一種以木薯淀粉為原料制備海藻糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種改良的酶法生產(chǎn)海藻糖的方法，引入納米二氧化硅作為酶的固定相，能夠大大縮短反應(yīng)時(shí)間和減少酶的用量，顯著降低生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種以木薯淀粉為原料制備海藻糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以木薯淀粉為原料制備海藻糖的方法，涉及到生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]海藻糖對(duì)生物體具有顯著的保護(hù)作用，海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下在細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，海藻糖成為替代白蛋白作為凍干保護(hù)劑的理想選擇，在生物技術(shù)藥物、疫苗和脂質(zhì)體的凍干制劑中具有廣闊的前景。
[0003]目前，目前海藻糖的制備方法主要有微生物抽提法、發(fā)酵法、基因重組法以及酶轉(zhuǎn)化法。生物抽提法、發(fā)酵法和基因重組法涉及復(fù)雜的生物學(xué)技術(shù)，對(duì)技術(shù)要求高，生產(chǎn)成本高，不適宜大量批量生產(chǎn)。酶轉(zhuǎn)化法是采用葡萄糖、麥芽糖或淀粉等為底物，通過(guò)與海藻糖合成有關(guān)的酶的作用轉(zhuǎn)化成海藻糖。根據(jù)其作用底物，主要分為葡萄糖、麥芽糖、淀粉為底物三種生產(chǎn)方法。該種方法成本低，非常適宜批量生產(chǎn)。目前，以淀粉為原料是有兩條途徑:第一條途徑是利用葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transfer GTase)和淀粉酶(amylase)將淀粉轉(zhuǎn)化成海藻糖；第二條途徑是利用麥芽糖苷基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)的協(xié)同作用，將一定鏈長(zhǎng)的直鏈淀粉轉(zhuǎn)化為海藻糖。
[0004]CN102965412A公開(kāi)了一種海藻糖的制備方法，它采用大米(I)為基本原料，淀粉酶⑵、海藻酶⑶為輔助材料 ，通過(guò)浸泡⑷、磨漿(5)、調(diào)漿(6)、液化(7)、壓慮⑶、糖化
(9)、脫色(10)、離交(11)、醇化(12)、色譜分離(13)、濃縮(14)、灌裝(15)、結(jié)晶分離(16)、干燥(17)、包裝(18)十五個(gè)工藝流程完成。
[0005]2000年，南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司利用此酶系成功開(kāi)發(fā)出酶法轉(zhuǎn)化木薯淀粉生產(chǎn)海藻糖的工藝，使我國(guó)成為世界上第2個(gè)酶法工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖的國(guó)家。該工藝?yán)媚臼淼矸塾搔?淀粉酶、普魯蘭酶分解為短鏈糊精后，經(jīng)MTSase和MTHase作用轉(zhuǎn)化生廣海操糖，精制后可制成含量為98.0%的食品級(jí)結(jié)晶海操糖和含量為99.0%以上的聞純度結(jié)晶海藻糖(黃日波，海藻糖一21世紀(jì)的新型糖類[Μ].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.)。
[0006]但上述現(xiàn)有技術(shù)所述制備方法反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，使用淀粉酶的量較大，使得制備海藻糖的成本增加，不利于海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，需要提供一種更為有效的酶催化制備海藻糖的生產(chǎn)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了一種基于MTSase和MTHase的協(xié)同作用，引入納米材料作為酶的固定相生產(chǎn)海藻糖的方法，能夠大大縮短反應(yīng)時(shí)間和減少酶的用量。
