一種淡水蟹血淋巴中總rna的高效提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種淡水蟹，尤其是河蟹血淋巴中總RNA的高效提取方法，其步驟包括：（1）血淋巴采?。阂?mL總體積的滅菌針頭從河蟹步足基部吸取河蟹血淋巴；（2）總RNA提?。簩⑽〉难馨陀肨rizol試劑處理，離心取上清，加氯仿，然后離心取上清，加異丙醇，再離心，然后去除上清液后加75%乙醇洗滌RNA，離心后干燥沉淀后保存。本發(fā)明方法可簡便、快速、高效地提取河蟹血淋巴中RNA。提取的RNA數(shù)量多、質(zhì)量高，不受蛋白質(zhì)的污染，可用于各種分子生物學(xué)分析，有較強的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種淡水蟹血淋巴中總RNA的高效提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種簡便、快速、高質(zhì)量提取河蟹血淋巴中總RNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]河蟹,學(xué)名中華絨螯蟹(iZr1cAeir屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacca)、十足目(Decapo)、方蟹科(Grapsidae)、絨螯蟹屬iEr1cheir),是我國特有的水生經(jīng)濟動物，廣泛分布于遼河、長江、甌江、閩江等水系。自20世紀(jì)70年代中華絨螯蟹人工繁育技術(shù)突破之后，中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)逐漸發(fā)展成為我國水產(chǎn)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，年產(chǎn)值近400億元，已成為我國特種水產(chǎn)養(yǎng)殖中產(chǎn)量最高、效益最好、養(yǎng)殖最廣泛的產(chǎn)業(yè)。在過去幾十年的產(chǎn)業(yè)發(fā)展中，隨著中華絨螯蟹養(yǎng)殖的快速發(fā)展，種質(zhì)資源混雜、性早熟、個體小型化、爆發(fā)性疾病等現(xiàn)象在中華絨鰲蟹種群中頻頻發(fā)生，對我國河蟹產(chǎn)業(yè)造成巨大影響和損失。與此共進的是對中華絨螯蟹的科學(xué)研究也不斷擴大和加深，尤其是分子生物學(xué)方面的研究最為深入。因而，中華絨螯蟹總RNA的提取與應(yīng)用也越來越廣泛。
[0003]在另一方面，由于實驗需要，需對河蟹樣本進行多次或不同時間段采集RNA以用于多種試驗研究，要求發(fā)展一種非損傷或非死亡的RNA采集技術(shù)。從血淋巴中采集RNA可在不取死河蟹樣本的條件下，實現(xiàn)多次或多時間段的采樣，有效保障了相關(guān)試驗的順利進行。
[0004]中華絨螯蟹屬開放式循環(huán)系統(tǒng)，其血液為無色，由淋巴細胞、血細胞(無顆粒細胞、小顆粒細胞和大顆粒細 胞)和相關(guān)體液組成，因而統(tǒng)稱為血淋巴。河蟹開放式血淋巴循環(huán)特性，與身體組織交連在一起，造成血淋巴采樣困難，很難采集足夠數(shù)量的血淋巴，影響了后續(xù)RNA提取等工作。然而，在河蟹的種質(zhì)、遺傳、病害等相關(guān)研究中，經(jīng)常需要高質(zhì)量的RNA樣本。此外，在RNA提取過程中，河蟹的血淋巴組織易凝結(jié)，易與Trizol試劑反應(yīng)形成塊狀物，難以提取出高質(zhì)量的RNA，嚴(yán)重影響了后續(xù)的相關(guān)研究工作。發(fā)明一種簡易、高效的河蟹血淋巴中RNA提取方法對科研工作和產(chǎn)業(yè)發(fā)展均十分重要。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種河蟹血淋巴的總RNA高效提取方法，是本發(fā)明人在研究實踐中發(fā)展起來的穩(wěn)定技術(shù)，通過該方法能保障河蟹血淋巴中提取的總RNA數(shù)量多，質(zhì)量高，可用于多種下游分析，滿足實驗用RNA樣本的需要，且可以保證抽取血淋巴后河蟹能夠繼續(xù)存活，能實現(xiàn)多次或多時間段的RNA提取。
