適度表達(dá)新型枯草芽孢桿菌nadh氧化酶高效發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻的制作方法
【專利摘要】適度表達(dá)新型枯草芽孢桿菌NADH氧化酶高效發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻，屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過本實驗室自主篩選的具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)乙偶姻菌株B.subtilis?JNA基因組中首次發(fā)現(xiàn)新型NADH氧化酶，在確定該酶酶學(xué)性質(zhì)的同時，通過適度表達(dá)載體pMA5-PbdhA，將NADH氧化酶在bdhA基因缺失型枯草芽孢桿菌中進行表達(dá)，最終利用代謝工程改造后的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻，獲得約56.7g/L乙偶姻和1.2g/L2，3-丁二醇，2，3-丁二醇、乳酸和乙酸分別減少約92.3％、70.1％和75.0％，乙偶姻生產(chǎn)效率上升到0.68g/(L·h)，較原始菌株發(fā)酵周期縮短1.7倍。為國內(nèi)外首次在枯草芽孢桿菌中利用NADH調(diào)控生產(chǎn)乙偶姻，實現(xiàn)了縮短發(fā)酵周期、減少NADH依賴型副產(chǎn)物的目的。
【專利說明】適度表達(dá)新型枯草芽孢桿菌NADH氧化酶高效發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]利用適度表達(dá)新型NADH氧化酶減少NADH依賴型副產(chǎn)物提高乙偶姻產(chǎn)量，本發(fā)明屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。具體涉及一種新型NADH氧化酶的篩選、基因工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵生產(chǎn)。
技術(shù)背景
[0002]乙偶姻天然存在于玉米、葡萄、可可、蘋果、香蕉、干酪、肉類等許多食品中。是一種應(yīng)用廣泛、令人喜愛的食用香料，具有強烈的奶油、脂肪、白脫樣香氣，高度稀釋后有令人愉快的奶香氣，因此乙偶姻主要用于配置奶香型、肉香型、草莓香型的香精，或直接用于奶制品。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-86明確規(guī)定其為允許使用的食品級香料，美國食品和萃取協(xié)會(FEMA)安全號為2008。
[0003]目前，傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)成為我國現(xiàn)階段食用香料行業(yè)的研究熱點。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)香料的基本原理是:通過微生物的自身代謝和微生物生長過程中產(chǎn)生的酶進行的催化作用，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，使各種有機物轉(zhuǎn)化為多種具有芳香氣味的化合物。目前國內(nèi)外研究表明某些細(xì)菌具有生產(chǎn)乙偶姻的能力，主要包括克雷伯氏菌屬(Klebisella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)以及乳球菌屬(Lactococcus)等。但是在大多數(shù)菌株代謝過程中，乙偶姻是作為2，3-丁二醇和丁二酮代謝的副產(chǎn)物而存在的，積累濃度較低，從而直接導(dǎo)致了難以利用這些微生物菌種工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻。深入的研究。 [0004]本實驗室保藏有一株以葡萄糖為底物高產(chǎn)乙偶姻的枯草芽孢桿菌B.subtilisJNA (保藏號CCTCC M209309 ;專利申請公布號CN101864381A)，在研究中發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵過程會形成部分NADH依賴型副產(chǎn)物，如乳酸、乙醇及2，3- 丁二醇，導(dǎo)致乙偶姻產(chǎn)量無法進一步提高，因此考慮通過降低胞內(nèi)NADH水平來減少這些副產(chǎn)物的生成。NADH氧化酶(Ν0Χ，ECl.6.99.3)可以催化NADH形成NAD+，因此該酶被廣泛的應(yīng)用到NADH依賴型代謝途徑流量的重排上面。但是目前為止，關(guān)于枯草芽孢桿菌中NOX的研究還未見報道。
[0005]本發(fā)明首次報道了來自于自枯草芽孢桿菌的新型NADH氧化酶，在確定該酶相關(guān)性質(zhì)的同時，通過本實驗室構(gòu)建的枯草芽孢桿菌適度表達(dá)載體pMA5-PbdhA (專利申請公布號CN102876703A)，將NADH氧化酶在bdhA基因缺失型菌株中進行表達(dá)。在bdhA基因缺失型菌株中，利用適度表達(dá)新型NADH氧化酶,達(dá)到縮短發(fā)酵周期,減少NADH依賴型副產(chǎn)物的目的，最終實現(xiàn)適度表達(dá)NOX的工程菌株高效生產(chǎn)乙偶姻。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所使用的原始菌種為B.subtilis JNA，該菌株前期發(fā)酵葡萄糖合成2，3-丁二醇，后期逆向轉(zhuǎn)化為乙偶姻，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國武漢，武漢大學(xué)；保藏編號為:CTCCM209309。[0007]本發(fā)明的主要研究內(nèi)容:本發(fā)明利用分子技術(shù)克隆了來自枯草芽孢桿菌的4個假定的NADH氧化酶(簡稱Ν0Χ)，構(gòu)建重組表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)化至B.subtilis JNA,通過酶活力測定及相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)鑒定，確定來源枯草芽孢桿菌的yodC基因為編碼形成水的NADH氧化酶。