專利名稱：新的癌基因、從其衍生的重組蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的來自人的癌基因，該癌基因參與了人宮頸癌的發(fā)生，以及從該癌基因衍生的重組蛋白及其在醫(yī)學應(yīng)用中的用途。
背景技術(shù)：
已有許多文獻報道了染色體的不穩(wěn)定性與癌癥的發(fā)生相關(guān)。此外，最近已經(jīng)報道，在控制細胞周期中G2/M期檢查點的分子的缺陷導致了染色體的不穩(wěn)定。然而，因為在許多癌細胞中，在細胞中控制檢查點的分子的基因缺陷并不能被經(jīng)常地觀察到，因此誘導染色體不穩(wěn)定的機理從許多方面來說尚不清楚，所述染色體不穩(wěn)定性與癌癥的發(fā)生有著至關(guān)重要的關(guān)系。
宮頸癌的發(fā)生中包括了人乳頭瘤病毒(HPV)如HPV-16或HPV-18型的感染，這一點已經(jīng)廣為人知。在宮頸癌組織中，已經(jīng)觀察到的HPV感染的頻率在90％或者以上。在由HPV感染誘導的宮頸癌的發(fā)生機理中，病毒的E6和E7基因產(chǎn)物扮演了重要的角色。具體來說，已經(jīng)知道E6加速了p53腫瘤抑制蛋白降解的過程，而E7阻斷了Rb基因的產(chǎn)物pRB(成視網(wǎng)膜細胞瘤)腫瘤抑制蛋白的抑癌活性，這兩個步驟造成了腫瘤發(fā)生。但是，被HPV感染激活的特異性的致癌蛋白還未被鑒別。尤其是E6和E7，HPV的病毒基因產(chǎn)物，誘導了染色體的不穩(wěn)定性并使細胞癌變(Carcerize)，但是與其直接相關(guān)的機理的詳細情況在許多方面還基本上是未知的。因此，為了能夠治療宮頸癌，鑒別出作為HPV的靶的致癌蛋白及編碼它的癌基因是非常重要的。宮頸癌是從癌前期狀態(tài)，即發(fā)育異常(宮頸鱗狀上皮細胞的發(fā)育異常)發(fā)展為侵入性的癌癥。在某些情況下，疾病可以保持在發(fā)育異常階段而不發(fā)展為癌癥。在另一方面，也有相當多情況下，發(fā)育異?？梢院芸斓匕l(fā)展為晚期癌癥。鑒于這樣的情況，進行更精確的癌癥診斷以鑒別與宮頸癌發(fā)生直接相關(guān)的分子，可能是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，在HPV感染宮頸上皮細胞、經(jīng)過一種癌前期狀態(tài)、即發(fā)育異常誘導侵入性癌癥發(fā)生的過程中，其直接的起源應(yīng)該被認為是這樣一種機制，即抑制一些癌基因的表達的p53腫瘤抑制蛋白或pBR腫瘤抑制蛋白的表達抑制活性被破壞了，并且這種破壞導致癌基因進入了高水平表達的狀態(tài)。因此，必須首先鑒別癌基因的完整的核苷酸序列及其編碼的致癌蛋白，這將開辟一條道路，以發(fā)展一些手段，用于抑制致癌蛋白的生物化學功能，并且進一步用于阻斷由致癌蛋白推進的癌變的機制。
此外，鑒定癌基因的完整的核苷酸序列及其編碼的致癌蛋白的氨基酸序列，可以允許我們生產(chǎn)核酸探針以檢測從癌基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的表達，或者利用其重組致癌蛋白產(chǎn)生針對致癌蛋白的特異性抗體。換句話說，它使我們可以開發(fā)出利用核酸探針或特異性抗體的診斷方法，用于診斷在子宮頸中經(jīng)由HPV感染引起的癌前期狀態(tài)、即發(fā)育異常發(fā)展到侵入性癌癥的過程中的早期階段。
為了解決上面的問題，本發(fā)明的一個目標是鑒別一個來自人類的新的癌基因的完整核苷酸序列及其編碼的致癌蛋白的氨基酸序列，它們在例如由HPV感染宮頸上皮細胞導致的宮頸癌中直接參與了癌變的機制，此外本發(fā)明還提供了編碼癌基因蛋白的肽鏈的全長多核苷酸，所述全長多核苷酸衍生自新的癌基因，可用于重組生產(chǎn)致癌蛋白，并提供由其重組生產(chǎn)的致癌蛋白的肽鏈。
為了解決上面的問題我們進行了廣泛的研究，最后發(fā)現(xiàn)并克隆了一個基因，它在宮頸癌細胞中當向其中加入環(huán)境激素時表達增加。我們的結(jié)論是，這個克隆的基因是一個癌基因，這是因為(1)該基因在癌細胞中高度表達；(2)宮頸癌由HPV感染引起，并且將E6和E7基因從HPV轉(zhuǎn)導到細胞中表達E6和E7蛋白能夠增加所述基因的表達；(3)p53蛋白抑制所述基因啟動子區(qū)的活性；(4)p53蛋白的缺失或突變在事實上參與了宮頸癌的發(fā)生；(5)所述基因的表達可以由一個雙鏈的干擾短鏈RNA(siRNA)所抑制以阻止腫瘤的生長，并且在經(jīng)過進一步的研究后，完成了本發(fā)明。
因此，根據(jù)本發(fā)明的癌基因多核苷酸是一個衍生自人的、參與了宮頸癌發(fā)生的新的癌基因多核苷酸，它包含了編碼氨基酸序列SEQ.ID.No.1的核苷酸序列。尤其是，它是一個多核苷酸，其中編碼氨基酸序列SEQ.ID.No.1的核苷酸序列是SEQ.ID.No.2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了在上述根據(jù)的本發(fā)明的癌基因多核苷酸的基礎(chǔ)上，通過重組生產(chǎn)的肽或其鹽。具體來說，本發(fā)明的重組肽是重組肽或其鹽，含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1或其部分氨基酸序列。尤其是，它可以是含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的重組致癌蛋白。本發(fā)明還提供了一個重組載體，含有編碼重組肽的多核苷酸，可用于制備該重組肽。例如，當目標是含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的本發(fā)明的重組致癌蛋白時，所述重組載體就是含有癌基因多核苷酸的重組載體，所述癌基因多核苷酸含有編碼氨基酸序列SEQ.ID.No.1的核苷酸序列，尤其是含有一個多核苷酸，其中編碼氨基酸序列SEQ.ID.No.1的核苷酸序列是SEQ.ID.No.2。
本發(fā)明還提供了使用所述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化細胞；例如，使用針對本發(fā)明的所述重組致癌蛋白的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化細胞。因此，生產(chǎn)本發(fā)明的重組肽或其鹽的過程是一個生產(chǎn)從本發(fā)明的癌基因衍生出的重組肽或其鹽的的過程，包括下列步驟培養(yǎng)上述的轉(zhuǎn)化細胞使得轉(zhuǎn)化細胞生產(chǎn)本發(fā)明的重組肽；以及收集從培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組肽。尤其是在優(yōu)選情況下，它可以是一個包含下列步驟的生產(chǎn)本發(fā)明的重組致癌蛋白的過程培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細胞，其中已經(jīng)轉(zhuǎn)化了全長的基因DNA以使轉(zhuǎn)化細胞生產(chǎn)本發(fā)明的重組致癌蛋白；以及收集從培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組致癌蛋白。
利用上述的本發(fā)明的重組肽，本發(fā)明提供了一個抗體的發(fā)明，它是使用重組肽作為免疫原而產(chǎn)生的特異性抗體。例如，本發(fā)明的抗體可以是一個對氨基酸序列SEQ.ID.No.1中623到1185區(qū)域的部分氨基酸序列表現(xiàn)出特異反應(yīng)性的抗體。
