一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體及其制備方法。所述表達(dá)載體是通過將牛乳鐵蛋白肽基因接入pYES2質(zhì)粒中，并用TPI啟動(dòng)子替代pYES2質(zhì)粒的GAL1啟動(dòng)子所得。本發(fā)明構(gòu)建的pYES2-TPI–LfcinB重組質(zhì)?？梢愿咝Х€(wěn)定地分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白肽；且不需使用誘導(dǎo)劑，降低了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)的復(fù)雜性。
【專利說明】一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程菌【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]抗菌肽(也稱為宿主防御肽)是一類在誘導(dǎo)條件下產(chǎn)生的，具有抗菌活性的兩性小分子多肽，存在于所有生物中的，進(jìn)化上保守的先天免疫反應(yīng)的組成部分?？咕氖撬拗髅庖叻烙到y(tǒng)的重要組成部分。抗菌肽具有廣譜抗菌作用，對(duì)病毒、寄生蟲、癌細(xì)胞均有抑制作用?？咕目梢杂糜卺t(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)等方面。在醫(yī)藥衛(wèi)生方面，抗菌肽與抗生素最大的不同之處在于抗菌肽的應(yīng)用可以解決抗藥性的問題。隨著抗生素的濫用，解決抗藥性的問題已經(jīng)被提上議事日程，而近年來“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)，更是使這一問題雪上加霜。具有與抗生素完全不同殺菌機(jī)理的抗菌肽的應(yīng)用或許可以為這些問題的解決提供途徑。在食品工業(yè)上抗菌肽的應(yīng)用主要是食品添加劑?？咕牡臍⒕芰軓?qiáng)，并且對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有廣泛的殺菌作用，因此可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的食品防腐劑，起到保鮮作用。同時(shí)又由于它是一種肽，可以被消化道消化、吸收對(duì)人體無害。此外，抗菌肽在、畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)等各個(gè)方都有十分廣泛的應(yīng)用。研究其大規(guī)模生產(chǎn)具有十分積極的意義。本課題旨在找到一種大規(guī)模生產(chǎn)抗菌肽的方法，構(gòu)建工程菌，并對(duì)提高其產(chǎn)量等其他方面作出初步探索。
[0003]目前研究和使用的蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)主要有原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌為代表，真核表達(dá)系統(tǒng)又以酵母表達(dá)系統(tǒng)和動(dòng)、植物表達(dá)系統(tǒng)為代表。這其中，尤以大腸桿菌為代表的的原核表達(dá)系統(tǒng)和以酵母菌為代表的真核表達(dá)系統(tǒng)是研究得最為透徹的。
[0004]原核表達(dá):選用大腸桿菌偏好的密碼子，設(shè)計(jì)合成好抗菌肽基因，將抗菌肽基因克隆到含有蛋白伴體的專門的融合表達(dá)載體(如pET、pGEX、pGEM、pMAL等系列)然后轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的大腸桿菌宿主細(xì)胞，最后再經(jīng)誘導(dǎo)、酶切而得到抗菌肽基因表達(dá)的蛋白。
[0005]真核分泌表達(dá):抗菌肽的真核表達(dá)系統(tǒng)主要有酵母表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾和分泌能力，并且不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，是基因工程中良好的真核基因受體菌。近年來應(yīng)用最為廣泛的是畢赤酵母和釀酒酵母。隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，釀酒酵母已被廣泛地應(yīng)用于外源蛋白表達(dá)的宿主，其是真核生物，遺傳背景清楚，易操作，與日常生活密切，安全，無毒素，對(duì)生物和環(huán)境不會(huì)構(gòu)成威脅，可進(jìn)行蛋白翻譯后加工，同樣可進(jìn)行通過插入信號(hào)肽獲得分泌表達(dá)，易于純化，且工藝簡單成本較低。但是傳統(tǒng)宿主菌存在的葡萄糖效應(yīng)問題會(huì)影響誘導(dǎo)表達(dá)的效率，進(jìn)而影響產(chǎn)量，時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)所使用的誘導(dǎo)劑大大提高了生產(chǎn)成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體的制備方法。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種牛乳鐵蛋白肽組成型釀酒酵母表達(dá)菌株。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種牛乳鐵蛋白肽的生產(chǎn)方法。
[0010]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體，其是通過將牛乳鐵蛋白肽基因接入PYES2質(zhì)粒中，并用磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)啟動(dòng)子替代pYES2質(zhì)粒的GALl啟動(dòng)子所得。
[0011]所述牛乳鐵蛋白妝基因的序列如SEQ ID N0.3所不。
[0012]所述牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0013]一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟:
(1)PCR擴(kuò)增TPI啟動(dòng)子序列；
(2)PCR擴(kuò)增不含GALl啟動(dòng)子的pYES2質(zhì)粒序列；
(3)將上述兩個(gè)片段進(jìn)行平末端連接，得到重組表達(dá)載體；
(4)將牛乳鐵蛋白肽基因序列插入到步驟(3)所得到的重組表達(dá)載體中，即得到pYES2-TP1-LfcinB重組質(zhì)粒。
