人乳鐵蛋白衍生肽及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及新的肽及其用途，特別是用于治療和/或預(yù)防感染、炎癥、疼痛、傷口、傷疤和/或腫瘤。
【專利說(shuō)明】人乳鐵蛋白衍生肽及其用途
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及新的肽及其用途，特別是用于治療和/或預(yù)防感染、炎癥、疼痛、傷口、疤痕和/或腫瘤。
[0002]發(fā)明背景
[0003]乳鐵蛋白是一種單鏈金屬結(jié)合糖蛋白，其分子量為77kDa。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白的負(fù)責(zé)殺細(xì)菌性能的結(jié)構(gòu)域是被稱為乳鐵蛋白肽的胃蛋白酶分解的片段(參見(jiàn)例如，BellamyW.,等人，Identification of the bactericidal domain of lactoferrin, Biochim.Biophys.Actall21:130-136,1992,和 Bellamy ff.,等人，Antibacterial spectrum oflactoferricin B, a potent bactericidal peptide derived from the N—terminalregion of bovine lactoferrin, J.Appl.Bact.73:472-479，1992)。
[0004]在許多類型的細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白受體，所述細(xì)胞包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、凝集素刺激的人外周血淋巴細(xì)胞、刷狀緣細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞株。
[0005]幾個(gè)專利出版物描述了乳鐵蛋白在治療感染或炎癥中的可能的用途。在W098/06425中，例如，公開(kāi)了乳鐵蛋白和乳鐵蛋白肽可用于治療和預(yù)防感染、炎癥和腫瘤。
[0006]EP629347描述了一種抗微生物劑其包含(A)乳鐵蛋白水解產(chǎn)物和/或者從乳鐵蛋白衍生的一種或多種抗微生物肽，和(B) —種或多種化合物，所述化合物選自金屬螯合蛋白、生育酚、環(huán)糊精、甘油脂肪酸酯、醇、EDTA或其鹽、抗壞血酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、多磷酸或其鹽、殼聚糖、半胱氨酸和膽酸作為其有效組分。該抗微生物劑意在用于產(chǎn)品處理，及其特別是用于安全處理例如食品和藥品。上述出版物所述試劑因此是一種新的防腐劑。在上述出版物中，給出了多個(gè)肽 序列并且其中一些肽序列類似于本發(fā)明所述的肽，盡管存在多個(gè)重要的差異，所述差異進(jìn)一步描述如下。
[0007]US5, 304, 633公開(kāi)了從人和牛的乳鐵蛋白的水解產(chǎn)物中分離的抗微生物肽。特別公開(kāi)了對(duì)應(yīng)于人乳鐵蛋白的12至47位氨基酸和17至41位氨基酸的肽的分離。
[0008]JP7145196描述了通過(guò)乳鐵蛋白水解制備抗生素肽。特別描述了對(duì)應(yīng)于人乳鐵蛋白的17至41位氨基酸的肽的制備。
[0009]JP8040925公開(kāi)了包含乳鐵蛋白衍生肽的藥物組合物及其在治療角膜損傷特別是角膜炎中的用途。特別公開(kāi)了對(duì)應(yīng)于人乳鐵蛋白的17至41位、12至58位和19至38位氨基酸的妝。
[0010]JP7274970描述了抗細(xì)菌的乳鐵蛋白衍生肽的重組生產(chǎn)，特別公開(kāi)了對(duì)應(yīng)于人乳鐵蛋白的18至42位氨基酸的肽。
[0011]JP8143468描述了乳鐵蛋白衍生肽及其作為抗?jié)兯幬锏挠猛荆貏e公開(kāi)了對(duì)應(yīng)于人乳鐵蛋白的19至33位氨基酸的肽。
[0012]W000/01730描述了從人乳鐵蛋白衍生的肽及其治療感染和炎癥的用途。
[0013]EP1228097描述了從人乳鐵蛋白的緊鄰N端衍生的肽及其作為微生物制劑的用途。
[0014]EPl 151009描述了包含對(duì)應(yīng)于人乳鐵蛋白的35至50位氨基酸序列的肽，其具有抗微生物和/或內(nèi)毒素中和活性。
[0015]W02006/047744描述了從人乳鐵蛋白的N端部分衍生的免疫調(diào)節(jié)肽，所述免疫調(diào)節(jié)肽包含至少33氨基酸并且在N端和C端替換為4個(gè)帶正電荷的氨基酸。
[0016]W02009/050279描述了突變的乳鐵蛋白肽及其抗微生物的活性。
[0017]W02009/062898描述了精氨酸替換的乳鐵蛋白肽及其抗微生物和抗炎的活性。
[0018]發(fā)明概述
[0019]本發(fā)明涉及具有改進(jìn)的抗菌和/或抗炎活性的新的肽。根據(jù)本發(fā)明所述肽的設(shè)計(jì)基于氨基酸序列SEQ ID NO:1，其對(duì)應(yīng)于成熟人乳鐵蛋白的氨13至30位氨基酸。
[0020]Q-P-E-A-T-K-C-F-Q-W-Q-R-N-M-R-K-V-R(SEQ ID NO:1)
[0021 ]本發(fā)明的第一個(gè)【具體實(shí)施方式】涉及肽，所述肽至少包含如下氨基酸序列
[0022]Xl-X2-ff-X4-X5-X6-M-X8-K-V-Xll-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO:2)
[0023]其中，
[0024]Xl 是 F、K 或 R
[0025]X2 是 Q、W 或 R
[0026]X4 是 K 或 R [0027]X5 是 R 或 K
[0028]X6 是 N、A、V、W或 R
[0029]X8 是 R 或 K
[0030]Xll 是 R、F 或 K
[0031]X12 是 G、S、N、V、L 或 H
[0032]X13 是 S、G、T 或 V
[0033]X14 是 R、L、Y、W或 K
[0034]X15 是 R、K 或 W
[0035]X16 是 R、K 或 W，以及
[0036]X17 是 R、G、Q、V、M、F、W 或K
[0037]以及上述肽的功能等效變體。
[0038]所述肽可優(yōu)選地進(jìn)一步在N-端包含氨基酸F、W或C。
[0039]所述肽可優(yōu)選地進(jìn)一步在C-端包含氨基酸G、R或L。