此外，本發(fā)明提供了一個含有所述特異性抗體的抗體試劑盒以進行抗原-抗體反應(yīng)，用于檢測含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的致癌蛋白或從致癌蛋白衍生的肽片段。此外，本發(fā)明提供了一個含有本發(fā)明的特異性抗體的診斷試劑盒，用于通過抗原抗體反應(yīng)檢測含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的致癌蛋白或從致癌蛋白衍生的肽片段。
本發(fā)明還提供了一個反義多核苷酸，含有與核苷酸序列SEQ.ID.No.2中的部分核苷酸序列互補的核苷酸序列，它是一個具有至少一段選自15到300堿基區(qū)域的DNA片段。此外，就根據(jù)本發(fā)明的探針雜交試劑盒而言，還提供了一個含有上述反義多核苷酸作為DNA探針的探針雜交試劑盒，可用于檢測含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2、其部分核苷酸序列的mRNA或由mRNA制備的cDNA。此外，本發(fā)明還提供了一個含有所述反義多核苷酸作為雜交探針的診斷試劑盒，通過探針雜交的方法，用于檢測含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA的表達，該mRNA被翻譯為含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的致癌蛋白。
在另一方面，本發(fā)明還提供了一個引物對，用于對含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的cDNA進行PCR擴增，引物對由如下核苷酸序列組成5’-TTGGATCCATGACATCCAGATTTGGGAAAACATACAGTAGG-3’；和5’-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCAATCACTCTAGA-3’，此外本發(fā)明還提供了一個引物對，用于對含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的cDNA的部分鏈進行PCR擴增，引物對由如下核苷酸序列組成5’-GAATTCATAGGCACAGCGCTGAACTGTGTG-3’；和5’-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCA-3’。
另外，至于雙鏈的短鏈干擾RNA的發(fā)明，本發(fā)明提供了一個雙鏈的短鏈干擾RNA，能夠在宮頸癌細胞中抑制含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA的表達，其中雙鏈的siRNA的核苷酸序列為CGGACTACCCTTAGCACAA。此外，它還可用于藥物組合物中以在宮頸癌細胞中抑制含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA的表達，從而阻止癌細胞的生長，所述藥物組合物含有本發(fā)明的所述雙鏈的短鏈干擾RNA。
附圖簡述

圖1顯示了報道的果蠅dWAPL和本發(fā)明的hWAPL之間的氨基酸序列的比較。
圖2顯示了本發(fā)明的hWAPL在位于C-末端一側(cè)的623到1185氨基酸的部分氨基酸序列中與dWAPL一致的或同源的氨基酸的比對。
圖3顯示了人的WAPL蛋白與小鼠的WAPL蛋白的氨基酸序列之間的極高的同源性。
圖4顯示了使用抗hWAPL-N抗體和抗hWAPL-C抗體對Saos-2細胞(第2、3道)和NIH3T3細胞(第1道)的抽提液的Western印跡分析結(jié)果。
圖5顯示了(A)Northern印跡以評估hWAPL蛋白在卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、子宮體癌和宮頸癌的癌細胞(T)與相應(yīng)的正常細胞(N)中相比的表達水平；(B)實時PCR的結(jié)果，以證實hWAPL基因在宮頸癌、子宮體癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、腎癌、結(jié)腸癌的癌細胞(T)與相應(yīng)的正常細胞(N)中相比的表達；以及(C)RT-PCR檢測在癌細胞(T)中從HPV衍生的E6/E7基因的mRNA的表達結(jié)果。
圖6顯示了(A)Western印跡，以證實由來自HPV16的E6和E7重組蛋白誘導的hWAPL蛋白的表達，以及在HDK1細胞中p53抑制蛋白的切割；以及(B)Western印跡，以證實E6和E7基因轉(zhuǎn)錄的抑制，p53抑制蛋白水平和BPV衍生的E2對hWAPL蛋白表達抑制的增加。
圖7顯示了(A)染色體的不穩(wěn)定性和多倍體的增加；以及(B)在HeLa細胞中由GFP-hWAPL融合蛋白的過量表達誘導的微核形成頻率的增加。
圖8顯示了在HeLa細胞中染色體的不穩(wěn)定性和由GFP-hWAPL融合蛋白的過量表達誘導的多核化頻率的增加。
圖9顯示了hWAPL蛋白誘導NIH3T3成纖維細胞的癌變，具體為(A)在培養(yǎng)HA-hWAPL 3T3細胞系中轉(zhuǎn)化灶結(jié)構(gòu)的形成；(B)在無胸腺小鼠注射HA-hWAPL 3T3細胞系的位點腫瘤的形成；(C)在腫瘤形成區(qū)HA-標記的hWAPL蛋白的過量表達；以及(D)癌變細胞中的異型有絲分裂。
圖10顯示了hWAPL siRNA在來自HPV16陽性宮頸癌的SiHa細胞中對細胞生長抑制效應(yīng)的評估結(jié)果，顯示為細胞數(shù)量(單位為×103，縱坐標)對轉(zhuǎn)化siRNA的時間(單位為小時，橫坐標)的作圖。
本發(fā)明的最佳實施方案下面將對本發(fā)明進行詳細描述。
假定染色體的不穩(wěn)定性在很大程度上參與了宮頸癌細胞中的癌變機制，我們搜索了作為染色體不穩(wěn)定性誘導因素的人源蛋白。我們特別搜索了在染色體不穩(wěn)定事件中具有很高潛力能夠誘導異倍性或等位基因形成的蛋白。
我們注意到，在來自動物中遺傳基因研究得最深入的果蠅的許多蛋白中，已報道dWAPL蛋白在減數(shù)分裂過程的分裂間期中是一個控制異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白。具體來說，我們發(fā)現(xiàn)，當?shù)鞍妆憩F(xiàn)的這種控制異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能在正常細胞的有絲分裂過程中表達時，偶爾可以誘導出異倍性或等位基因的形成。我們首先調(diào)查了對應(yīng)于這種dWAPL的蛋白是否實際上編碼在人基因組基因上?；趫蟮赖膁WAPL基因的核苷酸序列(GenBank登錄號No.U40214)，我們從GenBank中登記的作為人源的基因片段的cDNA片段中搜索顯示出顯著同源性的片段，并且選擇了含有與dWAPL基因相似的核苷酸序列的KIAA0261片段。
為了鑒定含有KIAA0261片段的全長的cDNA，我們在EST數(shù)據(jù)庫中搜索人源的表達標記的核苷酸序列，它可以是一個含有不翻譯部分的片段，該不翻譯部分被推測為位于KIAA0261片段5’-側(cè)的上游核苷酸序列，并且選擇了EST克隆BE410177、BF9516和BE257022。
我們使用5’-RACE方法參照EST克隆測定了位于KIAA0261片段5’側(cè)的上游核苷酸序列。此外，因為很有可能與dWAPL功能相同的蛋白實際上是在一個具有減數(shù)分裂過程的細胞中表達，我們使用了一個市售的cDNA文庫、即人睪丸cDNA試劑盒(Marathon-ReadyTMcDNAKit；Clontech Inc.)作為模板，克隆了含有KIAA0261片段的核苷酸序列和上面測定的位于5’-側(cè)的上游核苷酸序列的全長的cDNA。