[0007]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:一種河蟹血淋巴總RNA的提取方法，其步驟如下:
(1)取分析的河蟹活體樣本，最好是個體規(guī)格在1g以上，以保證能夠抽取足夠的血淋
巴；
(2)釆冰，取離心管并加入ImLTrizol試劑，置于碎冰上；
(2)抽取河蟹血淋巴；
(3)提取總RNA，步驟如下:a.將第(2)步抽取的河蟹血淋巴加入裝有Trizol試劑的離心管中，將血淋巴組織與Trizol試劑混勻，室溫靜置3-10分鐘，優(yōu)選為5分鐘；
b.離心，取上清液加入氯仿；
c.離心，取上清液加入異丙醇；
d.離心后棄上清液，沉淀RNA加入75%酒精；
e.離心后棄上清液；干燥沉淀RNA；
f.沉淀中加入RNase-free水溶解。
[0008]其中，在第(2)步中，在抽取河蟹血淋巴的過程中針頭尖端斜切面向上，插入深度2mm,將河蟹向插入端傾斜，勻速抽取。
[0009]其中，在第(3)步中第a步，血淋巴組織與Trizol試劑的混勻先用手劇烈震蕩，再在漩渦振蕩器上震蕩為均勻的混濁液。
[0010]本發(fā)明還適用于其它淡水蟹類血淋巴的RNA提取，因此本發(fā)明也要求保護淡水蟹的血淋巴的RNA的提取。
[0011]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:本發(fā)明方法是發(fā)明人在針對河蟹血淋巴RNA提取的不斷摸索過程中，通過血淋巴的快速采集和實驗步驟設(shè)計，利用河蟹血淋巴為材料，通過Trizol法提取河蟹血淋巴總RNA，解決了河蟹血淋巴RNA不易提取的難題，包括采集方法和提取步驟的操作。該方法可簡 便、快速、有效的提取河蟹血淋巴中總RNA，提取的RNA數(shù)量足、質(zhì)量高，幾乎不受蛋白質(zhì)的污染，可用于多種下游分析，且可以保證抽取血淋巴后河蟹能夠繼續(xù)存活，能實現(xiàn)多次或多時間段的RNA提取，為河蟹的遺傳多樣性研究、種質(zhì)保護和資源利用提供一項有效技術(shù)手段，具有重大科學(xué)意義和實用價值。
[0012]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明提取的總RNA的電泳檢測結(jié)果。
[0014]【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明的【具體實施方式】如下:
一、實驗試劑準(zhǔn)備
ImL滅菌注射器和1.5mL離心管若干。用70%乙醇溶液擦拭試驗臺面。釆制冰機生產(chǎn)的碎冰，向離心管加入ImL Trizol試劑后置于冰上。
[0016]二、河蟹材料準(zhǔn)備
取活體中華絨螯蟹，為提高總RNA的提取總量，最好取體重約1g以上個體作實驗材料。用紗布擦干蟹體表面的水分。
[0017]三、血淋巴采集
用ImL的滅菌注射器進行血淋巴采集。注射器的針頭尖端斜切面向上，于步足基部插入河蟹體內(nèi)2_左右，將河蟹向插入斷傾斜，勻速抽取。如要保證河蟹能夠繼續(xù)存活，抽取量不宜過大，提取RNA時每試管需約300 μ L血淋巴。注意，如采集方法不對，就不能采到足夠的血淋巴，從而影響RNA的提取量。[0018]四、總RNA提取
1.將抽取到的血淋巴快速加入裝有Trizol試劑的離心管中，用手劇烈震蕩15秒，然后在漩渦振蕩器上震蕩I分鐘，使其呈懸濁液狀態(tài)，室溫靜置5分鐘。(此為關(guān)鍵步驟之二，由于河蟹血淋巴會與Trizol試劑反應(yīng)形成塊狀固體，影響RNA的提取量，所以震蕩必須均勻，且時長要到I分鐘)
2.放于4°C的離心機中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。
[0019]3.小心提取上清液,注入另一離心管中,然后加入200 μ L氯仿，劇烈震蕩15秒，室溫靜置5分鐘。
[0020]4.放于4°C的離心機中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘。