[0040]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)實(shí)施方式所述的肽至少包含如下氨基酸序列
[0041]Xl-X2-ff-K-X5-X6-M-X8-K-V-Xll-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO:3)
[0042]其中
[0043]Xl 是 F、K 或 R
[0044]X2 是 Q 或 W
[0045]X5 是 R 或 K
[0046]X6 是N、A、V 或W
[0047]X8 是 R 或 K
[0048]Xll 是 R、F 或 K
[0049]X12 是 V、L 或N
[0050]X13 是 S、G、T 或 V[0051]X14 是 R、L、Y、W或 K
[0052]X15 是 R、K 或 W
[0053]X16 是 R、K 或 W，以及
[0054]X17 是 R、F、W 或K
[0055]以及上述肽的功能等效變體。
[0056]所述肽 可優(yōu)選地進(jìn)一步在N-端包含氨基酸F、W或C。
[0057]所述肽可優(yōu)選地進(jìn)一步在C-端包含氨基酸G、R或L。
[0058]更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方式的肽選自包含氨基酸序列選自如下的氨基酸序列的肽
[0059]R-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-F-H-S-Y-R-R-M-G(SEQIDNO:21)
[0060]K-Q-ff-K-R-ff-M-R-K-V-F-V-S-L-R-R-V-G(SEQIDNO:22)
[0061]R-Q-ff-K-R-V-M-R-K-V-F-G-S-R-ff-ff-R-G(SEQIDNO:23)
[0062]K-Q-ff-K-R-M-M-R-K-V-F-S-V-R-R-ff-F-L(SEQIDNO:24)
[0063]F-R-Q-ff-K-R-ff-M-R-K-V-F-H-S-ff-R-R-ff(SEQIDNO:27)
[0064]F-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQIDNO:6)
[0065]ff-F-Q-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:7)
[0066]F-ff-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQIDNO:8)
[0067]F-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-K-K-K-K-G(SEQIDNO:19)
[0068]F-Q-ff-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-L-R-R-ff-G(SEQIDNO:20)
[0069]F-R-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-Q-G(SEQIDNO:25)
[0070]F-ff-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-L-S-R-R-R-R-G(SEQIDNO:31)
[0071]F-ff-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-N-S-R-R-R-R-G(SEQIDNO:32)
[0072]F-ff-ff-K-K-A-M-K-K-V-K-G-T-R-R-R-R-G(SEQIDNO:34)
[0073]以及上述肽的功能等效變體。
[0074]最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方式所述的肽選自如下肽
[0075]R-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-F-H-S-Y-R-R-M-G(SEQIDNO:21)
[0076]K-Q-ff-K-R-ff-M-R-K-V-F-V-S-L-R-R-V-G(SEQIDNO:22)
[0077]R-Q-ff-K-R-V-M-R-K-V-F-G-S-R-ff-ff-R-G(SEQIDNO:23)
[0078]K-Q-ff-K-R-M-M-R-K-V-F-S-V-R-R-ff-F-L(SEQIDNO:24)
[0079]F-R-Q-ff-K-R-ff-M-R-K-V-F-H-S-ff-R-R-ff(SEQIDNO:27)
[0080]F-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQIDNO:6)
[0081]ff-F-Q-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:7)
[0082]F-ff-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQIDNO:8)
[0083]F-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-K-K-K-K-G(SEQIDNO:19)
[0084]F-Q-ff-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-L-R-R-ff-G(SEQIDNO:20)
[0085]F-R-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-Q-G(SEQIDNO:25)
[0086]F-ff-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-L-S-R-R-R-R-G(SEQIDNO:31)
[0087]F-ff-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-N-S-R-R-R-R-G(SEQIDNO:32)
[0088]F-ff-ff-K-K-A-M-K-K-V-K-G-T-R-R-R-R-G(SEQIDNO:34)[0089]以及上述肽的功能等效變體。
[0090]根據(jù)本發(fā)明所述的肽優(yōu)選地具有長(zhǎng)度為12至100個(gè)氨基酸殘基，例如優(yōu)選地長(zhǎng)度為12至50個(gè)氨基酸殘基，或長(zhǎng)度為12至30個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度，例如更優(yōu)選地長(zhǎng)度為12至約25個(gè)氨基酸殘基，例如最優(yōu)選地長(zhǎng)度為12至20個(gè)氨基酸殘基，例如12、13、14、15、16、