實際的測序表明在克隆的全長cDNA中編碼區(qū)有3570個堿基對，推測對應(yīng)于一個具有1190個氨基酸的氨基酸序列。作為與dWAPL蛋白同源的人源蛋白，它被稱為“人WAPL(hWAPL)”，相應(yīng)的基因稱有WAPL基因全長cDNA的轉(zhuǎn)化子；在下述的實施例1中獲得的大腸桿菌DH5 pGEMhWAPL菌株，已經(jīng)保存在位于Chuo 6th，1-1-1，Higashi，Tsukuga，Ibaragi，305-8566的國立高等工業(yè)科學和技術(shù)研究所的國際專利物種貯藏所(國立生物科學和人類技術(shù)研究所)，原始保存日期為2003年1月7日，在布達佩斯公約之下的國際保藏管理局的保藏號為FERMBP-8269。
我們還證實了，作為hWAPL基因產(chǎn)物的hWAPL蛋白的表達可以使用雙鏈的短鏈干擾RNA(siRNA)來抑制。具體來說，表現(xiàn)出這樣的表達抑制活性的雙鏈的短鏈干擾RNA(siRNA)包括，例如其核苷酸序列為CGGACTACCCTTAGCACAA。在這種情況下，癌細胞的進一步生長也被抑制，所以癌癥的發(fā)生可以被阻止。
對于一個其氨基酸序列與本發(fā)明的氨基酸序列SEQ.ID.No.1(以下有時被稱為“本發(fā)明的蛋白”)一致或基本上一致的蛋白，其例子可以包括一個氨基酸序列，它與氨基酸序列SEQ.ID.No.1的同源性在大約70％或以上、優(yōu)選情況下在大約80％或以上、更優(yōu)選情況下在90％或以上、最優(yōu)選情況下在大約95％或以上。
對于一個其氨基酸序列與氨基酸序列SEQ.ID.No.1一致或基本上一致的蛋白，優(yōu)選情況下這樣的肽可以具有與氨基酸序列SEQ.ID.No.1基本上一致的氨基酸序列，并且與具有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的蛋白具有基本上相當?shù)幕钚浴?br> 基本上相當?shù)幕钚钥梢园ā⒗绾邪被嵝蛄蠸EQ.ID.No.1的蛋白的活性，比如誘導癌癥的功能、酶活性、轉(zhuǎn)錄活性以及與結(jié)合蛋白結(jié)合的活性。
在此所用的術(shù)語“基本上相當”是指這些活性在本質(zhì)上(例如生物化學或藥理學上)是一致的。
為“hWAPL基因”。對應(yīng)于hWAPL基因中ORF的全長的核苷酸序列由SEQ.ID.No.2所代表，推測的hWAPL蛋白的氨基酸序列由SEQ.ID.No.1所代表。將本發(fā)明的hWAPL基因的ORF編碼的氨基酸序列、即推測的hWAPL蛋白的氨基酸序列與dWAPL蛋白的氨基酸序列進行比較，表明，如圖1所示，在C-末端區(qū)域的623到1185氨基酸的部分序列中的同一性為35％，同源性為53％。表現(xiàn)出這樣的同一性和同源性的氨基酸顯示于圖2中。
此外，我們克隆了一個編碼小鼠源類似物、小鼠WAPL蛋白的cDNA，假定除人以外的一些哺乳動物中也可以含有相應(yīng)的蛋白。在對其測序后，將編碼的氨基酸序列進行比較。事實上，證實了人WAPL蛋白和小鼠WAPL蛋白彼此之間顯示出非常高的同源性。圖3顯示了比對的結(jié)果。我們已經(jīng)對人WAPL基因的編碼區(qū)的全長的核苷酸序列進行了登記，在DDBJ/EMBL/GenBank中的登錄號為No.AB065003。
我們對Saos-2細胞和NIH3T3細胞的抽提液進行了Western印跡分析，使用抗-hWAPL-N抗體和抗-hWAPL-C抗體，它們是對人WAPL蛋白的肽鏈特異性的抗體，在實施例6中有所解釋。如圖4所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個與抗體反應(yīng)的蛋白帶，分子量為大約140Kda。因此，證實了在人源細胞中人WAPL蛋白實際上在某種程度上存在。
此外，在下述的各種證實方法的基礎(chǔ)上實施例2在人癌組織中表達hWAPL基因；實施例3用源自HPV16型的E6和E7誘導hWAPL基因的表達；實施例4p53抑制蛋白抑制hWAPL基因產(chǎn)物的啟動子活性；實施例7hWAPL蛋白誘導染色體的不穩(wěn)定性；實施例8hWAPL蛋白誘導NIH 3T3成纖維細胞的癌變，可以得出結(jié)論，hWAPL基因是一個癌基因，至少參與了宮頸癌發(fā)生的機制。
含有hWAPL基因全長cDNA的質(zhì)粒pGEMhWAPL被用來產(chǎn)生含與氨基酸序列SEQ.ID.No.1一致或基本上一致的氨基酸序列的例子包括(i)氨基酸序列SEQ.ID.No.1；(ii)從氨基酸序列SEQ.ID.No.1中缺失了1到30個、優(yōu)選為1到20個、更優(yōu)選為1到10個氨基酸的氨基酸序列；(iii)向氨基酸序列SEQ.ID.No.1中增加了1到30個、優(yōu)選為1到20個、更優(yōu)選為1到10個氨基酸的氨基酸序列；(iv)向氨基酸序列SEQ.ID.No.1中插入了1到30個、優(yōu)選為1到20個、更優(yōu)選為1到10個氨基酸的氨基酸序列；(v)在氨基酸序列SEQ.ID.No.1中用其它氨基酸置換了1到30個、優(yōu)選為1到20個、更優(yōu)選為1到10個氨基酸的氨基酸序列；(vi)從上述的(ii)到(v)中選擇兩個或多個進行組合修飾的氨基酸序列。
本發(fā)明的蛋白的一個例子可以是含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的蛋白。
本發(fā)明的一個部分肽可以是上述的本發(fā)明的蛋白的任何部分肽，一般來說優(yōu)選的為含有本發(fā)明的蛋白的至少5個或以上氨基酸、更優(yōu)選為至少10個或以上氨基酸、更優(yōu)選為具有與本發(fā)明的蛋白相當?shù)幕钚缘碾摹?br> 在本發(fā)明的蛋白或其部分肽(以后有時稱為“本發(fā)明的蛋白”)中，根據(jù)常規(guī)的肽的表示法，左端是N-末端(氨基末端)，右端是C-末端(羧基末端)。
在本發(fā)明包括了含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的蛋白的蛋白中，C-末端可以從羧基(-COOH)、羧酸鹽(-COO-)、酰胺(-CONH2)和酯基(-COOR)中任選。
在酯中R的例子包括C1-6-烷基例如甲基、乙基、正丙基、異丙基和正丁基；C3-8-環(huán)烷基例如環(huán)戊基和環(huán)己基；C6-12-芳香基例如苯基和α-萘基；苯基-C1-2-烷基例如苯甲基和苯乙基；C7-14-芳烷基例如α-萘基-C1-2-烷基，包括α-萘基甲基；以及新戊酰氧基甲基，它通常用作酯進行口服。
當本發(fā)明的蛋白在C-末端以外的位置具有羧基基團(或羧酸鹽)時，其中羧基基團被酰胺化或酯化的蛋白也是本發(fā)明的一種蛋白。這里的酯可以是上述的C-末端的酯。
此外，本發(fā)明的蛋白的例子還包括一種蛋白，其中在N-末端的氨基酸殘基(例如甲硫氨酸殘基)的氨基基團被一個保護基團所保護，諸如C1-6-芳基、包括C1-6-烷酰基例如甲?；鸵阴；灰环N蛋白，其中在體內(nèi)切割形成的N-末端的谷氨酸殘基被轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸的形式；一種蛋白，其中在分子中一個氨基酸殘基中的側(cè)鏈上的一個取代基(例如-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基和胍基)被一個適當?shù)谋Ｗo基團(例如，C1-6-酰基，通常包括諸如甲?；鸵阴；腃1-6-烷?；?所保護；以及一種共軛蛋白，諸如其中連接了糖鏈的所謂的糖蛋白。
本發(fā)明的蛋白的鹽可以是一種生理可接受的酸(例如無機和有機酸)或堿(例如堿金屬鹽)的鹽，特別優(yōu)選的是生理可接受的酸加成的鹽。這樣的鹽的例子包括無機酸如鹽酸、磷酸、氫溴酸和硫酸的鹽，以及有機酸如乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲基磺酸和苯甲基磺酸的鹽。在下面，這樣的鹽也包括在本發(fā)明的蛋白中。
本發(fā)明的蛋白或其鹽可以通過已知的從人類或溫血哺乳動物的細胞中純化蛋白的方法來制備，或者也可以通過將編碼蛋白的DNA如下述轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)而制備。