[0009]本發(fā)明的目的是提供一種改良的酶法生產(chǎn)海藻糖的方法，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用以下技術(shù)方案:
a、取木薯淀粉10份，加入20-50份水，80-90°C加熱使其溶解成糊狀物；b、調(diào)節(jié)步驟a物料pH為6.0-7.0，保持溫度為30_45°C，加入負(fù)載有α -淀粉酶的納米二氧化娃，攪拌2min,80Hz超聲30s后保溫10_20min得糖化液；
C、將步驟b處理過(guò)后的糖化液通過(guò)0.25 μ m的過(guò)濾膜過(guò)濾，所得糖化液用酸或堿調(diào)節(jié)PH為6.5-7.0，保持溫度為30-40°C，再加入負(fù)載有麥芽糖苷基海藻糖合成酶和麥芽糖苷基海藻糖水解酶的納米二氧化硅，攪拌lmin，80Hz超聲30s后保溫12h，再超聲30s后保溫12h ；
d、將步驟c所得的物料通過(guò)0.25 μ m的過(guò)濾膜過(guò)濾，再加入0.1-0.5份的活性炭，攪拌30min,再通過(guò)0.25 μ m的過(guò)濾膜過(guò)濾，濾液再經(jīng)裝有中空纖維超濾膜的超濾器超濾；
e、將步驟d所得濾液在真空壓為-0.085Mpa，溫度為35°C的條件下，濃縮至含水量為10%~20%，結(jié)晶，離心即得。
[0010]本發(fā)明技術(shù)方案中，步驟a所得淀粉糊狀溶液，淀粉的含量為20%_50%，現(xiàn)有技術(shù)中，酶法制海藻糖的淀粉溶液質(zhì)量濃度一般為10%，濃度高高，淀粉的轉(zhuǎn)化率下降。而本發(fā)明通過(guò)后續(xù)的工藝步驟，提高原液淀粉的質(zhì)量濃度，轉(zhuǎn)化率并沒(méi)有明顯下降，因此在同等生產(chǎn)條件下，單次的生產(chǎn)量提高2-5倍。
[0011]本發(fā)明技術(shù)方案中，步驟b所述的負(fù)載有α-淀粉酶的納米二氧化硅是通過(guò)以下步驟制得:取平均粒徑為500-600nm的二氧化硅用0.01mol/L的pH 7.4的PBS溶液分散，再加入5mg/mL的α -淀粉酶溶液，二氧化硅與α -淀粉酶的質(zhì)量比為2:1，IOOHz的超聲30S分散，于4°C搖床上震蕩24h，離心后傾去上清液、底物30°C真空干燥即得。
[0012]步驟b所述的負(fù)載有α -淀粉酶的納米二氧化硅的加入量為木薯淀粉質(zhì)量的0.05-0.1%。
[0013]步驟c所述的負(fù)載有麥芽糖苷基海藻糖合成酶和麥芽糖苷基海藻糖水解酶的納米二氧化硅是通過(guò)以下步驟制得:取平均粒徑為500-600nm的二氧化硅用0.01mol/L的pH
7.4的PBS溶液分散，再加入3mg/mL的麥芽糖苷基海藻糖合成酶和2mg/mL麥芽糖苷基海藻糖水解酶，二氧化硅、麥芽糖苷基海藻糖合成酶和麥芽糖苷基海藻糖水解酶的質(zhì)量比為10:3:2, IOOHz的超聲30 S分散，于4°C搖床上震蕩36h，離心后傾去上清液、底物30°C真空干燥即得。
[0014]步驟c所述的負(fù)載有麥芽糖苷基海藻糖合成酶和麥芽糖苷基海藻糖水解酶的納米二氧化硅得加入量為木薯淀粉質(zhì)量的0.2-0.3%。
[0015]步驟d所述的中空纖維超濾膜的分子截留范圍為5000 10000。
[0016]步驟d所述的溶液在超濾器中的線速度控制在lm/s 3m/s。
[0017]本發(fā)明提供的一種木薯片發(fā)酵制備乙醇的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于:
(I)同等生產(chǎn)條件下，單次生產(chǎn)量提高2-5倍。
[0018](2)固定有酶的納米二氧化硅體系，使用后用純化水清洗再真空干燥處理，可多次重復(fù)利用，大大減少酶的使用量。此外，引入納米二氧化硅，使酶在高濃度的淀粉液中懸浮，增加酶與淀粉的可及性。
[0019](3)酶解過(guò)程中，使用超聲方式，能夠增加酶與底物的接觸，提高酶的活性，減少反應(yīng)時(shí)間。
[0020](4)本工藝生產(chǎn)的海藻糖符合《歐洲藥典》7.0版標(biāo)準(zhǔn)要求?！揪唧w實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明以及創(chuàng)新之處。應(yīng)當(dāng)理解，所列出的實(shí)施例僅用于具體說(shuō)明本發(fā)明而非對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員在充分理解之后可以對(duì)實(shí)施例進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，這些仍然在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0022]實(shí)施例1