17、18、19或20個(gè)氨基酸殘基。
[0091]根據(jù)本發(fā)明的肽包含標(biāo)準(zhǔn)20種基因編碼的氨基酸。其還可以包含一種或多種氨基酸為與天然的L型相比的相對(duì)應(yīng)的D型立體異構(gòu)體。
[0092]在說(shuō)明書中，單字母或三字母符號(hào)用于表示氨基酸。
[0093]這些符號(hào)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，具有以下含義:A=Ala=丙氨酸，C=Cys=半胱氨酸，D=Asp=天冬氨酸，E=Glu=谷氨酸，F(xiàn)=Phe=苯丙氨酸，G=Gly=甘氨酸、I=Ile=異亮氨酸，K=Lys=賴氨酸,M=Met=蛋氨酸,N=Asn=天冬酰胺，P=Pro=脯氨酸，Q=Gln=谷氨酰胺，R=Arg=精氨酸，S=Ser=絲氨酸，T=Thr=蘇氨酸，V=Val=繳氨酸，W=Trp=色氨酸。
[0094]小寫字母用來(lái)指定相對(duì)應(yīng)的D-氨基酸。
[0095]根據(jù)本發(fā)明所述肽的功能等效變體可以包括插入或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸，例如I至5個(gè)插入或刪除，1、2、3、4或5個(gè)插入或刪除。
[0096]根據(jù)本發(fā)明所述肽的功能等效變體還可以包括替換。替換可以是保守的或非保守的。保守的替換是同一類(例如酸性氨基酸、堿性氨基酸等)中的一個(gè)氨基酸被同一類中的另一個(gè)氨基酸替換。例如一個(gè)疏水性氨基酸可以替換為另一個(gè)疏水性氨基酸，例如，Trp可以替換Lue。帶正電荷的氨基酸替換為另一個(gè)正電荷氨基酸，例如Arg可以替換Lys，例如I至5個(gè)替換，例如1、2、3、4 或5個(gè)替換。
[0097]圖1示例說(shuō)明氨基酸的不同分類。
[0098]根據(jù)本發(fā)明所述肽的功能等效變體也可以包括其他非天然的氨基酸，只要多肽保留所需的功能屬性。這種非天然氨基酸可以包括α，α-雙取代氨基酸、N-烷基氨基酸或其它模仿特定天然氨基酸的變體。
[0099]例如，根據(jù)本發(fā)明所述肽的功能等效變體中，賴氨酸(K/Lys)可優(yōu)選地是被Dap(二氨基丙酸)、Dab (2，4-二氨基丁酸)、Orn (鳥氨酸)或Hyl (5-羥基賴氨酸)替換，精氨酸(R/Arg)可優(yōu)選地被Har (高精氨酸)替換，丙氨酸(A/Ala)可優(yōu)選地被Aib ( α -氨基異丁酸)或Abu (2-氨基丁酸)替換，纈氨酸(V/Val)可優(yōu)選地被Nva (正纈氨酸)或Iva (異纈氨酸)替換，亮氨酸(L/Leu)可優(yōu)選地被Nle (正亮氨酸)或Cha (3_環(huán)己烷丙氨酸)替換，絲氨酸(S/Ser)可優(yōu)選地被Hse (高絲氨酸)替換，半胱氨酸(C/Cys)可優(yōu)選地被Hcy (高半胱氨酸)替換，組氨酸(H/His)可優(yōu)選地被Hhs (高組氨酸)或3-MH (3-甲基組氨酸)替換，苯丙氨酸(F/Phe)可優(yōu)選地被Phg (2-苯甘氨酸)替換、脯氨酸(Ρ/Ρι?)可優(yōu)選地被Hyp(4-羥基脯氨酸)替換。
[0100]因此，所述肽的功能等效變體的肽是相比于選自如下肽的肽具有超過(guò)70%序列一致性的的肽，例如超過(guò)75%序列一致性，優(yōu)選地超過(guò)80%序列一致性例如超過(guò)85%序列一致性，最優(yōu)選地超過(guò)90%序列一致性例如超過(guò)93、94、95、96、97、98或99%序列一致性
[0101]R-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-F-H-S-Y-R-R-M-G(SEQ ID NO:21)
[0102]K-Q-ff-K-R-ff-M-R-K-V-F-V-S-L-R-R-V-G(SEQ ID NO:22)
[0103]R-Q-ff-K-R-V-M-R-K-V-F-G-S-R-ff-ff-R-G(SEQ ID NO:23)[0104]K-Q-W-K-R-M-M-R-K-V-F-S-V-R-R-W-F-L(SEQ ID NO:24)
[0105]F-R-Q-W-K-R-W-M-R-K-V-F-H-S-W-R-R-W(SEQ ID NO:27)
[0106]F-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:6)
[0107]W-F-Q-W-K-R-A-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:7)
[0108]f-W-W-K-R-A-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:8)
[0109]F-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-K-K-K-K-G(SEQ ID NO:19)
[0110]F-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-L-R-R-W-G(SEQ ID NO:20)
[0111]F-R-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-Q-G(SEQ ID NO:25)
[0112]f-W-W-K-R-A-M-R-K-V-R-L-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:31)
[0113]f-W-W-K-R-A-M-R-K-V-R-N-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:32)
[0114]f-W-W-K-K-A-M-K-K-V-K-G-T-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:34)
