一種與山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子標(biāo)記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種與山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用。本發(fā)明的遺傳標(biāo)記是從山羊SKIP基因中克隆得到如序列表SEQID?NO：1所示的與山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)的基因片段，序列長(zhǎng)度為680bp，在序列表SEQ?ID?NO：1所示序列的413bp處有一個(gè)等位基因突變(堿基替換)，該突變導(dǎo)致Bg1I-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開(kāi)了該遺傳標(biāo)記的制備方法及其在山羊生長(zhǎng)性狀多態(tài)性檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的遺傳標(biāo)記可應(yīng)用于山羊的標(biāo)記輔助選擇上。
【專利說(shuō)明】一種與山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物分子標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種與山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用。該遺傳標(biāo)記克隆自一個(gè)SKIP的基因片段。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，羊肉的需求量逐年增加。相比于商品豬生產(chǎn)而言，本地山羊普遍存在個(gè)體小、生長(zhǎng)速度慢、屠宰率低等缺點(diǎn)。研究培育符合現(xiàn)代市場(chǎng)所需的生長(zhǎng)速度快且具有地方風(fēng)味的綠色山羊新品種，并建立高效的育種技術(shù)體系，成為肉羊產(chǎn)業(yè)的新趨勢(shì)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將分子標(biāo)記輔助選擇與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合已經(jīng)是目前畜禽遺傳改良工程所采取的主要方法之一。因此尋找與山羊生長(zhǎng)性狀基因座相連鎖的分子遺傳標(biāo)記，應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇培育肉羊新品種，是當(dāng)前和今后一段時(shí)間山羊分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和急需解決的問(wèn)題。
[0003]SKIP (骨骼肌和腎臟富含的5 '肌醇磷酸酶)基因由Ijuin等(2000)首先發(fā)現(xiàn)并分離，它在各組織中廣泛表達(dá)，尤其在心臟，骨骼肌和腎臟中高表達(dá)(Ijuin,T.,et al., Identification and characterization of a novel inositolpolyphosphate5-phosphatase.Journal of Biological Chemistry, 2000.275 (15):10870-10875.)。SKIP被鑒定為通過(guò)水解PI (3，4，5)P3為PI (3，4)P2而調(diào)控胰島素信號(hào)的 5’ -脂質(zhì)憐酸酶(I juin, T.and T.Takenawa, SKIP negatively regulatesinsulin-1nduced GLUT4translocation and membrane ruffle formation.Mol CellBiol, 2003.23 (4): 1209-1220.)。PI (3，4，5) P3 的下游 Akt 信號(hào)在成肌分化進(jìn)程中有重要作用:可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中Gl — S期的進(jìn)展(Boonstra, J., Identification ofa restriction point at the M/Gltransition during the ongoing cell cycle.AdvEnzyme Regul, 2007.47:208-221.),控制著肌細(xì)胞分化早期myogenin的表達(dá)，肌管的成熟(Rotwein,P.and E.M.Wilson, Distinct actions of Aktland Akt2in skeletalmuscle differentiation.J Cell Physiol, 2009.219(2):503-511.)等。另 Akt 的下游祀標(biāo)mTOR對(duì)成肌分化的起始也很重要(Hribal, M.L., et al., Regulation ofinsulin-like growth factor - dependent myoblast differentiation by Foxo forkheadtranscription factors.J Cell Biol, 2003.162(4):535-541.)。