[0014]步驟(1)的操作為:以含有TPI啟動(dòng)子序列的PYX212質(zhì)粒為模板，利用引物TPl:5’ -TCTTCAAGAATTGGGGA -3’ 和 TP2: 5’ -CTGTATGTGTTTTTTGTAGTTATAG -3’ 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
[0015]步驟(2)的操作為:以pYES2質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物:Yl:5’ -CCGGATCGGACTACTAGC-3’ 和 Y2::5’ -ACTAGTGGATCATCCCCAC-3’ 進(jìn)行反向 PCR 以刪除PYES2質(zhì)粒中的GALl啟動(dòng)子。
[0016]步驟(3)的操作為JfTPI啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物和缺失啟動(dòng)子pYES2質(zhì)粒PCR產(chǎn)物按2:1混合，用T4多聚核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化后，再用T4 DNA連接酶連接。
[0017]步驟(4)的操作為:將步驟(3)得到的重組表達(dá)載體和牛乳鐵蛋白肽基因序列用EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切4h，并做粘性末端連接，即得到pYES2 -TP1- LfcinB
重組質(zhì)粒。
[0018]一種牛乳鐵蛋白肽組成型釀酒酵母表達(dá)菌株，其是由上述的牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSCl菌株所得。
[0019]一種牛乳鐵蛋白肽的生產(chǎn)方法，包括對(duì)上述的牛乳鐵蛋白肽組成型釀酒酵母表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而得到牛乳鐵蛋白肽。
[0020]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明通過通過替換啟動(dòng)子的方法，獲得了一種可以組成型表達(dá)目的蛋白的釀酒酵母菌株。對(duì)于本發(fā)明來說，主要解決了如下問題:
(1)用組成型表達(dá)載體解決葡萄糖抑制效應(yīng)問題，可以高效穩(wěn)定地分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白妝；
(2)不需使用誘導(dǎo)劑，降低了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)的復(fù)雜性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為大腸桿菌DH5 α抑菌活性圖，其中I為含pYES2_GALl質(zhì)粒的釀酒酵母培養(yǎng)12h上清，2為含pYES2-TPI重組質(zhì)粒的釀酒酵母培養(yǎng)12h上清，3為水對(duì)照，4為SC-U釀酒酵母液體培養(yǎng)基，5為氨芐青霉素鈉。

【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
實(shí)施例
[0023]一、一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
UTPI啟動(dòng)子基因的擴(kuò)增:以含有TPI啟動(dòng)子序列的PYX212質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增引物為: TPl:5’ - TCTTCAAGAATTGGGGA -3’ (SEQ ID N0.5)；
TP2: 5’ -CTGTATGTGTTTTTTGTAGTTATAG -3’ (SEQ ID N0.6)。
[0024]反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5min ；94°C 30s,53°C 30s,72°C 93s，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin。反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收。
[0025]擴(kuò)增得到的TPI啟動(dòng)子的序列如SEQ ID N0.1所示。
[0026]2、PCR擴(kuò)增不含GALl啟動(dòng)子的pYES2質(zhì)粒序列:以pYES2質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物:Y1:5，-CCGGATCGGACTACTAGC-3，(SEQ ID N0.7)和 Y2::5，-ACTAGTGGATCATCCCCAC-3，(SEQ ID N0.8)，進(jìn)行反向PCR以刪除pYES2質(zhì)粒中的GALl啟動(dòng)子(如SEQ ID N0.2所示)。
[0027]反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5min ;94°C 45s，59°C 45s，72°C 572s，15 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin。反應(yīng)產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收。
[0028]3、TPI啟動(dòng)子和缺失GALl啟動(dòng)子的pYES2質(zhì)粒的平末端連接:將TPI啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物和缺失啟動(dòng)子PYES2質(zhì)粒PCR產(chǎn)物按2: I混合，用T4多聚核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化后用T4DNA連接酶連接。反應(yīng)產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收。
[0029]4、向重組質(zhì)粒中插入牛乳鐵蛋白肽基因序列
將步驟(3)得到的重組表達(dá)載體和牛乳鐵蛋白肽基因序列(SEQ ID N0.3)用EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切4h，并做粘性末端連接，得到牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體pYES2 -TP1- LfcinB，其序列如 SEQ ID N0.4 所示。
[0030]二、克隆轉(zhuǎn)化
(I)將重組質(zhì)粒PYES2 -TP1-LfcinB轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素鈉篩選陽性克隆，少量提取質(zhì)粒，并測序。