當從人或哺乳動物的組織或細胞進行生產(chǎn)時，人或哺乳動物的組織或細胞被勻漿，然后用酸抽提。然后通過組合的色譜步驟例如反向色譜和離子交換色譜將抽提液純化以分離出所需的產(chǎn)物。
編碼本發(fā)明的致癌蛋白的多核苷酸可以是任一含有上述的編碼本發(fā)明的致癌蛋白的核苷酸序列的多核苷酸(DNA或RNA，優(yōu)選為DNA)。多核苷酸可以是DNA，也可以是RNA例如編碼本發(fā)明的致癌蛋白的mRNA，可以是單鏈的也可以是雙鏈的。當是雙鏈時，它可以是雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNARNA的雜合體。當是單鏈時，可以是正義鏈、即編碼鏈，也可以是反義鏈即非編碼鏈。
編碼本發(fā)明的蛋白的多核苷酸可用來對本發(fā)明的蛋白的mRNA進行定量，這可以使用已知的方法或?qū)ζ溥M行修改，例如在ExperimentalMedicine增刊“新的PCR及其應(yīng)用”，15(7)，1997中描述的方法。
一個編碼本發(fā)明的蛋白的DNA可以是任一含有上述的編碼本發(fā)明的蛋白的核苷酸序列的DNA，并且可以是基因組DNA、基因組DNA文庫、來自上述的細胞/組織的cDNA，來自上述的細胞/組織的cDNA文庫或人工合成的DNA。
用于文庫的載體可以是噬菌體、質(zhì)粒、粘?；蚴删?。細胞或組織的總RNA或mRNA部分的制備物可以用于通過直接的反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)(在后面稱為“RT-PCR”)進行擴增。
可用于本發(fā)明的探針DNA的核苷酸序列可以是任何序列，諸如含有在高度嚴謹條件下可以與核苷酸序列SEQ.ID.No.2雜交的核苷酸序列的DNA序列，以及編碼的蛋白與含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的蛋白具有基本上相當?shù)幕钚缘腄NA序列。
在高度嚴謹條件下可以與核苷酸序列SEQ.ID.No.2雜交的核苷酸序列可以是一個與核苷酸序列SEQ.ID.No.2具有同源性為大約70％或以上、優(yōu)選為大約80％或以上、更優(yōu)選為大約90％或以上、更優(yōu)選為大約95％或以上的核苷酸序列。
雜交可以根據(jù)已知的方法或其修飾方法來進行，例如在《分子克隆第二版》(J.Sambrook等人，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)中描述的方法。當使用市售的文庫時，雜交可以按照附帶的手冊來進行。在更優(yōu)選情況下，雜交可以在高度嚴謹條件下進行。
高度嚴謹條件可以包括、例如鈉濃度為大約19到40mM，優(yōu)選為大約19到20mM，溫度為大約50到70℃，更優(yōu)選為大約60到65℃，在最優(yōu)選情況下，鈉濃度為大約19mM，溫度為大約65℃。
在更具體的情況下，編碼含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的蛋白的DNA可以是含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的DNA。
編碼本發(fā)明部分的肽的DNA可以是任何含有編碼上述的本發(fā)明的肽的核苷酸序列的DNA，并且可以是基因組DNA、基因組DNA文庫、來自上述的細胞/組織的cDNA，來自上述的細胞/組織的cDNA文庫或人工合成的DNA。
編碼本發(fā)明的部分肽的DNA可以是一種含有包括核苷酸序列SEQ.ID.No.2的DNA的部分核苷酸序列的DNA，或者是另一種DNA，其含有包括在高度嚴謹條件下可與核苷酸序列SEQ.ID.No.2雜交的核苷酸序列并且編碼一種蛋白與含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的蛋白具有基本上相當?shù)幕钚缘腄NA的部分核苷酸序列。
可以與核苷酸序列SEQ.ID.No.2雜交的核苷酸序列的定義如上所述。
雜交方法和高度嚴謹條件可以如上所述。
含有編碼本發(fā)明的蛋白或其部分肽(以下有時稱為“本發(fā)明的蛋白”)的DNA序列的一部分、或與DNA互補的核苷酸序列的一部分的多核苷酸可以包含編碼本發(fā)明的蛋白或其部分肽的DNA和RNA。
根據(jù)本發(fā)明，在編碼被克隆或測定的本發(fā)明的蛋白的DNA的核苷酸序列數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上設(shè)計和合成了能夠抑制本發(fā)明的蛋白基因的復制和表達的反義多核苷酸(核酸)。這樣的多核苷酸(核酸)可以與本發(fā)明的蛋白基因的RNA雜交以抑制RNA的合成或活性，或通過與和本發(fā)明的蛋白相關(guān)的RNA相互作用而調(diào)節(jié)或控制本發(fā)明的蛋白基因的表達。與在和本發(fā)明的蛋白相關(guān)的RNA中選定的序列互補的多核苷酸以及能夠與和本發(fā)明的蛋白相關(guān)的RNA特異性雜交的多核苷酸，對于在體內(nèi)和體外對本發(fā)明的蛋白基因的表達進行調(diào)節(jié)或控制、以及對于疾病的治療或診斷，是非常有用的。在此所用的術(shù)語“相應(yīng)于”是指與包括塞因的核苷酸、核苷酸序列或核酸的部分序列同源或互補。在核苷酸、核苷酸序列或核酸與肽(蛋白)之間的關(guān)系方面，術(shù)語“相應(yīng)于”一般是指在一個蛋白(肽)中的一個氨基酸，從核苷酸(核酸)的序列或其互補序列衍生的一個控制序列。優(yōu)選的靶區(qū)域的例子可以包括在本發(fā)明蛋白基因中的一個5’-端的發(fā)夾環(huán)，一個5’-端的6個堿基對的重復、一個5’-端的非翻譯區(qū)、一個蛋白翻譯起始密碼子、一個蛋白編碼區(qū)、一個ORF翻譯終止密碼子，一個3’-端非翻譯區(qū)、一個3’-端回文區(qū)和一個3’-端的發(fā)夾環(huán)，但是在本發(fā)明的蛋白基因中的任何區(qū)域都可以被選為靶。
一個給定的核酸和與靶區(qū)域至少部分互補的多核苷酸之間、以及靶和可雜交的多核苷酸之間的關(guān)系可以被稱為“反義”。反義多核苷酸的例子包括含有2-脫氧-D-核糖的多核苷酸、一個含有D-核糖的多核苷酸、其它類型的多核苷酸如嘌呤或嘧啶堿的N-糖苷、以及其它含有非核苷酸結(jié)構(gòu)的聚合物(例如市售的蛋白核酸和合成的序列特異性的核酸聚合物)或其它含有特殊鍵的聚合物，只要聚合物中含有一個其構(gòu)型如在DNA或RNA中觀察到的可以接受堿基配對或堿基結(jié)合的核苷酸。它們可以是雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA或DNARNA雜合體。它們還可以包括未修飾的多核苷酸(或未修飾的寡核苷酸)，那些具有已知的修飾如本領(lǐng)域熟知的標記、加帽、甲基化、用類似物取代至少一個天然的核苷酸及分子內(nèi)的核苷酸修飾的多核苷酸；那些具有不帶電荷的鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯)的多核苷酸；那些具有帶電荷的鍵或含硫的鍵(例如硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯)的多核苷酸；那些具有一個側(cè)鏈基團的多核苷酸，所述側(cè)鏈基團包括蛋白(核酸酶、核酸酶抑制劑、毒素、抗體、信號肽和聚-L-賴氨酸)或糖(例如單糖)；那些含有一個中間化合物(如吖啶和補骨脂素)的多核苷酸；那些含有一個鏊合化合物(例如金屬、放射性金屬、硼和氧化金屬)的多核苷酸；那些含有烷基化試劑的多核苷酸；以及那些含有修飾的鍵(例如α-異頭型核酸)的多核苷酸。在此所用的術(shù)語“核苷”、“核苷酸”和“核酸”不僅可以包括那些含有嘌呤和嘧啶堿的化合物，而且還包括那些另含有其它修飾雜環(huán)堿基的化合物。這樣的修飾物質(zhì)可以含有甲基化的嘌呤和嘧啶、?；泥堰屎袜奏せ蚱渌s環(huán)化合物。修飾的核苷和修飾核苷酸可以在糖基團上修飾；例如一個或多個羥基可以被鹵素或脂肪族的基團所取代，或者可以被轉(zhuǎn)化為另一個官能團如醚和胺。