超表達(dá) SKIP 基因抑制了成肌細(xì)胞中促分化因子IGF2表達(dá)及P13K-AKT信號(hào)的報(bào)道進(jìn)一步說(shuō)明SKIP參與了骨豁肌細(xì)胞的成肌分化(I juin, T.and T.Takenawa, Role of phosphatidyl inositol3，4，5-trisphosphate(PIP3)5-phosphatase skeletal muscle-and kidney-enrichedinositol polyphosphate phosphatase (SKIP)in myoblast differentiation.J BiolChem, 2012.287(37):31330-31341.)。多物種的報(bào)道均顯示肌肉特異性基因SKIP與肌纖維發(fā)育密切相關(guān)。SKIP基因雜合突變小鼠比目魚(yú)肌和股四頭肌的重量顯著提高(Ijuin, T.,et al., Increased insulin action in SKIP heterozygous knockout mice.Molecular and Cellular Biology, 2008.28(17):5184-5195.)。豬、牛等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物基因組內(nèi)該基因的定位也多分布影響相關(guān)性狀的QTL，如豬肌纖維數(shù)目和大腿重及犢牛出生重。且該基因內(nèi)的多態(tài)可顯著影響大白X梅山豬F2代群體的背最長(zhǎng)肌高度等多項(xiàng)胴體性狀(Xiong, Q., et al., Characterization of porcine SKIP gene in skeletal muscle development!polymorphisms, association analysis, expression and regulation of cell growthin C2C12cells.Meat Sci, 2012.92(4):490-497.)。然而 SKIP 基因在山羊中的研究尚屬空白，基因的多態(tài)信息仍未見(jiàn)報(bào)道。
[0004]綜合考慮SKIP對(duì)肌纖維發(fā)育的主要作用，開(kāi)展山羊中SKIP基因的研究很有必要。研究基因突變位點(diǎn)在群體中的多態(tài)性，并進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析是發(fā)掘分子標(biāo)記與性狀間的關(guān)系、研究基因功能的一個(gè)非常重要的手段。所以 申請(qǐng)人:對(duì)該基因在山羊中進(jìn)行了多態(tài)性研究和關(guān)聯(lián)分析，為 申請(qǐng)人:更好的在肉羊品種改良中運(yùn)用該基因提供了重要的理論支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于獲得一個(gè)與山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，通過(guò)克隆山羊SKIP基因的特異DNA片段，并經(jīng)關(guān)聯(lián)分析，得到一個(gè)用于山羊生長(zhǎng)性狀檢測(cè)的遺傳標(biāo)記，該標(biāo)記屬于一種新的標(biāo)記，可以應(yīng)用于山羊的標(biāo)記輔助選擇的關(guān)聯(lián)分析中。
[0006]本發(fā)明通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007] 申請(qǐng)人:通過(guò)篩選，得到一個(gè)用于檢測(cè)山羊生長(zhǎng)性狀的遺傳標(biāo)記，該標(biāo)記的核苷酸序列如下所示:
[0008]GGCTTCCCTTCTCAGCATACATGTCGTGACGTGGAATGTGGCCTCTGCCGCACCCCCTCCAGACCTCAGTGATCTGCTTCAGCTGAACAACCTGAACCTGAACCTGGACATATATGTCATTGGGTAGGTGTCCACAGGACCCGTCACGCATCCCTGTGTCTGAAATCAGGGTCAGGTAAGCCTGGCCAGTCCCAAATTGTCCCCACGGGGAACCACTATAACCTGTTCGCCCTTGCCCTGGAGTGTGAAGGCCAAGAGCTTTCAGCCTGCATCAGAGCCAGGCCACATCTGTTGTCCTGGGTCAGCAGTGGCAAGGGGCTGGCGAGCGACAGCCACAGGGGAGGGAGAACCCAGGGCTAGACAGTCGGCTGAGGGCAGTGCTGGATGTCGGAGCAGAGGCAGGGCCCTCCAGRCCAGGGGGCAGACCTCTGATCTGGGACGGGCAGTTTGCAGGAACTGAACTGTGGGATCATGAGCCTCCTTTCCGACACTGCCTTTGAAGACCCATGGAGCAGTTACTTCATGGACGTGCTTTCCCCTCTGAGCTTCGTCAAGGTAACTTGCAAGTTCATGGGCAATTGGGAAATGTGTATCACCTCTTATTACTAATCCCTAGTCCTTTGTCTCACAGTCCAGCTTTCATGCTATTACCCTTTTATTTAAAGACCCAAACCCCAGTT
[0009]在上述基因片段(序列)中所示的“R”(即第413bp處的等位基因的突變)是G或A，該突變導(dǎo)致Bg I1-RFLP多態(tài)性。
