以下步驟: O從樣品中提取病毒DNA ； 2)以DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)和熒光飽和染料進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物； 3)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定病毒的基因型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟2)中的擴(kuò)增反應(yīng)體系為:
Premix Ex-Taq 5 μ I 引物 Pl 0.4μ I 引物 Ρ2 0.4μ I 模板 0.8 μ I LC green 染料 I μ I ddH20 至 10 μ I。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟2)中的擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，55。。退火 30s，72。。延伸 30s ;循環(huán) 35 次；72°C終延伸 8min ;90°C變性lmin，30°C雜交2min，68°C到80°C以0.3°C /步的速率進(jìn)行熔解曲線分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述HRM分析的具體分析過(guò)程為:1)若HRM曲線中存在Tm值為73.48±0.10°C的曲線，說(shuō)明該樣品含有基因型為CPV_2a型的犬細(xì)小病毒； 2)若HRM曲線中存在Tm值為72.94±0.05°C的曲線，說(shuō)明該樣品中含有基因型為CPV-2b或CPV-2c的犬細(xì)小病毒； 3)在上述2)種情況下，往擴(kuò)增產(chǎn)物中加入以CPV-2bDNA為模板，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2為引物的PCR產(chǎn)物后，再進(jìn)行HRM曲線分析； a.若Tm值為72.94±0.05°C的曲線形狀不發(fā)生變化，說(shuō)明該樣品含有CPV_2b基因型犬細(xì)小病毒不含有CPV_2c型病毒； b.若Tm值為72.94 ± 0.05 °C的曲線形狀發(fā)生變化，產(chǎn)生了雜合子曲線，說(shuō)明該樣品含有CPV-2c型犬細(xì)小病毒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104004857SQ201410229142
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】郭鵬舉, 嘎利兵嘎, 張建峰, 劉志成, 朱余軍, 陳琴苓 申請(qǐng)人:廣州博至生物科技有限公司, 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所