構(gòu)建適度表達(dá)載體pMA5-PbdhA-yodC，并將其轉(zhuǎn)化至bdhA基因缺失型B.subtilis JNA,成功構(gòu)建了適度表達(dá)NOX的工程菌株。最終，利用在bdhA基因缺失型菌株中適度表達(dá)NADH氧化酶發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻，將150g/L葡萄糖轉(zhuǎn)化約為56.7g/L的乙偶姻和1.2g/L的2，3-丁二醇，2，3-丁二醇、乳酸和乙酸分別減少92.3%、70.1%和75.0%，乙偶姻生產(chǎn)效率上升到0.68g/(L.h)，較原始菌株B.subtilis JNA發(fā)酵周期縮短1.7倍。
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
[0009](I)本發(fā)明首次報道了來自枯草芽孢桿菌的新型NADH氧化酶，并確定了該酶酶學(xué)相關(guān)性質(zhì)，為枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻減少NADH依賴型副產(chǎn)物提供了一定的理論可倉泛。
[0010](2)本發(fā)明通過在bdhA基因缺失型菌株中適度表達(dá)NADH氧化酶，實現(xiàn)高效生產(chǎn)乙偶姻的方法，最終適度表達(dá)NADH氧化酶的工程菌株將150g/L葡萄糖轉(zhuǎn)化為約56.7g/L的乙偶姻和1.2g/L的2，3- 丁二醇，2，3- 丁二醇、乳酸和乙酸分別減少約92.3%、70.I %和75.0%，乙偶姻生產(chǎn)效率上升到約0.68g/(L.h)，較原始菌株B.subtilis JNA發(fā)酵周期縮短1.7倍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1質(zhì)粒T-bdhA::cat構(gòu)建示意圖。
[0012]圖2SDS-PAGE 驗證 NADH 酶在 B.subtilis JNA 中純化。
[0013]M,蛋白 Marker ；1, B.subtilis JNA ;2, B.subtilis JNA/pMA5-yodC 粗酶液；3，B.subtilis JNA/pMA5粗酶液；4_8，不同咪唑濃度下洗脫的NOX純酶，其中咪唑濃度依次為Ommol /T,, 20mmol/L, SOmmoI /T,, 100mmol/L, 300mmol/L
[0014]圖3N0X的表達(dá)對胞內(nèi)NADH和NAD+含量及其比例的影響。
[0015]BM，bdhA 基因缺失的 B.subtilis JNA ;BMNQ，BM/pMA5_Pbdh4-yodC ;BMN ;BM/pMA5-yodC
【具體實施方式】
[0016]實施例1:利用基因工程手段構(gòu)建bdhA基因缺失型菌株
[0017]構(gòu)建報告基因插入失活的bdhA基因片段，利用引物Pl和P2從pBGSC6質(zhì)粒上克隆得到cat基因的完整表達(dá)基因片段，然后利用ECOR47III處理膠回收的片段，最后用堿性磷酸酶處理該基因片段并與經(jīng)過同樣處理后的T-bdhA連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在氨芐青霉素和氯霉素雙抗性平板上篩選陽性克隆。將構(gòu)建好的T-bdhA::cat轉(zhuǎn)化B.subtilisJNA,在氯霉素平板上篩選得到bdhA基因缺失的重組菌株，經(jīng)菌落PCR及酶活力驗證實驗，確認(rèn)bdhA基因是否被成功插入失活。
[0018]Pl:5’ -CGCAGCGCTAAAAAAGGATTGATTCTAATG-3’ (Eco47III)
[0019] P2:5， -CGCAGCGCTTAGTGACATTAGAAAACCGAC-3， (Eco47III)
[0020]結(jié)果表明，菌落PCR及酶活力驗證正確，且下游副產(chǎn)物2，3- 丁二醇產(chǎn)量顯著降低，成功獲得bdhA基因缺失型菌株。
[0021 ] 實施例2 =NADH氧化酶引物設(shè)計
[0022]首先，以菌株B.subtilis JNA的染色體DNA為模板，利用引物P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10，通過PCR技術(shù)分別擴增得到一段的ydfN，ydgl，yodC和yfhC基因，將純化后的ydfN，ydgl, yodC和yfhC基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI和BamHI消化后，與同樣經(jīng)過上述兩種限制性內(nèi)切酶消化的質(zhì)粒PMA5連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA5-bdhA，在T4DNA連接酶的作用下16°C過夜連接，將連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)E.coli JM109中，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證并確認(rèn)重組質(zhì)粒pMA5_ydfN, pMA5-ydgI, pMA5_yodC和pMA5-yfhC構(gòu)建成功。經(jīng)雙酶切驗證后，表明該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒A5-ydfN，pMA5-ydgI, pMA5-yodC和pMA5_yfhC以化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至B.subtiIis JNA,挑取陽性轉(zhuǎn)化子，即得到重組枯草芽抱桿菌 B.subti I i s JNA/pMA5-ydfN> B.subtilis JNA/pMA5-ydgI>B.subtilis JNA/pMA5-yodC 和 B.subtilis JNA/pMA5-yfhC?