[0010] 申請(qǐng)人:設(shè)計(jì)了一種擴(kuò)增山羊SKIP基因和檢測(cè)該基因片段突變的引物對(duì)(也是擴(kuò)增本發(fā)明的遺傳標(biāo)記的引物對(duì))，該引物對(duì)的DNA序列如下所示:
[0011]正向引物:GGCTTCCCTTCTCAGCATA，
[0012]反向引物:AACTGGGGTTTGGGTCTTT。
[0013]我們建立了一種與山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記的制備方法，該方法在于包括以下步驟:
[0014]用綿羊SKIP基因組DNA和cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得山羊相關(guān)染色體上SKIP的基因組序列。從山羊血液中提取基因組DNA，根據(jù)SKIP基因序列設(shè)計(jì)引物，該引物對(duì)的DNA序列如序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，用序列表SEQ ID NO:2和SEQID NO: 3所示的引物對(duì)在山羊基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化、克隆測(cè)序，獲得如序列表 SEQ IDNO:1。
[0015]本發(fā)明的遺傳標(biāo)記可以應(yīng)用于山羊生長(zhǎng)性狀檢測(cè)中。其中所設(shè)計(jì)的引物對(duì)也可應(yīng)用于山羊生長(zhǎng)性狀的檢測(cè)中。
[0016]更詳細(xì)的技術(shù)方案如《【具體實(shí)施方式】》所述。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]序列表SEQ ID NO:1是克隆的與山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因SKIP的基因序列片段。序列長(zhǎng)度為680bp，其中在該序列的413bp處存在一個(gè)G/A替換(等位基因突變，我們將該突變位點(diǎn)寫(xiě)作“R”)。序列表SEQ ID NO:2和3是本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物對(duì)的核苷酸序列，其位于SEQ ID NO: I序列的第1-19位和第662-680位。
[0018]圖1:是本發(fā)明克隆的與山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因SKIP的部分核苷酸序列，圖中顯示了 I個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。圖中:下劃線部分為引物序列，括號(hào)內(nèi)的堿基為堿基突變，該突變?cè)诒景l(fā)明的權(quán)利要求書(shū)中用R代表，二者是同一個(gè)含義。
[0019]圖2:本發(fā)明中PCR擴(kuò)增的SKIP部分基因組序列直接測(cè)序檢測(cè)到的基因突變位點(diǎn)測(cè)序色譜圖。
[0020]圖3:是PCR擴(kuò)增獲得的SKIP部分基因組序列的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中標(biāo)記說(shuō)明:泳道:M 是 DL2000Marker。
[0021]圖4:山羊SKIP基因PCR-Bgl1-RFLP檢測(cè)結(jié)果。圖中標(biāo)記說(shuō)明:泳道M為DL2000Marker ；AA 基因型，680bp ；AG 基因型，680bp，410bp，270bp ；GG 基因型，410bp，270bp。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施實(shí)例1:
[0023]( 一).SKIP基因部分基因組序列的克隆及多態(tài)性檢測(cè)方法的建立
[0024]⑴引物設(shè)計(jì):
[0025]用綿羊SKIP基因組DNA(GenBank收錄號(hào):NC_019468.1)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank山羊Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)中做同源序列篩選,獲得位于山羊19號(hào)染色體上相似性為97%的同源SKIP基因組序列。根據(jù)山羊SKIP基因組序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(正向引物 5’ GGCTTCCCTTCTCAGCATA3’ ；反向引物 5’ AACTGGGGTTTGGGTCTTT3’)。以麻城黑山羊和波爾山羊?yàn)樵囼?yàn)群體，提取山羊的血液基因組DNA，將所得兩個(gè)山羊品種的DNA混合構(gòu)建DNA池作為模板擴(kuò)增山羊SKIP部分基因片斷。
[0026]經(jīng)過(guò)PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序，并通過(guò)序列分析獲得如序列表SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列(見(jiàn)圖1);通過(guò)測(cè)序得到如圖2所示的色譜圖，發(fā)現(xiàn)存在I處單核苷酸多態(tài)性(SNP)。即:在SEQ ID NO:1的第413bp處有一個(gè)G/A的堿基突變。