負(fù)載有α -淀粉酶的納米二氧化娃:取平均粒徑為540nm的二氧化娃用0.01mol/L的PH 7.4的PBS溶液分散，再加入5mg/mL的α -淀粉酶溶液，二氧化硅與α-淀粉酶的質(zhì)量比為2:1，IOOHz的超聲30 S分散，于4°C搖床上震蕩24h，離心后傾去上清液、底物30°C真空干燥即得。
[0023]實(shí)施例2
負(fù)載有MTSave和MTHase的納米二氧化硅:取平均粒徑為540nm的二氧化硅用
0.01mol/L的pH 7.4的PBS溶液分散，再加入3mg/mL的麥芽糖苷基海藻糖合成酶和2mg/mL麥芽糖苷基海藻糖水解酶，二氧化硅、麥芽糖苷基海藻糖合成酶和麥芽糖苷基海藻糖水解酶的質(zhì)量比為10:3:2，IOOHz的超聲30 S分散，于4°C搖床上震蕩36h，離心后傾去上清液、底物30°C真空干燥即得。
[0024]實(shí)施例3
負(fù)載有α -淀粉酶的納米二氧化硅:取平均粒徑為I μ m的二氧化硅，其余同實(shí)施I。
[0025]實(shí)施例4
負(fù)載有MTSave和MTHase的納米二氧化硅:取平均粒徑為I μ m的二氧化硅，其余同實(shí)施2。
[0026]實(shí)施例5
取木薯淀粉100kg，加入280kg水，85°C加熱使其溶解成糊狀物，加入硫酸調(diào)節(jié)pH到
6.8，保持溫度為40°C，加入80g實(shí)施例1制得的負(fù)載酶的納米二氧化硅，攪拌2min，80Hz超聲30s后保溫12min得糖化液，將糖化液通過(guò)0.25 μ m的過(guò)濾膜過(guò)濾，所得糖化液用硫酸調(diào)節(jié)pH為6.5，保持溫度為38°C，再加入260g實(shí)施例2所得的負(fù)載酶的納米二氧化硅，攪拌lmin, 80Hz超聲30s后保溫12h，再超聲30s后保溫12h ;所得的物料通過(guò)0.25 μ m的過(guò)濾膜過(guò)濾，再加入1.2kg的活性炭，攪拌30min，再通過(guò)0.25 μ m的過(guò)濾膜過(guò)濾，濾液再經(jīng)裝有分子截留范圍為5000 10000中空纖維超濾膜的超濾器超濾；濾液在真空壓為-0.085Mpa,溫度為35°C的條件下，濃縮至含水量為18%，冷卻結(jié)晶，離心得海藻糖，干燥后得海藻糖46.2kg，含量為 99.52%，產(chǎn)率為:(46.2kgX99.52%) +IOOkg= 45.98%。產(chǎn)品符合《歐洲藥典》7.0版標(biāo)準(zhǔn)要求實(shí)施例6
負(fù)載有α -淀粉酶的納米二氧化硅由實(shí)施例3制得。負(fù)載有MTSave和MTHase的納米二氧化硅由實(shí)施例4制得。其余條件同實(shí)施例5。最終得海藻糖38.1kg，含量為99.27%，產(chǎn)率為:(38.1kgX 99.27%) +IOOkg= 37.82%。產(chǎn)品符合《歐洲藥典》7.0版標(biāo)準(zhǔn)要求實(shí)施例7
超聲頻率為100Hz，其余同實(shí)施例5，最終得海藻糖42.2kg，含量為99.34%，產(chǎn)率為:(42.2kgX 99.34%) +IOOkg= 41.92%。產(chǎn)品符合《歐洲藥典》7.0版標(biāo)準(zhǔn)要求實(shí)施例8不使用納米二氧化硅固載酶，直接使用同實(shí)施例5等量的α-淀粉酶、MTSave和MTHase，其余條件同實(shí)施例5，最終得海藻糖31.5kg，含量為99.28%，產(chǎn)率為:(31.5kgX99.28%) +IOOkg= 31.27%。產(chǎn)品符合《歐洲藥典》7.0版標(biāo)準(zhǔn)要求。
[0027]實(shí)施例9
取實(shí)施例1、實(shí)施例2得到的負(fù)載催化劑，依照實(shí)施例5所述的方法生產(chǎn)海藻糖，得海藻糖 45.8kg，含量為 99.51%，產(chǎn)率為:(45.8kgX99.51%) +IOOkg= 45.57%.反應(yīng)結(jié)束后分別回收負(fù)載催 化劑并使用純化水清洗、真空干燥，再如實(shí)施例5所述的方法反復(fù)使用10次，第10次反應(yīng)得到海藻糖43.9kg，含量為99.48%，產(chǎn)率為:(45.8kgX 99.51%) +IOOkg=43.67%。產(chǎn)品符合《歐洲藥典》7.0版標(biāo)準(zhǔn)要求。