[0115]兩個(gè)氨基酸序列之間的同源性的百分比如下進(jìn)行確定。首先，將氨基酸序列與例如SEQ ID NO:1相比較，使用BLAST2Sequences程序(BI2seq)，所述程序來(lái)自包含BLASTN的2.0.14版本和BLASTP的2.0.14版本的獨(dú)立版本BLASTZ。所述獨(dú)立版本的BLASTZ可從美國(guó)政府的國(guó)家中心生物技術(shù)信息網(wǎng)站ncb1.nlm.nih.gov獲得。解釋如何使用BI2seq程序的使用說(shuō)明可以在BLASTZ附 帶的自述文件中找到。BI2seq使用BLASTP算法來(lái)對(duì)兩個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比較。要比較兩個(gè)氨基酸序列，BI2seq的選項(xiàng)設(shè)定如下:_i設(shè)置為含有用于比較的第一個(gè)氨基酸序列的文件(例如，C:\seql.txt)；-j設(shè)置為含有用于比較的第二個(gè)氨基酸序列的文件(例如，C:\seq2.txt)；-p設(shè)置為blastp ;_o設(shè)置為任何所需的文件名稱(例如，C:\output.txt);并且所有其他選項(xiàng)保留為默認(rèn)設(shè)置。例如,下面的命令可以用于生成包含兩個(gè)氨基酸序列之間比較的輸出文件:C:\BI2seq_i c:\seqL txt-j c:\seq2.txt-p blastp-o c:\output.txt。如果這兩個(gè)被比較的序列具有同源性,那么指定的輸出文件將同源區(qū)域呈現(xiàn)為對(duì)齊序列。如果兩個(gè)被比較的序列不具有同源性，那么指定的輸出文件將不呈現(xiàn)對(duì)齊的序列。一旦對(duì)齊，匹配項(xiàng)的數(shù)量通過(guò)對(duì)兩個(gè)序列中呈現(xiàn)的相同核苷酸或氨基酸殘基的位點(diǎn)的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)決定。
[0116]—致性百分比是通過(guò)將匹配項(xiàng)的數(shù)量除以上述被鑒別序列的序列長(zhǎng)度然后將上述結(jié)果乘以100來(lái)決定的。例如，如果一個(gè)序列相比于SEQ ID NO:1所示序列(SEQ ID NO:1所示序列的長(zhǎng)度是18)并且匹配項(xiàng)的數(shù)目為16，那么所述序列對(duì)于SEQ ID NO:1所示序列具有89%—致性百分比(B卩16 + 18*100=89)。
[0117]此外，根據(jù)本發(fā)明所述的肽融合到其他多肽例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)A、寡聚組氨酸標(biāo)簽，用以簡(jiǎn)單化純化，或融合到被抗體識(shí)別的表位例如Myc標(biāo)簽表位，也涵蓋在本發(fā)明。
[0118]本發(fā)明也包括含有其他所需特征的融合，所述的特征例如有助于檢測(cè)或分離肽，或者促進(jìn)肽的細(xì)胞攝取。這些融合伴侶的實(shí)例為生物素部分、鏈霉親和素部分、放射性部分、熒光部分像小熒光團(tuán)或綠色熒光蛋白GFP熒光團(tuán)、免疫原性的標(biāo)簽、能促進(jìn)細(xì)胞攝取肽的親脂性分子或多肽結(jié)構(gòu)域。
[0119]根據(jù)本發(fā)明所述肽的功能等效變體還可以包括化學(xué)修飾或衍生的氨基酸，例如由聚乙二醇化、酰胺化、酯化、?；⒁阴；?或烷基化反應(yīng)。
[0120]存在著附加PEG的不同策略，并應(yīng)包括在內(nèi)。例如，PEG可以連接到N-末端的氨基上，或者直接或通過(guò)使用Y-氨基丁酸作為連接子連接到具有反應(yīng)活性的氨基或羥基的氨基酸殘基(Lys、His、Ser> Thr和Tyr)。PEG還可以偶聯(lián)到羧基(Asp、Glu、C-終端)或巰基(Cys)。
[0121]根據(jù)本發(fā)明所述肽的功能等效變體還可以包括通過(guò)與功能側(cè)鏈的反應(yīng)產(chǎn)生的氨基酸的化學(xué)衍生物。這種衍生分子包括其中自由氨基已衍生形成胺鹽酸鹽、對(duì)甲苯磺?；?、羧基苯甲酰氧基、叔丁氧羰基、氯乙?；蚣柞；姆肿?。自由羧基可衍生形成鹽、甲基和乙基酯或其他類型的酯類和酰肼。自由羥基可衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。
[0122]根據(jù)本發(fā)明所述肽的功能等效變體還可以包括所述肽的類肽變體。類肽是模仿肽的構(gòu)象和特定特征的化合物。例如，類肽包括具有反向(-C0-NH-)連接的肽。此外，類肽包括氨基酸殘基通過(guò)Y (CH2NH)-鍵連接來(lái)取代常規(guī)的酰胺連接的變體。而且，類肽也包括歐米茄-氨基酸，其中的氨基和羧基被不同長(zhǎng)度的多聚亞甲基單元分隔。
[0123]根據(jù)本發(fā)明所述肽可以包括修飾，例如酰胺化、氨基末端?；?例如乙?；驇€基乙酸酰胺)、末端羥基酰胺化(例如與氨或甲胺)，以及肽的N-或C-末端區(qū)域被封閉以幫助降低外源蛋白水解消化的易感性的其他末端修飾。進(jìn)一步，通過(guò)的N-末端的乙酰化和C-末端的酰胺化，將肽在末端去電荷。假設(shè)受體結(jié)合LF的相應(yīng)序列(其中沒(méi)有N-和C-末端電荷)，加帽的肽應(yīng)該結(jié)合得更好，因?yàn)榧用钡碾谋任醇用钡碾脑谶@方面更類似于天然蛋白質(zhì)。
[0124]根據(jù)本發(fā)明所述肽可以C-末端加色氨酸標(biāo)簽以增加效力，正如Pasupuleti等人Biochim Biophys Acta2009，1790:800-8 所描述。
[0125]進(jìn)一步，如果肽中存在半胱氨酸殘基，其可以被替換為乙酰胺基甲基-半胱氨酸。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明所述肽可 以是環(huán)形，所述環(huán)形通過(guò)序列中兩個(gè)半胱氨酸之間的二硫鍵獲得。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明所述肽可以包括形成的內(nèi)酰胺。
[0126]根據(jù)本發(fā)明所述肽適用于治療和/或預(yù)防感染、炎癥、腫瘤、疼痛、傷口和傷疤。此處所用術(shù)語(yǔ)"治療"指治愈、逆轉(zhuǎn)、削弱、緩解、減至最小化、抑制或終止疾病狀態(tài)、疾病進(jìn)展或其他異常病況的有害影響，并且此處所用術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"指減至最小化、減少或抑制發(fā)展成疾病狀態(tài)、疾病進(jìn)展或有其他異?；蛴泻Σr的風(fēng)險(xiǎn)。