[0027](2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序
[0028]PCR 擴(kuò)增:SEQ ID NO:1 所示的序列。反應(yīng)總體積 25 μ L =IOXTap buffer2.5 μ L、dNTP終濃度為200 μ M，正、反向引物各為0.2 μ M，IU Taq DNA聚合酶(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)。PCR擴(kuò)增程序是:94°C 4min，然后循環(huán)35次94°C 40s, 59°C 45s, 72°C 30s，最后72°C延伸lOmin。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。[0029]上述的正、反向引物的序列如下所示:
[0030]正向引物:GGCTTCCCTTCTCAGCATA，
[0031 ]反向引物:AACTGGGGTTTGGGTCTTT。
[0032]PCR產(chǎn)物的純化:在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL離心管，用sanpr印柱式DNA膠回收試劑盒(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司)純化DNA片段。具體步驟如下:加入700 μ L溶膠液，50-60°C水浴至膠徹底融化，加熱融膠時(shí)，每2min混勻一次，冷卻至室溫；將離心柱放入收集管中，把混合液移至離心柱，室溫放置2min ；9000r/min離心lmin，此時(shí)DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中廢液,將離心柱放入同一個(gè)收集管中，加入700 μ L洗脫液，12000r/min離心Imin ;倒掉收集管中的廢液，12000r/min離心Imin ;將離心柱放入一預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌1.5mL離心管中，加入40 μ L洗脫液或雙蒸水(ρΗ>7.0)，室溫或37°C放置2-3min(提高洗脫溫度至55_80°C有利于提高DNA的洗脫效率，可洗脫兩次。);12000r/min離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于_20°C備用。 [0033](3) PCR-Bgl1-RFLP多態(tài)性檢測(cè)方法的建立
[0034]上述PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序(測(cè)序委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行)，得到片段的大小為680bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。經(jīng)ClusterW軟件進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中位于該片段413bp處(第二內(nèi)含子中)G/A變異引起了 BglI酶切位點(diǎn)(GCCNNNN丨NGGC)多態(tài)性改變。
[0035]酶切反應(yīng)體系為10 μ L，其中包含:10Xbufferl μ L，限制性內(nèi)切酶(10U/μ L) 0.1 μ L，PCR產(chǎn)物3.9 μ L，ddH205 μ L，置37°C恒溫反應(yīng)過(guò)夜，后經(jīng)1.8%的瓊脂糖凝膠凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄酶切分型結(jié)果。當(dāng)452bp處的堿基都為A時(shí)BglI不識(shí)別該位點(diǎn)，記為AA型(680bp)，當(dāng)突變位點(diǎn)堿基都為G時(shí)BglI酶識(shí)別該位點(diǎn)，記為GG型(410bp+270bp)，當(dāng)A和G都存在時(shí)記為AG型680bp+410bp+270bp)。山羊SKIP基因的PCR-Bgl1-RFLP的酶切分型結(jié)果如圖4。
[0036]實(shí)施例2:
[0037]用于關(guān)聯(lián)分析的試驗(yàn)材料用湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所種羊場(chǎng)的318頭波爾山羊與麻城黑山羊雜交后代個(gè)體。所分析的性狀主要為生長(zhǎng)性狀。生長(zhǎng)性狀包括分別在3、6、12、18、24月齡測(cè)得山羊個(gè)體的體重、體高、體斜長(zhǎng)、胸圍、管?chē)?。首先采用?shí)施例1所建立的PCR-Bgl1-RFLP方法進(jìn)行個(gè)體的基因分型，采用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件(SAS InstituteInc, Version8Edition)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,GLM程序進(jìn)行標(biāo)記與性狀間的關(guān)聯(lián)分析，REG程序計(jì)算基因的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，分析山羊SKIP基因Bgl1-RFLP不同基因型與山羊生長(zhǎng)性狀的相關(guān)關(guān)系。建立統(tǒng)計(jì)模型，除隨機(jī)效應(yīng)以外，其他因素均為固定效應(yīng)，所采用模型如下:
[0038]Yijklm = μ +Si+Yj+Gk+Fl+Mm+ei jklm,其中 Yi jklm 是性狀觀測(cè)值，μ 是總體平均數(shù)，Si是季節(jié)效應(yīng)，Yj是年份效應(yīng)，Gk是基因效應(yīng)，F(xiàn)l是父系效應(yīng)，Mm是母系效應(yīng)，eijklm是隨機(jī)殘差。加性效應(yīng)用-1，0，I分別代表AA，AG，GG ;顯性效應(yīng)用0，1，O分別代表AA，AG，GG0
[0039]由表1可以看出SKIP基因多態(tài)與山羊3-6月日增胸圍，第三月胸圍，第十二月管?chē)?，第十二月體重，第十八月體高呈顯著或極顯著相關(guān)，其中GG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，相對(duì)于AA基因型，GG基因型個(gè)體具有更高的第三月胸圍，第十二月管?chē)谑麦w重及第十八月體高(見(jiàn)表1)。
[0040]表1 SKIP基因G/A突變與山羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)系
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種與山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其核苷酸序列如下所示: GGCTTCCCTTCTCAGCATACATGTCGTGACGTGGAATGTGGCCTCTGCCGCACCCCCTCCAGACCTCAGTGATCTGCTTCAGCTGAACAACCTGAACCTGAACCTGGACATATATGTCATTGGGTAGGTGTCCACAGGACCCGTCACGCATCCCTGTGTCTGAAATCAGGGTCAGGTAAGCCTGGCCAGTCCCAAATTGTCCCCACGGGGAACCACTATAACCTGTTCGCCCTTGCCCTGGAGTGTGAAGGCCAAGAGCTTTCAGCCTGCATCAGAGCCAGGCCACATCTGTTGTCCTGGGTCAGCAGTGGCAAGGGGCTGGCGAGCGACAGCCACAGGGGAGGGAGAACCCAGGGCTAGACAGTCGGCTGAGGGCAGTGCTGGATGTCGGAGCAGAGGCAGGGCCCTCCAGRCCAGGGGGCAGACCTCTGATCTGGGACGGGCAGTTTGCAGGAACTGAACTGTGGGATCATGAGCCTCCTTTCCGACACTGCCTTTGAAGACCCATGGAGCAGTTACTTCATGGACGTGCTTTCCCCTCTGAGCTTCGTCAAGGTAACTTGCAAGTTCATGGGCAATTGGGAAATGTGTATCACCTCTTATTACTAATCCCTAGTCCTTTGTCTCACAGTCCAGCTTTCATGCTATTACCCTTTTATTTAAAGACCCAAACCCCAGTT上述序列中第413位的R是G或A，該突變導(dǎo)致Bgl1-RFLP多態(tài)性。
2.檢測(cè)如權(quán)利要求1所述遺傳標(biāo)記的堿基突變的引物對(duì)，其DNA序列如下所示: 正向引物:GGCTTCCCTTCTCAGCATA， 反向引物:AACTGGGGTTTGGGTCTTT。
3.—種與山羊生性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 用綿羊SKIP基因組DNA和cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得山羊相關(guān)染色體上SKIP的基因組序列， 從山羊血液中提取基因組DNA，將麻城黑山羊與波爾山羊的DNA混合構(gòu)建成DNA池，根據(jù)參考序列設(shè)計(jì)如權(quán)利要求2所示的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得山羊部分SKIP基因組片段，PCR產(chǎn)物純化后直接測(cè)序，通過(guò)序列分析獲得如權(quán)利要求1所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)記在山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)檢測(cè)中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的引物對(duì)在山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)檢測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104017808SQ201410270694
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】熊琪, 陳明新, 張年, 李曉鋒, 索效軍, 楊前平, 劉洋, 田宏, 張鶴山, 熊軍波 申請(qǐng)人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所