本發(fā)明的反義多核苷酸(核酸)是一個RNA、DNA或修飾的核酸(RNA、DNA)。修飾的核酸的例子包括但不限于核酸的硫衍生物或硫代磷酸衍生物以及那些對多聚核苷酰胺或寡聚核苷酰胺的降解有抗性的核酸。本發(fā)明的反義核酸可以被優(yōu)選設(shè)計為，例如使產(chǎn)生的反義核酸在細胞中更加穩(wěn)定、使反義核酸在細胞中有較高的通透性、對靶正義鏈具有親和性、或者如果它有毒性，產(chǎn)生的反義核酸可以具有較低的毒性。
多種這樣的修飾在本技術(shù)領(lǐng)域中是廣為人知的，并且在例如J.Kawakami等，Pharm Tech Japan，Vol.8，pp.247，1992；Vol.8，pp.395，1992；S.T.Crooke等編，反義研究和應(yīng)用，CRC Press，1993中已經(jīng)公開。
本發(fā)明的反義核酸可以包含轉(zhuǎn)化的和/或修飾的糖、堿基和/或鍵，因此可以以一種特別的形式諸如脂質(zhì)體和微球體的形式提供，可以應(yīng)用于基因治療或可以作為加合物提供。這樣的加合物的例子包括聚陽離子加合物、如作為磷酸結(jié)構(gòu)中的電荷中和劑的多聚賴氨酸，以及疏水加合物、例如一個增強與細胞膜相互作用或增加核酸的攝取的脂類(例如，磷脂和膽固醇)。優(yōu)選的用于加成的脂類的例子包括膽固醇及其衍生物(例如氯甲酸膽固醇酯和膽酸)。它可以通過堿基、糖或分子內(nèi)核苷鍵連接到核酸的3’-或5’-末端。另一種可用的基團可以是、例如一個具體定位于一個核酸的3’-或5’-末端以防止核酸酶諸如核酸外切酶和RNase降解的加帽基團。這樣的加帽基團的例子包括但不限于那些在本領(lǐng)域已知的羥基保護基團例如乙二醇、包括聚乙二醇和冰縮四乙二醇。
反義核酸的抑制活性可以使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子、本發(fā)明的體內(nèi)或體外基因表達系統(tǒng)、或本發(fā)明的蛋白的體內(nèi)或體外翻譯系統(tǒng)來測定?？梢允褂萌魏我阎亩喾N方法將核酸引入細胞。
編碼本發(fā)明的蛋白的DNA可以用任何已知的方法來標記；例如同位素標記、熒光標記(例如，使用熒光素進行熒光標記)、生物素?；兔笜?。
完整地編碼本發(fā)明的蛋白的DNA可以通過已知的PCR方法擴增來克隆，使用含有本發(fā)明蛋白的部分核苷酸序列的合成的DNA引物，或者通過與標記了編碼本發(fā)明的蛋白的部分或全長DNA片段或合成的DNA進行雜交來篩選整合在一個適當?shù)妮d體中的DNA。雜交可以使用例如在《分子克隆第二版》(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)中描述的方法來進行。當使用市售的文庫時，雜交可以按照附帶的手冊來進行。
一個DNA的序列可以使用已知的試劑盒例如MutanTM-superExpress Km(TaKara Shuzo Co.，Ltd.)、MutanTM-K(TaKara Shuzo Co.，Ltd.)，利用已知的方法例如ODA-LA PCR、帶缺口雙鏈方法和Kunkel方法或修改的方法來進行轉(zhuǎn)化。
根據(jù)使用的情況，編碼克隆的肽的DNA、如果需要、可以這樣使用或者在用限制性酶消化后或添加了接頭后使用。DNA可以在5’-末端帶有ATG作為翻譯起始密碼子，在3’-末端帶有TAA、TGA或TAG作為翻譯的終止密碼子?？梢允褂眠m當?shù)暮铣傻腄NA接頭來添加翻譯起始密碼和或翻譯終止密碼。
本發(fā)明的蛋白的表達載體可以通過例如(i)從編碼本發(fā)明的蛋白的DNA中切下所需DNA片段，和(ii)將DNA片段連接在適當?shù)谋磉_載體的啟動子的下游來制成。
可以使用的載體的例子包括從大腸桿菌衍生的質(zhì)粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12和pUC13)；從枯草芽孢桿菌衍生的質(zhì)粒(例如pUB110、pTP5和pC194)；從酵母衍生的質(zhì)粒(例如pSH19和pSH15)；噬菌體例如λ-噬菌體；哺乳動物的病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒和桿狀病毒；pA1-11；pXT1；pRc/CMV；pRc/RSV和pcDNAI/Neo。
用于本發(fā)明的啟動子可以是任何適合于在基因表達中所用的宿主的啟動子。例如，當使用哺乳動物細胞作為宿主時，可以使用SRα-啟動子、SV40啟動子、HIV-LTR啟動子、CMV啟動子或HSV-TK啟動子。
在這些啟動子中，優(yōu)選使用CMV(黃瓜花葉病毒)啟動子或SRα-啟動子。當宿主是大腸桿菌時，優(yōu)選的啟動子為trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λ-PL啟動子、lpp啟動子和T7啟動子；當宿主是芽孢桿菌時，優(yōu)選的啟動子為SPO1啟動子、SPO2啟動子和penP啟動子；當宿主是酵母時，優(yōu)選啟動子為PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子和ADH啟動子。當宿主是昆蟲細胞時，優(yōu)選啟動子為多角蛋白(polyhetdrin)啟動子和P10啟動子。
如果需要，也可以使用其它的表達載體，包括那些含有增強子、剪接信號、poly-A加尾信號、選擇標記和/或SV40復制原點(以下有時稱為“SV40ori”)的載體。選擇標記的例子包括二氫葉酸還原酶(以下有時稱為“dhfr”)基因[氨甲蝶呤(MTX)抗性]、氨卞青霉素抗性基因(以下有時稱為“Ampr”)和新霉素抗性基因(以下有時稱為“Neor”，G418抗性)。尤其是在使用缺失了dhfr基因的中華倉鼠細胞、以dhfr基因為選擇標記時，可以使用缺乏胸腺嘧啶的培養(yǎng)基來篩選所需基因的整合。
報告基因或藥物抗性基因也可用作選擇標記(New BiochemicalExperimental Lectures(Shin Seikagaku Jikken Koza)2，nucleic acid III，3.6 Mammalian cell expression vector，p84-103)。
可以使用的藥物抗性基因和藥物的組合的例子包括(1)嘌呤霉素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和嘌呤霉素的組合；(2)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(APH)和G418的組合；(3)潮霉素-B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPH)和潮霉素-B的組合；以及(4)黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)和霉酚酸酯(mycophenolate)的組合。
當親本細胞系是一個次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(TK)缺陷株時，可以使用這些基因和HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶)的組合。
二氫葉酸還原酶或氨卞青霉素抗性基因可以用作選擇標記基因。
如果需要，可以在本發(fā)明的蛋白的N-末端添加適合于宿主的信號序列。當宿主是大腸桿菌時，可以使用PhoA信號序列和OmpA信號序列；當宿主是芽孢桿菌時，可以使用α-淀粉酶信號序列和枯草桿菌蛋白酶信號序列；當宿主是酵母時，可以使用MFα信號序列和SUC2信號序列；當宿主是哺乳動物細胞時，可以使用胰島素信號序列、α-干擾素信號序列和抗體-分子信號序列。