[0127]可用根據(jù)本發(fā)明所述肽或藥品和醫(yī)療設(shè)備治療的感染包括由各種病原體引起的感染，所述病原體如細(xì)菌、病毒、真菌等。根據(jù)本發(fā)明所述肽可用于包被/處理不同的藥品和醫(yī)療設(shè)備產(chǎn)品以減少/預(yù)防設(shè)備相關(guān)的感染。
[0128]也可能治療不同類型的炎癥。炎癥是復(fù)雜的現(xiàn)象，其顯著表現(xiàn)為組織和器官的異常的“發(fā)紅”和腫脹、受影響部位的疼痛和發(fā)熱、毛細(xì)血管擴(kuò)張、白細(xì)胞浸潤(rùn)等等。炎癥主要由暴露于細(xì)菌和其他有害試劑以及物理?yè)p傷引起。過(guò)敏性炎癥是多個(gè)功能喪失或醫(yī)學(xué)病況的一種重要的病理生理特征，其包括過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性鼻炎和多種眼部過(guò)敏性疾病。
[0129]因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療和/或預(yù)防感染、炎癥、腫瘤、疼痛、傷口和傷疤的方法，其中將有效量的本發(fā)明所述肽及其功能等效變體施用于患者。所述肽可配制成用于口服地、全身性地、非腸道地、局部地(localIy)或外用地(topicalIy)施用。進(jìn)一步，所述肽可包含在食品中，或包含在嬰兒配方食品中。
[0130]進(jìn)一步，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于治療和/或預(yù)防感染、炎癥、腫瘤、疼痛、傷口和傷疤的本發(fā)明所述的肽。所述肽可配制成用于口服施用、全身性施用、非腸道施用、局部施用或外部施用。進(jìn)一步，所述肽可包含在食品中，或包含在嬰兒配方食品中。[0131]進(jìn)一步，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了使用本發(fā)明所述肽生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防感染、炎癥、腫瘤、疼痛、傷口和傷疤的藥品和醫(yī)療設(shè)備。所述藥品可配制成用于口服施用、全身性施用、非腸道施用、局部施用或外部使用。進(jìn)一步，所述藥品/醫(yī)療設(shè)備可包含在食品中，或包含在嬰兒配方食品中。
[0132]炎癥有多種形式并由各種不同的細(xì)胞因子和其他化學(xué)信號(hào)所調(diào)節(jié)。這些炎癥調(diào)節(jié)子包括腫瘤壞死因子- a (TNF- α )、白介素-1 (IL-1)、白介素_4(IL_4)、白介素_5(IL_5)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、干擾素-Y (IFN-Y )和各種集落刺激因子(CSFs)。
[0133]通過(guò)抑制感染和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，所述肽適用于治療/預(yù)防傷口與傷痕形成。如上文所述，根據(jù)本發(fā)明所述肽也適用于腫瘤治療。
[0134]根據(jù)本發(fā)明所述肽既可以按其本身來(lái)使用也可包含在醫(yī)療設(shè)備、藥品或藥物組合物中使用。根據(jù)本發(fā)明所述藥品或藥物組合物可以還包括用于促進(jìn)生產(chǎn)所述藥物制備物或施用所述制備物的物質(zhì)。所述物質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如藥學(xué)可接受的佐劑、載體和防腐劑。
[0135]因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了藥物組合物，其包括根據(jù)本發(fā)明所述的肽。
[0136]本發(fā)明的另一方面提供了包括根據(jù)本發(fā)明所述的肽的藥物組合物，用于治療和/或預(yù)防感染、炎癥、腫瘤、疼痛、傷口和傷疤。
[0137]根據(jù)本發(fā)明所述肽可配制成用于口服施用、全身性施用、非腸道施用、局部施用或外部施用。
[0138]根據(jù)本發(fā)明所述肽、藥品、醫(yī)療設(shè)備和藥物組合物可通過(guò)口服地、全身性地、非腸道地、局部地或外部地施用于患者。
[0139]此處所用術(shù)語(yǔ)〃患者〃涉及任何有風(fēng)險(xiǎn)或者正在經(jīng)受疾病狀態(tài)、疾病進(jìn)展或者其他異?；蛴泻Σr的人。
[0140]全身性施用適用于例如治療尿路感染、結(jié)腸炎和腫瘤。全身性施用可通過(guò)口腔、鼻、肺、口咽、靜脈、動(dòng)脈、腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、透皮、栓劑(包括直腸)或其它被本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的途徑。
[0141]局部施用適用于例如治療皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染和炎癥，呼吸道感染，所有的粘膜感染和炎癥等等。局部施用可通過(guò)外部、外皮、口腔、鼻、陰道、眼部、耳、肺或口咽途徑進(jìn)行攝取。對(duì)于治療局部感染或炎癥，根據(jù)本發(fā)明所述肽或藥品或醫(yī)療設(shè)備可以包含于凝膠、霜?jiǎng)?、軟膏、溶液或糊劑、吸入粉?溶液，耳或眼溶液/懸液/軟膏。
[0142]根據(jù)本發(fā)明所述的方法中，有效量的根據(jù)本發(fā)明所述肽施用于患者。此處所用術(shù)語(yǔ)“有效量”涉及足以治療或預(yù)防疾病狀態(tài)、疾病進(jìn)展、或者其他異常或有害病況的用量。