[0031](2)取釀酒酵母INVSCl感受態(tài)細(xì)胞80 μ 1，加入剛?cè)诨臏y序正確的質(zhì)粒1ul，充分混勻；再將菌液加入冰浴中的電擊杯，迅速電擊轉(zhuǎn)化；最后迅速將轉(zhuǎn)化菌涂布于SC-U固體培養(yǎng)基上，30攝氏度培養(yǎng)。
[0032](3)轉(zhuǎn)化驗(yàn)證:挑取SC-U固體培養(yǎng)基上的釀酒酵母單克隆菌落，接種于SC-U液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并取菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，可以擴(kuò)增出牛乳鐵蛋白肽基因和TPI啟動(dòng)子片段即為轉(zhuǎn)化成功的陽性菌落。
[0033]三、培養(yǎng)表達(dá)及活性檢測
取陽性菌落的培養(yǎng)菌液在SC-U固體培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線，30 °C培養(yǎng)，以含有PYES2-GAL1 - LfcinB重組質(zhì)粒(沒有替換啟動(dòng)子)的釀酒酵母作為對(duì)照。
[0034]挑取劃線的單克隆菌落接種于SC-U液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)12h，做大腸桿菌DH5a抑菌活性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明，pYES2 -TP1- LfcinB重組質(zhì)粒的抑菌圈的半徑顯著大于PYES2-GAL1 - LfcinB重組質(zhì)粒的抑菌圈，由此可見，pYES2 -TP1-LfcinB重組質(zhì)粒的表達(dá)活性得到了顯著提高。
[0035]Tricine-SDS-PAGE法鑒定抗菌肽牛乳鐵蛋白肽的表達(dá)效果，取12h培養(yǎng)上清加10%的TCA濃縮，加20 μ I上樣緩沖液做SDS電泳檢測，檢測結(jié)果與預(yù)期一致。
[0036]以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明構(gòu)建的pYES2 -TPI _ LfcinB重組質(zhì)?？梢愿咝Х€(wěn)定地分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白肽；且不需使用誘導(dǎo)劑，降低了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)的復(fù)雜性。
【權(quán)利要求】
1.一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體，其是通過將牛乳鐵蛋白肽基因接入PYES2質(zhì)粒中，并用磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)啟動(dòng)子替代PYES2質(zhì)粒的GALl啟動(dòng)子所得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體，其特征在于，所述牛乳鐵蛋白肽基因的序列如SEQ ID N0.3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體，其特征在于，所述牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
4.一種牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟: (1)PCR擴(kuò)增TPI啟動(dòng)子序列； (2)PCR擴(kuò)增 不含GALl啟動(dòng)子的pYES2質(zhì)粒序列； (3)將上述兩個(gè)片段進(jìn)行平末端連接，得到重組表達(dá)載體； (4)將牛乳鐵蛋白肽基因序列插入到步驟(3)所得到的重組表達(dá)載體中，即得到pYES2-TP1-LfcinB重組質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(1)的操作為:以含有TPI啟動(dòng)子序列的pYX212質(zhì)粒為模板，利用引物TPl:5’ -TCTTCAAGAATTGGGGA -3，和TP2:5’ -CTGTATGTGTTTTTTGTAGTTATAG -3’ 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)的操作為:以PYES2質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物:Y1:5’ -CCGGATCGGACTACTAGC-3’ 和 Y2::5’ -ACTAGTGGATCATCCCCAC-3’ 進(jìn)行反向PCR以刪除pYES2質(zhì)粒中的GALl啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(3)的操作為:將TPI啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物和缺失啟動(dòng)子PYES2質(zhì)粒PCR產(chǎn)物按2: I混合，用T4多聚核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化后，再用T4 DNA連接酶連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(4)的操作為:將步驟(3)得到的重組表達(dá)載體和牛乳鐵蛋白肽基因序列用EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切4h，并做粘性末端連接，即得到PYES2 -TP1-LfcinB重組質(zhì)粒。
9.一種牛乳鐵蛋白肽組成型釀酒酵母表達(dá)菌株，其是由權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的牛乳鐵蛋白肽組成型酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSCl菌株所得。
10.一種牛乳鐵蛋白肽的生產(chǎn)方法，包括對(duì)權(quán)利要求9所述的牛乳鐵蛋白肽組成型釀酒酵母表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而得到牛乳鐵蛋白肽。
【文檔編號(hào)】C12R1/865GK104073511SQ201410314917
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】查向東, 車媛媛, 程林春, 趙大偉, 余忠麗 申請人:廣東希普生物科技股份有限公司