這樣構(gòu)建的含有編碼本發(fā)明的蛋白的DNA的載體可以用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子。
宿主可以是、例如大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母、昆蟲細胞、昆蟲或哺乳動物細胞。
大腸桿菌的例子包括大腸桿菌K12 DH1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.60，160(1968)]、JM 103[Nucleic Acids Research，Vol.9，309(1981)]、JA221[Journal of Molecular Biology，Vol.120，517(1978)]、HB101[Joumal of Molecular Biology，Vol.41，459(1969)]和C600[Genetics，Vol.39，440(1954)]。
芽孢桿菌的例子包括枯草芽孢桿菌MT114[Gene，Vol.24，255(1983)]和207-21[Journal of Biochemistry，Vol.95，87(1984)]。
酵母的例子包括釀酒酵母AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D和20B-12；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913和NCYC2036；以及巴斯德畢赤氏酵母KM71。
至于昆蟲細胞，當病毒是AcNPV時，可以使用從黏蟲幼蟲(草地夜蛾細胞；Sf細胞)衍生的確立的細胞、從粉紋夜蛾中腸衍生的MG1細胞、從粉紋夜蛾卵得到的High FiveTM細胞、從甘藍夜蛾(Mamestrabrassicae)獲得的細胞或從Estigmena acrea衍生的細胞。當病毒是BmNPV時，可以使用從蠶(中國家蠶N細胞；BmN細胞)確立的細胞?？梢允褂玫腟f細胞的例子包括Sf9細胞(ATCC CRL1711)和Sf21細胞，這在Vaughn，J.L.等，In Vivo，13，213-217(1977)中已經(jīng)描述。
昆蟲的例子包括家蠶幼蟲[Maeda等，Nature，Vol.315，592(1985)]。
哺乳動物細胞的例子包括猴細胞COS-7(COS7)、非洲綠猴腎細胞系、中華倉鼠細胞CHO(以下稱為“CHO細胞”)、dhfr-基因缺失的中華倉鼠細胞CHO(以下稱為“CHO(dhfr-)細胞”)、鼠L細胞、鼠AtT-20細胞、鼠骨髓瘤細胞、大鼠GH3和人FL細胞。
大腸桿菌的轉(zhuǎn)化可以按照例如在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.69，2110(1972)或Gene，Vol.17，107(1982)中描述的方法進行。
芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化可以按照例如在Molecular & General Genetics，Vol.168，111(1979)中描述的方法進行。
酵母的轉(zhuǎn)化可以按照例如在酶學方法，Vol.194，182-187(1991)或Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.75，1929(1978)中描述的方法進行。
昆蟲細胞或昆蟲的轉(zhuǎn)化可以按照例如在Bio/Technology，6，47-55(1988)中描述的方法進行。
哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)化可以按照例如在細胞技術(shù)增刊8，新細胞技術(shù)實驗方法，263-267(1995)(Shuju Co.Ltd.)或Virology，Vol.52，456(1973)中描述的方法進行。
因此，可以獲得用含有編碼本發(fā)明的蛋白的DNA的表達載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子。
當對宿主為大腸桿菌或芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)時，用于培養(yǎng)的適當?shù)呐囵B(yǎng)基是含有碳源、氮源、無機鹽等轉(zhuǎn)化子生長所需組合物的液體培養(yǎng)基。碳源的例子包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉和蔗糖。氮源的例子包括無機和有機物如銨鹽、硝酸鹽、玉米浸汁、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、豆餅和土豆汁。無機鹽的例子包括氯化鈣、磷酸二氫鈉和氯化鎂?？梢蕴砑咏湍柑崛∥铩⒕S生素和/或生長促進因子。預期的培養(yǎng)基的pH為大約5到8。
培養(yǎng)大腸桿菌的優(yōu)選的培養(yǎng)基的例子可以是含有葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培養(yǎng)基[Miller，Journal of Experiments in MolecularGenetics，413-433，Cold Spring Harbor LaboHumanory，New York，1972]。如果需要，可以添加其它的試劑例如3β-吲哚丙烯酸用于高效的啟動子活性。
當宿主是大腸桿菌時，培養(yǎng)一般在大約15到43℃進行3到24小時，如果需要，通氣和/或攪拌。
當宿主是芽孢桿菌時，培養(yǎng)一般在大約30到40℃進行大約6到24小時，如果需要，通氣和/或攪拌。
當對宿主為酵母的轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)時，可以使用的培養(yǎng)基的例子包括Burkholder基礎(chǔ)培養(yǎng)基[Bostian，K.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.77，4505(1980)]和含有0.5％酪蛋白氨基酸的SD培養(yǎng)基[Bitter，G.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.81，5330(1984)]。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選被調(diào)整到大約5到8。培養(yǎng)一般在大約20到35℃進行大約24到72小時，如果需要，通氣和/或攪拌。
當對宿主為昆蟲細胞或昆蟲的轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)時，培養(yǎng)基可以是Grace昆蟲培養(yǎng)基(Grace，T.C.C.，Nature，195，788(1962))，適當時可以含有添加物如10％除去補體的牛血清。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選被調(diào)整到大約6.2到6.4。培養(yǎng)一般在大約27℃進行大約3到5天，如果需要，通氣和/或攪拌。
當對宿主為哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的例子包括含有大約5％到10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基[Science，Vol.122，501(1952)]、DMEM培養(yǎng)基[Virology，Vol.8，396(1959)]、RPMI 1640培養(yǎng)基[The Journal of the American Medical Association，Vol.199，519(1967)]和199培養(yǎng)基[Proceeding of the Society for the BiologicalMedicine，Vol.73，1(1950)]。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選被調(diào)整到大約6到8。培養(yǎng)一般在大約30到40℃進行大約15到60小時，如果需要，通氣和/或攪拌。