[0143]根據(jù)本發(fā)明所述的肽、藥品、醫(yī)療設(shè)備和方法特別適用于治療和/或預(yù)防尿路感染和結(jié)腸炎，皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染與炎癥，外耳、耳道、內(nèi)耳和眼睛以及呼吸道系統(tǒng)的感染和炎癥，慢性和急性傷口，但多種其他炎癥和傳染性疾病也可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療，例如炎癥性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病、HIV-1病毒引起的病況、CMV病毒引起的病況、以及真菌引起的病況，所述真菌例如像白色念珠菌和克柔念珠菌的念珠菌種，黑曲霉以及新型隱球菌。此列表不限制本發(fā)明的范疇。[0144]根據(jù)本發(fā)明所述的肽、藥品、醫(yī)療設(shè)備和方法也非常適用于通過(guò)降低患者發(fā)生炎癥和傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)防性醫(yī)療，所述患者具有增高的發(fā)生上述并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0145]本發(fā)明所述肽適用于抗炎和免疫調(diào)節(jié)治療，舉例說(shuō)明但不是限于:
[0146]I) 一般來(lái)說(shuō)，治療和/或預(yù)防炎癥以及/或者炎癥造成的醫(yī)學(xué)病況，具體來(lái)說(shuō)，
[0147]2a)腸；克隆氏癥、結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎，
[0148]2b)關(guān)節(jié)；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病、肌肉局部紊亂包括肌肉痙攣、肌肉撕裂、肌肉損傷、肌肉拉傷、肌肉扭傷，
[0149]2c)皮膚科；銀屑病、濕疹(excema)、皮炎、痤瘡，
[0150]2d)心臟；心包炎、心內(nèi)膜炎、心臟功能不全，
[0151]2e)疼痛；(進(jìn)一步特指在2f以下)，
[0152]2f)神經(jīng)系統(tǒng)；阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化癥、腕管綜合征、椎間盤突出、頸椎rhizopathy、貝爾氏麻痹、急性脊髓損傷、脊髓壓迫、椎管狹窄癥、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、病毒性腦炎、病毒性腦膜炎、美尼爾氏綜合癥、脊髓灰質(zhì)炎和嬰兒麻痹并發(fā)癥、慢性炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)病、多發(fā)性神 經(jīng)病、三叉神經(jīng)痛、慢性癲癇疾病，
[0153]2g)感覺(jué)器官；青光眼，
[0154]2h)粘膜表面；(化療/放射治療造成的炎癥)，
[0155]2i)過(guò)敏，
[0156]2j)自身免疫性疾病。
[0157]本發(fā)明所述肽是進(jìn)一步適用于預(yù)防和/或治療與病況和手術(shù)相關(guān)聯(lián)的傷口和/或傷疤，舉例說(shuō)明但不是限于:
[0158]3a)外科手術(shù)，針對(duì)各種組織例如皮膚、肌肉、肌腱、神經(jīng)組織、血管，以及針對(duì)人體不同部位例如眼睛、耳朵、聲帶、手、脊髓、腹腔內(nèi)、胸腔內(nèi)、顱腔、口腔、婦科手術(shù)、子宮內(nèi)膜異位、包皮，
[0159]3b)痤瘡。
[0160]3c)增生性瘢痕及瘢痕疙瘩，
[0161]3d)胸膜炎，
[0162]3e)腹膜透析，
[0163]3f)急性和慢性傷口。
[0164]本發(fā)明所述肽進(jìn)一步被認(rèn)為具有抗血管生成的作用并且因此適用于治療和/或預(yù)防:
[0165]4a)癌癥，
[0166]4b)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0167]發(fā)明所述肽具有抗感染作用，并適用于預(yù)防和/或治療:
[0168]5a)抗菌作用:
[0169]上部和下部呼吸道(扁桃體炎、鼻竇炎、肺炎、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化等)
[0170]眼部感染(如結(jié)膜炎)
[0171]尿路感染
[0172]性傳染疾病(包括避孕套的抗微生物涂料)
[0173]生殖道(包括陰道病、陰道炎、宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、PID)[0174]胃腸道感染(從GI引發(fā)的全身性感染)
[0175]中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染
[0176]皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)的感染例如二次感染的創(chuàng)傷性病灶，其包括外科手術(shù)部位感染、蜂窩組織炎或膿腫，二次感染的皮膚病，膿皰瘡，以及癰或癤(包括革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌、葡萄球菌、例如MRSA、鏈球菌、醫(yī)院內(nèi)感染、傷口、燒傷)、肌肉、關(guān)節(jié)(如化膿性關(guān)節(jié)炎)、骨和造血系統(tǒng)感染涉及到口、眼、內(nèi)耳和外耳及耳道，包括建立牙周炎、牙齦炎。
[0177]5b)抗病毒作用:
[0178]上部和下部呼吸道
[0179]性傳播疾病
[0180]胃腸道感染(GI引發(fā)的全身性感染)
[0181]中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染
[0182]5c)抗真菌作用:
[0183]上部和下部呼吸道(如口瘡、粘膜與皮膚念珠菌感染)
[0184]泌尿生殖道(例如外陰陰道念珠菌感染、龜頭炎)
[0185]胃腸道感染(GI引發(fā)的全身性感染)
[0186]中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染
[0187]皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)的感染(例如粘膜與皮膚念珠菌感染)、皮膚病和濕疹。
[0188]最優(yōu)選地，本發(fā)明所述肽用于治療、防治和/或預(yù)防的膿皰瘡、燒傷傷口、被感染的擦傷、被感染的撕裂傷、表皮脫落、丹毒、蜂窩組織炎、膿腫、癤、癰、被縫合固定的傷口、外科手術(shù)部位感染，二次感染皮膚病:特應(yīng)性皮炎、銀屑病、過(guò)敏性接觸性皮炎、動(dòng)物咬傷、導(dǎo)管相關(guān)感染。
[0189]根據(jù)本發(fā)明所述肽、藥品和方法可以單獨(dú)使用，彼此的組合使用或與常規(guī)療法組合使用。