[0023]以B.subtilis JNA基因組總DNA為模板，設(shè)計八條引物，PCR擴增引物設(shè)計如下:
[0024]P3:5， -ACCGGGATCCATGGCTGAATTTACTCAT-3’ (BamHI)
[0025]P4:5，-ACCGAC GCGTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATATACTCAACAAAC-3’ (MluI)
[0026]P5:5， -ACCGGGATCCATGATCAAAACAAACGAT-3> (BamHI)
[0027]P6:5， -ACCGACGCGTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTCCATTCTGCAAT-3> (MluI)
[0028]P7:5， -ACCGGGATCCATGACGAATACTCTGGAT-3> (BamHI)
[0029]P8:5， -ACCGACGCGTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAGCCAAGTTGATAC-3’ (MluI)
[0030]P9:5， -ACCGGGATCCATGCCTCAAACCGAACAA-3> (BamHI)
[0031]PlO:5’ -ACCGACGCGTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATTTCAGTGAATCG-3’ (MluI)
[0032]實施例3 =NADH氧化酶活力測定
[0033]將實施例4 構(gòu)建的重組菌 B.subtilis JNA/pMA5-ydfN, B.subtilis JNA/pMA5-ydgI, B.subtilis JNA/pMA5-yodC 和 B.subtilis JNA/pMA5-yfhC,與出發(fā)菌株B.subtilis JNA分別接種于IOmL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日按4%的接種量轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，取發(fā)酵液于4°C，10000r/min離心10min，pH7.0的磷酸鈉緩沖液清洗3次，細(xì)胞重懸于pH6.5磷酸鈉緩沖液中，隨后將該液體置于超聲波破碎儀下處理細(xì)胞20min，15000r.mirT1離心30min，上清即為粗酶液。將20 μ I粗酶液加入到酶活測定緩沖體系中立即檢測A34tl吸光值的變化。
[0034]NADH氧化酶活力測定:酶反應(yīng)體系為lmL，含有50mmol/L磷酸鉀(ρΗ7.0)，0.3mmol/L EDTA, 50 μ mol/L FAD和0.3mmol/L β -NADH ;酶促反應(yīng)在加入一定量的酶液后立即開始，酶活力單位(IU)定義為在25°C條件下，每分鐘氧化Iymol的NADH所需的酶量。
[0035]結(jié)果表明重組菌B.subtilis JNA/pMA5_yodC表達(dá)的NADH氧化酶比酶活為9.65U/mg,比出發(fā)菌株B.subtilis JNA的NADH氧化酶比酶活提高了 12倍，其余重組菌株與出發(fā)菌株B.subtilis JNA相比無明顯提高，表明yodC基因可能為枯草芽孢桿菌中的NOX編碼基因。
[0036]實施例4 =NADH氧化酶酶學(xué)性質(zhì)分析
[0037](I)催化類型鑒定
[0038]NADH氧化酶有三種催化類型，在反應(yīng)體系中除了會生成產(chǎn)物NAD+，還會生成水、過氧化氫或者超氧化物等。通過在標(biāo)準(zhǔn)的NADH氧化酶酶促反應(yīng)液中檢測是否生成水、過氧化氫或者超氧化物確定該酶的催化類型。其中過氧化氫檢測利用H2O2測試條比較過氧化物標(biāo)準(zhǔn)顏色定性是否生成H2O2，超氧化物通過檢測A55tl下細(xì)胞色素C的減少變化定性是否生成超氧化物。結(jié)果表明，反應(yīng)過程未檢測出過氧化氫或者超氧化物，間接表明該酶是形成水的NADH氧化酶。
[0039](2)最適pH的研究