如上所述，本發(fā)明的蛋白可以在轉(zhuǎn)化子細胞的細胞內(nèi)、細胞膜或細胞外區(qū)域生產(chǎn)。
本發(fā)明的蛋白可以從上述的培養(yǎng)基中通過例如下面的方法分離和純化。
本發(fā)明的蛋白可以從培養(yǎng)的細菌或細胞中利用合適的方法提取，方法為培養(yǎng)后，通過已知的步驟收集細菌或細胞，將它們懸浮在適當?shù)木彌_液中，使用超聲、溶菌酶和/或凍融將細菌或細胞裂解，然后離心或過濾以得到本發(fā)明的蛋白的粗提液。緩沖液可以含有蛋白修飾物如尿素和鹽酸胍和表面活性劑如Triton X-100TM。當肽分泌到培養(yǎng)基中時，在培養(yǎng)后通過已知的方法將細菌或細胞與上清液分離，然后收集上清液。
這樣獲得的包含在培養(yǎng)基上清液或抽提液中的本發(fā)明的蛋白可以通過將現(xiàn)有的分離/純化方法進行適當組合來純化。這種現(xiàn)有的分離/純化方法的例子包括利用溶解度的方法如鹽析和溶劑沉淀；主要利用分子量差別的方法如透析、超濾、凝膠過濾和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；利用電荷差別的方法如離子交換層析；利用特異的親和性的方法如親和層析；利用疏水性差別的方法例如反向高效液相色譜；以及利用等電點差別的方法如等電聚焦。
當這樣獲得的本發(fā)明的蛋白是游離形式時，它可以通過現(xiàn)有的方法或其修飾的方法被轉(zhuǎn)化為鹽。反過來說，當獲得的是鹽形式時，它可以通過現(xiàn)有的方法或其修飾的方法被轉(zhuǎn)化為游離的形式。
純化前或純化后，由重組子產(chǎn)生的本發(fā)明的蛋白可以被適當?shù)牡鞍仔揎椕缸饔靡垣@得適當?shù)男揎椈虿糠秩コ粋€肽。蛋白修飾酶的例子包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰內(nèi)肽酶、蛋白激酶和糖苷酶。
針對本發(fā)明的蛋白的抗體(以下有時簡單稱為“本發(fā)明的抗體”)可以是多克隆或者是單克隆的，只要它能夠識別本發(fā)明的蛋白的抗體。
本發(fā)明的蛋白的抗體可以使用現(xiàn)有的制備抗體或抗血清的方法，以本發(fā)明的蛋白為抗原來生產(chǎn)。
單克隆抗體的制備(a)單克隆抗體產(chǎn)生細胞的制備將本發(fā)明的蛋白單獨或與載體和稀釋劑結(jié)合起來施用到溫血動物中能夠產(chǎn)生抗體的部位。在應(yīng)用時，可以使用Freund’s完全或不完全佐劑來提高抗體生產(chǎn)能力。一般來說在2到6周施用一次，總共施用大約2到10次。溫血動物的例子包括猴、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊和禽類，優(yōu)選為大鼠和小鼠。
為制備單克隆抗體產(chǎn)生細胞，從被抗原免疫的溫血動物例如小鼠中選擇出表現(xiàn)抗體滴度的個體，并且在最后免疫后2到5天分離出脾臟或淋巴結(jié)。包含在分離物中的抗體產(chǎn)生細胞可以與一個相同的或不同動物的骨髓瘤細胞融合以制備一個產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤?？梢酝ㄟ^例如將下面描述的標記肽與抗血清反應(yīng)然后測量結(jié)合到抗體上的標記的活性來測定抗血清中的抗體滴度。融合可以使用現(xiàn)有的方法進行，例如Kaehler-Milstein方法[Nature，256，495(1975)]。融合促進劑的例子包括聚乙二醇(PEG)和副流感病毒，優(yōu)選PEG。
骨髓瘤細胞的例子包括溫血動物的骨髓瘤細胞，例如NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1，優(yōu)選為P3U1?？贵w產(chǎn)生細胞(脾臟細胞)與骨髓瘤細胞的數(shù)量比優(yōu)選為大約1∶1到20∶1，PEG(優(yōu)選為PEG1000到PEG6000)添加濃度為大約10％到80％，通過在20到40℃、優(yōu)選為30到37℃1到10分鐘，細胞融合可以有效地進行。
可以使用多種方法中的任意一種來篩選產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞；例如，通過在已經(jīng)直接吸附了肽(蛋白)抗原或吸附了肽(蛋白)抗原與載體的組合物的固相介質(zhì)(例如，微孔板)中加入雜交瘤培養(yǎng)上清液，然后加入抗免疫球蛋白抗體(當用于細胞融合的細胞是鼠細胞時，使用抗小鼠免疫球蛋白抗體)或用放射性試劑或酶標記的蛋白A，并最后檢測結(jié)合到固相介質(zhì)上的單克隆抗體，或者在已經(jīng)吸附了抗免疫球蛋白抗體或蛋白A的固相介質(zhì)上加入雜交瘤培養(yǎng)上清液，然后加入用放射性試劑或酶標記的肽，最后檢測結(jié)合到固相介質(zhì)上的單克隆抗體。
可以通過現(xiàn)有的方法或其修改方法來篩選單克隆抗體。通?？梢允褂煤蠬AT(次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶)的哺乳動物細胞培養(yǎng)基。用于篩選和繁殖的培養(yǎng)基可以是任何雜交瘤能夠生長的培養(yǎng)基；例如，含有1％到20％、優(yōu)選為0到20％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，含有1％到10％胎牛血清(Wako Pure Chemicals Co.Ltd.)的GIT培養(yǎng)基，以及無血清的雜交瘤培養(yǎng)基(SFM-101，Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)。培養(yǎng)溫度一般為20到40℃、優(yōu)選為大約37℃。培養(yǎng)時間一般為5天到3周，優(yōu)選為1到2周。培養(yǎng)一般可以在5％氣態(tài)二氧化碳條件下進行。雜交瘤培養(yǎng)上清液中的抗體滴度可以按照上面描述的測定抗血清中的抗體滴度的方法來測定。
(b)單克隆抗體的純化可以使用現(xiàn)有的方法來分離和純化單克隆抗體，包括分離/純化免疫球蛋白的方法，如鹽析、醇沉淀、等電點沉淀、電泳、使用離子交換劑(例如DEAD)的吸附和解吸方法、超速離心、凝膠過濾，以及特異性的純化方法，在這種方法中抗體被活化的吸附劑如結(jié)合了抗原的固相介質(zhì)專一性收集，然后用蛋白A或蛋白G解離結(jié)合鍵而獲得抗體。
多克隆抗體的制備可以根據(jù)現(xiàn)有的方法或其修改方法來制備本發(fā)明的多克隆抗體。例如，制備免疫原(肽抗原)或其與載體蛋白的混合物，然后象上述的單克隆抗體的制備過程那樣用它免疫溫血動物，從被免疫的動物收集含有本發(fā)明的蛋白的抗體產(chǎn)物，并在分離和純化后，就可以制備到抗體了。
就免疫溫血動物的免疫原和載體蛋白的混合物而言，可以使用任何類型的載體蛋白和任一的載體對半抗原的混合比率，只要能夠有效地產(chǎn)生用交聯(lián)了載體的半抗原免疫的半抗原的抗體；例如，大約0.1到20重量份、優(yōu)選為大約1到5重量份的牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、血藍蛋白等結(jié)合到1重量份的半抗原上。
多種縮合試劑可用于將半抗原與載體偶聯(lián)起來，包括戊二醛、碳二亞胺、活化的順丁烯二酰亞胺酯和活化的具有硫醇基和/或二硫吡啶基團的酯試劑。