[0190]根據(jù)本發(fā)明，也可以將所述肽以有效量包含在任意種類的食物和飲料中，旨在降低患者的感染和/或炎癥，所述患者因?yàn)闈撛诩膊?、低的出生重量或醫(yī)學(xué)治療導(dǎo)致上述病況的風(fēng)險(xiǎn)增高。例如，也可以將所述肽以有效量包含在嬰兒配方食物中，旨在抑制細(xì)菌的有害作用，如在嬰兒中由細(xì)菌、病毒或真菌引起的炎癥導(dǎo)致的重量損失。根據(jù)本發(fā)明所述肽用于食品中時(shí)，例如對(duì)于營(yíng)養(yǎng)目的，特別優(yōu)選地使用自然來(lái)源的肽。 [0191]因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明所述肽具有抗微生物的作用，其也可在不同食品和藥品中用作防腐劑，所述藥品例如凝膠、霜?jiǎng)④浉?、糊劑、溶液、乳液等?br> [0192]本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步解釋。這些實(shí)施例僅用來(lái)實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明并且不應(yīng)該被認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0193]圖1.不同類型氨基酸的示意圖，顯示其在疏水性、大小和荷電方面的相似性。
[0194]圖2.肽SEQ ID NO:1，即KCFQWQRNMRKVR的一部分的對(duì)應(yīng)螺旋的頂視圖。
[0195]圖3.顯示肽的聚類的散點(diǎn)圖。根據(jù)其理化性質(zhì)來(lái)繪制表示肽。具有TNF-α抑制活性(40 μ M肽濃度)的肽可呈現(xiàn)在兩個(gè)集群中:集群A和B。
[0196]圖4.肽265(A)對(duì)大鼠上被感染的切除傷口的細(xì)菌菌落形成的劑量依賴性的作用。傷口被MRSA(CCUG41879)感染并用溶于水中的相應(yīng)肽對(duì)其治療，濃度在0.1、0.5和2毫克/毫升，表現(xiàn)出劑量依賴性的細(xì)菌計(jì)數(shù)的顯著減少。結(jié)果表示為相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)細(xì)菌存活(％) 土SEM (n=15個(gè)傷口)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)估算。*=p〈0.05，**=p<0.01，***=p<0.001。
[0197]圖5.肽265(A)對(duì)豬皮膚上被感染傷口的細(xì)菌菌落形成的劑量依賴性的作用。傷口被溶于PBS/血清(50/50)中的金黃色葡萄球菌感染并用溶于水中的相應(yīng)肽對(duì)其治療，濃度在0.1,0.5和2毫克/毫升，表現(xiàn)出劑量依賴性的細(xì)菌計(jì)數(shù)的顯著減少。結(jié)果表示為相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)細(xì)菌存活(％) 土SEM (n=10個(gè)傷口)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)估算。*=ρ〈0.05, **=ρ〈0.01, ***=ρ〈0.001。
實(shí)施例
[0198]實(shí)施例L狀篩詵I
[0199]表1所示乳鐵蛋白衍生肽已經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)和檢測(cè)。有活性的肽已被鑒定。
[0200]新的肽的變體是基于具有與SEQ ID NO:1相似序列的肽的已測(cè)量的抗炎和抗微生物活性進(jìn)行設(shè)計(jì)。此外，同時(shí)注意了上述肽的相應(yīng)序列的結(jié)構(gòu)方面的考慮。實(shí)際上，這意味著保持和增強(qiáng)肽的螺旋性。肽的新變體是通過(guò)增加正電荷和肽的疏水區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)的。因而，增加了肽的兩親性特征(圖2)?；谛碌脑O(shè)計(jì),新的肽以PEPscreen庫(kù)(Sigma)的方式排序并檢測(cè)了其抗炎和抗微生物活性。
[0201]表1.篩選I中的已檢測(cè)肽的列表
[0202]
【權(quán)利要求】
1.肽，其包含至少如下的氨基酸序列Xl-X2-ff-X4-X5-X6-M-X8-K-V-Xll-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO:2)其中Xl是F、K或RX2是Q、W或RX4是K或RX5是R或KX6 是N、A、V、W或 RX8是R或KXll 是 R、F 或 KX12 是G、S、N、V、L 或HX13 是 S、G、T 或 VX14 是 R、L、Y、W或 KX15 是 R、K 或 W X16是R、K或W，以及X17 是 R、G、Q、V、M、F、W或 K以及上述肽的功能等效變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其包含至少如下的氨基酸序列Xl-X2-ff-K-X5-X6-M-X8-K-V-Xll-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO:3)其中Xl是F、K或RX2是Q或WX5是R或KX6 是 N、A、V 或 WX8是R或KXll 是 R、F 或 KX12 是 V、L 或NX13 是 S、G、T 或 VX14 是 R、L、Y、W或 KX15 是 R、K 或 WX16是R、K或W，以及X17 是 R、F、W 或 K以及上述肽的功能等效變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其包含選自如下氨基酸序列的至少一種氨基酸序列R-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-F-H-S-Y-R-R-M-G (SEQ ID NO:21)K-Q-ff-K-R-ff-M-R-K-V-F-V-S-L-R-R-V-G (SEQ ID NO:22)R-Q-ff-K-R-V-M-R-K-V-F-G-S-R-ff-ff-R-G (SEQ ID NO:23)K-Q-ff-K-R-M-M-R-K-V-F-S-V-R-R-ff-F-L (SEQ ID NO:24)F-R-Q-ff-K-R-ff-M-R-K-V-F-H-S-ff-R-R-ff (SEQ ID NO:27)F-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G (SEQ ID NO:6)