[0040]配制不同pH梯度的緩沖液(pH4.5-5.5:50mM醋酸鈉-乙酸緩沖液；ρΗ5.5-9.0:50mM磷酸鈉緩沖液；pH9.0-10.5:50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，每(λ 5pH為一個梯度)，與 0.3mmol/L EDTA, 50 μ mol/L FAD 和 0.3mmol/L β -NADH 混合，取 2mL 不同 pH 底物緩沖液與20 μ L酶液進行反應(yīng)，測定不同pH條件下的酶相對活力，并進行比較。結(jié)果表明，該酶的最適pH為9.0，中性偏堿的環(huán)境較適合該酶的催化，酸性或強堿環(huán)境下酶活力迅速下降。[0041 ] (3)酶的pH穩(wěn)定性的研究
[0042]配制不同pH梯度的緩沖液(pH4.5-5.5:50mM醋酸鈉-乙酸緩沖液；ρΗ5.5-9.0:50mM磷酸鈉緩沖液；pH9.0-10.5:50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，每(λ 5pH為一個梯度)。將酶存放于不同PH環(huán)境中，每隔一定時間取樣，測定該酶的pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在中性pH環(huán)境范圍(ρΗ6.0~8.0)，該酶較穩(wěn)定。
[0043](4)最適溫度的研究 [0044]設(shè)置反應(yīng)溫度(25°C_65°C，每5°C為一個梯度)測定不同溫度條件下酶活力，確定該酶反應(yīng)最適溫度。結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為35°C。
[0045](5)熱穩(wěn)定性研究
[0046]將酶液分別存放在-20°C、0°C、200C>30°C、40°C、50°C、60°C環(huán)境下，每隔 Ih 取
樣，測定不同溫度下酶的剩余活力，從而研究該酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在-20°C環(huán)境下該酶最穩(wěn)定，隨著溫度的升高，酶的穩(wěn)定性逐步減弱，到60°C時相對酶活力已經(jīng)小于10%。
[0047](6)不同金屬離子、EDTA及奎寧對酶活的影響
[0048]以不加金屬離子的反應(yīng)體系為對照，分別在反應(yīng)體系中加入終濃度為ImM和IOmM的 Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Na+、K+、Fe2+、Fe3+ 離子、EDTA 以及奎寧，研究各金屬離子及 EDTA對酶活力的影響。結(jié)果表明，這些離子及EDTA對該酶沒有明顯的抑制或者促進作用，表明該酶的催化中心不需要金屬離子，而在奎寧存在的情況下，該酶完全失活，間接的表明該酶屬于黃素蛋白家族。
[0049](7)酶的動力學(xué)參數(shù)
[0050]分別在pH9.0和35°C條件下，分別通過改變NADH的底物反應(yīng)體系終濃度，測定酶活力，考察酶反應(yīng)速率。通過非線性最小二乘回歸方法獲得NADH的Kn^PVmaxtl結(jié)果表明，NADH 的 Km 為 0.36mmol/L, Vmax 為 19.8 μ mol/L.min。
[0051]實施例5:構(gòu)建適度表達(dá)NADH氧化酶的bdhA基因缺失型重組菌株
[0052]利用引物P11/P12從枯草芽孢桿菌JNA中引物克隆得到y(tǒng)odC基因，利用適度啟動子PbdhA (專利申請公布號CN102876703A)將NOX在bdhA基因缺失型菌株中進行表達(dá)，最終獲得重組菌株適度表達(dá)NADH氧化酶的重組菌株，結(jié)果表明，適度表達(dá)NOX使胞內(nèi)的NADH水平下降約21.5%, NADH/NAD+比例下降超過37.9%，但對細(xì)胞的生長和糖耗速率影響較小，并且該策略大大提高了發(fā)酵前期的葡萄糖比消耗速率，最終使得該菌在84h就消耗了 150g/L的葡萄糖，因此該策略適合于用來調(diào)節(jié)NADH依賴型發(fā)酵產(chǎn)物的代謝流。
[0053]Pll:5’ -ACCGGGTACCATGACGAATACTCTGGAT-3> (KpNI)
[0054]P12:5’ -ACCGAAGCTTTTACAGCCAAGTTGATAC-3> (Hind III)
[0055]實施例6:適度表達(dá)NOX的工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻、2，3_丁二醇及副產(chǎn)物性能檢測
[0056]適度表達(dá)NOX的工程菌株接種于IOmL LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)7_9h后，各取Iml轉(zhuǎn)接于3瓶50ml含40g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至0D_ =