【權(quán)利要求】
1.一種以木薯淀粉為原料制備藥用海藻糖的方法，其特征在于: a、取木薯淀粉10份，加入20-50份水，80-90°C加熱使其溶解成糊狀物； b、調(diào)節(jié)步驟a物料pH為6.0-7.0，保持溫度為30_45°C，加入負(fù)載有α -淀粉酶的納米二氧化娃，攪拌2min,80Hz超聲30s后保溫10_20min得糖化液； C、將步驟b處理過(guò)后的糖化液通過(guò)0.25 μ m的過(guò)濾膜過(guò)濾，所得糖化液用酸或堿調(diào)節(jié)PH為6.5-7.0，保持溫度為30-40°C，再加入負(fù)載有麥芽糖苷基海藻糖合成酶和麥芽糖苷基海藻糖水解酶的納米二氧化硅，攪拌lmin，80Hz超聲30s后保溫12h，再超聲30s后保溫12h ； d、將步驟c所得的物料通過(guò)0.25 μ m的過(guò)濾膜過(guò)濾，再加入0.1-0.5份的活性炭，攪拌30min,再通過(guò)0.25 μ m的過(guò)濾膜過(guò)濾，濾液再經(jīng)裝有中空纖維超濾膜的超濾器超濾； e、將步驟d所得濾液在真空壓為-0.085Mpa，溫度為35°C的條件下，濃縮至含水量為10%~20%，結(jié)晶，離心即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以木薯淀粉為原料制備藥用海藻糖的方法，其特征在于步驟b所述的負(fù)載有α-淀粉酶的納米二氧化硅是通過(guò)以下步驟制得:取平均粒徑為500-600nm的二氧化娃用0.01mol/L的pH 7.4的PBS溶液分散，再加入5mg/mL的α -淀粉酶溶液，二氧化硅與α-淀粉酶的質(zhì)量比為2:1，IOOHz的超聲30 S分散，于4°C搖床上震蕩24h，離心后傾去上清液、底物30°C真空干燥即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以木薯淀粉為原料制備藥用海藻糖的方法，其特征在于步驟b所述的負(fù)載有α -淀粉酶的納米二氧化硅的加入量為木薯淀粉質(zhì)量的0.05-0.1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以木薯淀粉為原料制備藥用海藻糖的方法，其特征在于步驟c所述的負(fù)載有麥芽糖苷基海藻糖合成酶和麥芽糖苷基海藻糖水解酶的納米二氧化硅是通過(guò)以下步驟制得:取平均粒徑為500-600nm的二氧化硅用0.01mol/L的pH 7.4的PBS溶液分散，再加入3mg/mL的麥芽糖苷基海藻糖合成酶和2mg/mL麥芽糖苷基海藻糖水解酶，二氧化硅、麥芽糖苷基海藻糖合成酶和麥芽糖苷基海藻糖水解酶的質(zhì)量比為10:3:2，IOOHz的超聲30 S分散，于4°C搖床上震蕩36h，離心后傾去上清液、底物30°C真空干燥即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以木薯淀粉為原料制備藥用海藻糖的方法，其特征在于步驟c所述的負(fù)載有麥芽糖苷基海藻糖合成酶和麥芽糖苷基海藻糖水解酶的納米二氧化硅得加入量為木薯淀粉質(zhì)量的0.2-0.3%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以木薯淀粉為原料制備藥用海藻糖的方法，其特征在于，步驟d所述的中空纖維超濾膜的分子截留范圍為5000 10000。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以木薯淀粉為原料制備藥用海藻糖的方法，其特征在于，步驟d所述的溶液在超濾器中的線速度控制在lm/s 3m/s。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以木薯淀粉為原料制備藥用海藻糖的方法，其特征在于，步驟b所述的負(fù)載有α -淀粉酶的納米二氧化硅，步驟c所述的負(fù)載有麥芽糖苷基海藻糖合成酶和麥芽糖苷基海藻糖水解酶的納米二氧化硅，按照權(quán)利要求1所述工藝使用后，用純化水清洗后30°C真空干燥處理可重復(fù)利用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的藥用海藻糖在制備凍干保護(hù)劑中的用途。
【文檔編號(hào)】C12P19/14GK103981233SQ201410233198
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】帥放文, 王向峰, 章家偉 申請(qǐng)人:湖南爾康制藥股份有限公司