W-F-Q-W-K-R-A-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G (SEQ ID NO:7)
F-W-W-K-R-A-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G (SEQ ID NO:8)
F-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-K-K-K-K-G (SEQ ID NO:19)
F-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-L-R-R-W-G (SEQ ID NO:20)
F-R-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-Q-G (SEQ ID NO:25)
F-W-W-K-R-A-M-R-K-V-R-L-S-R-R-R-R-G (SEQ ID NO:31)
F-W-W-K-R-A-M-R-K-V-R-N-S-R-R-R-R-G (SEQ ID NO:32)
F-W-W-K-K-A-M-K-K-V-K-G-T-R-R-R-R-G (SEQ ID NO:34) 和上述肽的功能等效變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其選自如下肽 R-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-F-H-S-Y-R-R-M-G(SEQ ID NO:21) K-Q-ff-K-R-ff-M-R-K-V-F-V-S-L-R-R-V-G(SEQ ID NO:22) R-Q-ff-K-R-V-M-R-K-V-F-G-S-R-ff-ff-R-G(SEQ ID NO:23) K-Q-ff-K-R-M-M-R-K-V-F-S-V-R-R-ff-F-L(SEQ ID NO:24) F-R-Q-ff-K-R-ff-M-R-K-V-F-H-S-ff-R-R-ff(SEQ ID NO:27) F-Q-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:6) ff-F-Q-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:7) F-ff-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:8) F-Q-W-K-R-R-M-R- K-V-R-G-S-K-K-K-K-G(SEQ ID NO:19) F-Q-ff-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-L-R-R-ff-G(SEQ ID NO:20) F-R-W-K-R-R-M-R-K-V-R-G-S-R-R-R-Q-G(SEQ ID NO:25) F-ff-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-L-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:31) F-ff-ff-K-R-A-M-R-K-V-R-N-S-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:32) F-ff-ff-K-K-A-M-K-K-V-K-G-T-R-R-R-R-G(SEQ ID NO:34) 和上述肽的功能等效變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的肽，其中羧基末端的自由COOH已轉(zhuǎn)化為C0NH2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的肽，其中氨基末端的自由NH2基團(tuán)已轉(zhuǎn)化為酰胺 CH3COML
7.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的肽，其中氨基酸Cys，如果存在，已被乙酰胺基甲基半胱氨酸替換。
8.包含根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的肽的藥物組合物。
9.包含根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，用于治療和/或預(yù)防感染、炎癥、腫瘤、疼痛、傷口和傷疤。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，用于治療、防治和/或預(yù)防的膿皰瘡、燒傷傷口、被感染的擦傷、被感染的撕裂傷、表皮脫落、丹毒、蜂窩組織炎、膿腫、癤、癰、被縫合固定的傷口、外科手術(shù)部位感染，二次感染皮膚病:特應(yīng)性皮炎、銀屑病、過(guò)敏性接觸性皮炎、動(dòng)物咬傷、導(dǎo)管相關(guān)感染。
11.根據(jù)權(quán)利要求8到10中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，配制成用于口服施用、全身性施用、非腸道施用、局部施用或外部施用。
12.包含根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的肽的食品。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的肽，用作藥劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的肽，用于治療和/或預(yù)防感染、炎癥、腫瘤、疼痛、傷口和傷疤。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的肽，配制成用于口服施用、全身性施用、非腸道施用、局部施用或外部施 用。
【文檔編號(hào)】A61K38/40GK103476792SQ201280006521
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2012年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月26日
【發(fā)明者】M·馬拉普, C·比約恩, V·舍斯特蘭德, B·瓦爾澤, B·斯文松 申請(qǐng)人:佩加馬公司