5.0-6.0時，加入至含1.85L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵反應(yīng)器中進行發(fā)酵，控制發(fā)酵初始pH分別為6.0、6.5及7.0,確定最適生長pH為6.5后，在生長最優(yōu)條件pH6.5條件下發(fā)酵48h后，提高pH至7.5，8.0和8.5繼續(xù)發(fā)酵，每12h取樣一次，檢測發(fā)酵生長情況、糖耗速率、乙偶姻、2，3- 丁二醇及副產(chǎn)物產(chǎn)量。
[0057]枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:牛肉浸膏5g/L,玉米衆(zhòng)6g/L,尿素2g/L,葡萄糖150g/L0 調(diào)節(jié) pH6.5。
[0058]結(jié)果表明，適度表達(dá)NADH氧化酶不僅促進了糖酵解的進行還降低了發(fā)酵過程中NADH依賴型副產(chǎn)物2，3_ 丁二醇、乳酸和乙醇的產(chǎn)量，促進了乙偶姻的合成。最終適度表達(dá)NOX的工程菌株利用150g/L葡萄糖發(fā)酵84h得到了 56.7g/L的乙偶姻和1.2g/L的2，3- 丁二醇，2，3-丁二醇、乳酸和乙酸分別減少92.3%、70.1%和75.0%，乙偶姻生產(chǎn)效率上升到 0.68g/(L.h)，較原始菌株重組菌B.subtilis JNA發(fā)酵周期縮短1.7倍。
【權(quán)利要求】
1.一種bdhA基因缺失型枯草芽孢桿菌(B.subtilis),其特征在于:從pBGSC6質(zhì)粒上克隆得到cat基因的完整表達(dá)基因片段，利用堿性磷酸酶處理該基因片段并與經(jīng)過同樣處理后的T-bdhA連接，構(gòu)建SEQ ID NO:1所示的因報告基因插入而失活的bdhA基因片段，然后將構(gòu)建好的T-bdhA::cat轉(zhuǎn)化至保藏編號為CCTCC NO:M209309的枯草芽孢桿菌B.subtilis JNA中，篩選獲得一種bdhA基因缺失型枯草芽孢桿菌。
2.一種新型枯草芽孢桿菌NADH氧化酶，其特征在于:將SEQ ID NO:2所示的NADH氧化酶基因yodC克隆到表達(dá)穿梭載體pMA5構(gòu)建成為重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMA5-yodC并轉(zhuǎn)化至保藏編號為CCTCC NO:M209309的枯草芽孢桿菌B.subtilis JNA中，經(jīng)酶活力測定及相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)鑒定，確定yodC即為編碼枯草芽孢桿菌形成水的NADH氧化酶基因。
3.一種適度表達(dá)NADH氧化酶的bdhA基因缺失型重組枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，其特征在于^fSEQ ID NO:2所示的NADH氧化酶基因yodC克隆到適度表達(dá)穿梭載體pMA5-PbdM構(gòu)建成為重組穿 梭表達(dá)質(zhì)粒pMA5-PbdM-yodC并轉(zhuǎn)化至權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌中，構(gòu)建適度表達(dá)NADH氧化酶的bdhA基因缺失型菌株。
4.權(quán)利要求3所述的菌株在發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻中的應(yīng)用，其特征是:最終將150g/L葡萄糖轉(zhuǎn)化約為56.7g/L的乙偶姻和1.2g/L的2，3-丁二醇，2，3-丁二醇、乳酸和乙酸分別減少.92.3%,70.1%和75.0%，乙偶姻生產(chǎn)效率上升到0.68g/(L.h)，較原始菌株B.subtilisJNA發(fā)酵周期縮短1.7倍。為國內(nèi)外首次在枯草芽孢桿菌中利用NADH調(diào)控生產(chǎn)乙偶姻，實現(xiàn)了縮短發(fā)酵周期、減少NADH依賴型副產(chǎn)物的目的。
【文檔編號】C12R1/125GK104017758SQ201410249907
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】饒志明, 張顯, 包騰, 趙曉靜, 楊套偉, 徐美娟 申請人:江南大學(xué)