[0021]5.小心提取上清液，注入另一離心管中，加入等體積異丙醇上下顛倒輕柔混勻15秒，室溫靜置10分鐘。
[0022]6.放于4°C的離心機中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。
[0023]7.棄去上清液，向離心管中加入ImL的75%乙醇洗滌沉淀RNA，并用槍頭將RNA沉淀吹打起來以獲得較好的清洗效果。
[0024]8.放于4°C的離心機中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。
[0025]9.小心棄去上清液，于室溫靜置2-3分鐘以干燥RNA沉淀。(此為關(guān)鍵步驟之三，干燥時間不宜超過3分鐘， 以免干燥過度導(dǎo)致RNA降解)
10.加入30-50 μ L的RNase-free ddH2o溶解，立即置于_80°C的低溫冰箱中保存。
[0026]四、RNA檢測
1.紫外分光光度計檢測
取RNA溶液2 μ L，加入98 μ L去離子水稀釋50倍后，用752型紫外分光光度計檢測樣品在OD值為260、280nm時的吸光光度值。RNA的純度根據(jù)OD26tl / OD280的值確定。高質(zhì)量的RNA溶液的OD26tl / OD280比值在1.8-2.1之間，比值為2.0是高質(zhì)量RNA的標(biāo)志。
[0027]經(jīng)檢測，該方法提取的RNA樣本的OD26tl / OD280比值介于1.80-2.05之間，說明該方法提取中華絨螯蟹血淋巴中的總RNA的質(zhì)量好、純度高。
[0028]上述主要檢測RNA純度，其擴增效果和使用效率情況還需作進一步檢測，如電泳檢測等。
[0029]2.電泳檢測
取RNA溶液3 μ L，用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳(電壓110V，時間30min)檢測，在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察28S、18S、5S三條RNA條帶的清晰度。
[0030]經(jīng)電泳檢測，該方法提取的RAN可清晰辨別28S、18S以及5S三條RNA條帶，說明RNA提取質(zhì)量較好，可用于其它后續(xù)研究。具體如圖1所示。
【權(quán)利要求】
1.一種淡水蟹血淋巴中總RNA的高效提取方法，其特征在于包括如下步驟: (1)取無菌離心管并加入ImLTrizol試劑，置于碎冰上； (2)血淋巴抽?。? (3)提取總RNA，步驟如下: 將第(2)步抽取的河蟹血淋巴加入第(I)步的離心管中，將血淋巴組織與Trizol試劑混勻，室溫靜置3-10分鐘； 離心，取上清液加入氯仿； 離心，取上清液加入異丙醇； 離心后棄上清液，沉淀RNA加入75%酒精； 離心后棄上清液；干燥沉淀RNA ； 沉淀中加入RNase-free水溶解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取淡水蟹血淋巴RNA的方法，其特征在于:在第(2)步中，在抽取河蟹血淋巴的過程中針頭尖端斜切面向上，插入深度2mm，將河蟹向插入端傾斜，勻速抽取。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的提取淡水蟹血淋巴RNA的方法，其特征在于:在第(3)步中第a步，血淋巴組織與Trizol試劑的混勻先用手劇烈震蕩，再在漩渦振蕩器上震蕩為均勻的混濁液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取淡水蟹血淋巴RNA的方法，其特征在于:在第(3)步第a步中，室溫靜置5分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的提取淡水蟹血淋巴RNA的方法，其特征在于:所述的淡水蟹是河蟹。
【文檔編號】C12N15/10GK104031910SQ201410293204
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】王成輝, 茲元吉 申請人:上海海洋大學(xué)