將縮合產(chǎn)物單獨或與載體和稀釋劑結(jié)合施用到溫血動物能夠產(chǎn)生抗體的部位。在應(yīng)用時，可以使用Freund’s完全或不完全佐劑來提高抗體生產(chǎn)能力。一般來說在2到6周內(nèi)施用一次，總共使用大約3到10次。
多克隆抗體可以從血液或腹水中收集，優(yōu)選為如上所述免疫的溫血動物的血液。
抗血清中的多克隆抗體的滴度可以按照測定抗血清中的抗體滴度的方法來測定。多克隆抗體的分離和純化可以按照分離/純化上述的單克隆抗體過程中的分離和純化免疫球蛋白的方法來進行。
含有與編碼本發(fā)明的蛋白的DNA互補或基本上互補的核苷酸序列的反義DNA(以后，后一個DNA有時稱為“本發(fā)明的DNA”，前一個反義DNA有時稱為“反義DNA”)可以是任何含有與本發(fā)明的DNA互補或基本上互補的核苷酸序列、并且能夠抑制DNA的表達的反義DNA。
與本發(fā)明的DNA基本上互補的核苷酸序列可以是，例如，與本發(fā)明的DNA互補的全部或部分核苷酸序列(即本發(fā)明的DNA的互補鏈)具有大約70％或以上、優(yōu)選為大約80％或以上、更優(yōu)選為大約90％或以上、最優(yōu)選為大約95％或以上的同源性的核苷酸序列。特別優(yōu)選的是與編碼本發(fā)明的蛋白的N-末端位點(例如，靠近起始密碼子的核苷酸序列)的區(qū)域的核苷酸序列的互補鏈具有大約70％或以上、優(yōu)選為大約80％或以上、更優(yōu)選為大約90％或以上、最優(yōu)選為大約95％或以上的同源性的反義DNA。這樣的反義DNA可以使用例如現(xiàn)有的DNA合成儀來制備。
下面將描述本發(fā)明的致癌蛋白(部分肽，包括鹽)、本發(fā)明的DNA、本發(fā)明的抗體和本發(fā)明的反義DNA的應(yīng)用。
(2)促進或抑制本發(fā)明的致癌蛋白的表達的化合物的篩選方法本發(fā)明的致癌蛋白、本發(fā)明的寡聚核苷酸、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子或本發(fā)明的抗體可用于促進或抑制本發(fā)明的致癌蛋白的表達的化合物的篩選方法。
具體來說，本發(fā)明提供了(i)篩選促進或抑制本發(fā)明的致癌蛋白的表達的化合物的方法，包括在含有或不含測試化合物的情況下培養(yǎng)能夠表達本發(fā)明的致癌蛋白的細胞和組織時，測定和比較本發(fā)明的致癌蛋白的表達量或編碼本發(fā)明的致癌蛋白的mRNA的量。
能夠表達本發(fā)明的致癌蛋白的細胞和組織的例子包括來源于人的細胞、溫血動物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、禽類、兔、豬、綿羊、牛和猴)細胞(例如，神經(jīng)細胞、內(nèi)分泌細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、胰腺β-細胞、骨髓細胞、肝細胞、脾細胞、血管素膜細胞、表皮細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、纖維細胞、肌細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例如巨嗜細胞、T-細胞、B-細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、嗜中性細胞、嗜堿性細胞、嗜酸性白細胞、單核細胞、樹枝狀細胞)、巨核細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、乳腺細胞、間質(zhì)細胞及其前體細胞、干細胞和癌細胞，以及任何這些細胞存在的所有組織，例如腦、腦部位點(例如嗅球、杏仁核、基底池、海馬區(qū)、視丘、下丘腦、大腦皮質(zhì)、延髓(medula oblongata)、小腦)、脊髓、垂體腺、胃、胰腺、腎、肝、生殖腺、甲狀腺(thyroid gland)、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肌肉、肺、胃腸道(例如大腸和小腸)、血管、心臟、胸腺、脾臟、唾液腺、外周血、前列腺、睪丸(精巢)、卵巢、胎盤、子宮、骨、軟骨、關(guān)節(jié)和骨骼肌。在此，可以使用已確立的細胞或原代培養(yǎng)系統(tǒng)。特別是，優(yōu)選使用上述的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體細胞。
培養(yǎng)能夠表達本發(fā)明蛋白的細胞的方法如同上述的培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的方法。
除了上述的測試化合物外，測試化合物還可以是一個DNA文庫。
本發(fā)明的癌細胞的表達量可以使用現(xiàn)有的方法來測定，例如使用例如抗體的免疫化學方法，或者可以使用利用Northern雜交、RT-PCR或TaqMan PCR的現(xiàn)有方法來測定編碼本發(fā)明的致癌蛋白的mRNA。
可以根據(jù)現(xiàn)有的方法或其修改方法通過雜交來比較mRNA的表達量，例如在《分子克隆第二版》，J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989中所描述的方法。
具體來說，按照現(xiàn)有的方法來測定編碼本發(fā)明的致癌蛋白的mRNA的量，即通過將從細胞中提取的RNA與本發(fā)明的多核苷酸或其部分或本發(fā)明的反義多核苷酸接觸，然后測量與本發(fā)明的多核苷酸或其部分或本發(fā)明的反義多核苷酸結(jié)合的mRNA的量。本發(fā)明的多核苷酸或其部分或本發(fā)明的反義多核苷酸可以使用例如放射性同位素或染料進行標記，有助于測定與本發(fā)明的多核苷酸或其部分或本發(fā)明的反義多核苷酸結(jié)合的mRNA的量。放射性同位素的例子包括32P和3H，染料的例子包括熒光染料如熒光素、FAM(PE Biosystems Inc.)、JOE(PEBiosystems Inc.)、TAMRA(PE Biosystems Inc.)、ROX(PE BiosystemsInc.)、Cy5(Amersham Inc.)和Cy3(Amersham Inc.)。
mRNA的量的測定可以通過使用反轉(zhuǎn)錄酶將從細胞提取的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后使用本發(fā)明的多核苷酸或其部分或本發(fā)明的反義多核苷酸作為引物測量通過PCR擴增的cDNA的量。
因此，一種增加編碼本發(fā)明的致癌蛋白的mRNA的量的測試化合物可以被選為促進本發(fā)明的致癌蛋白表達的化合物，而一種降低編碼本發(fā)明的致癌蛋白的mRNA的量的測試化合物可以被選為抑制本發(fā)明的致癌蛋白表達的化合物。
本發(fā)明還提供了(ii)篩選促進或抑制啟動子活性的化合物的方法，包括在存在或不含測試化合物的情況下，對使用重組DNA轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)時，測定并比較報告蛋白的活性，在所述重組DNA中報告基因被連接在編碼本發(fā)明的致癌蛋白基因的啟動子或增強子區(qū)域的下游。
可以使用的報告基因的例子包括lacZ(β-半乳糖苷酶基因)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、熒光素酶、生長因子、β-葡糖醛酸酶、堿性磷酸酶、綠色熒光蛋白(GFP)和β-內(nèi)酰胺酶。
通過使用現(xiàn)有的方法測定報告基因產(chǎn)物(例如mRNA和蛋白)的量，增加了報告基因產(chǎn)物的量的測試化合物可以被選為控制(尤其是促進)本發(fā)明的蛋白的啟動子或增強子活性的化合物，即作為促進本發(fā)明的蛋白的表達的化合物。反過來，降低了報告基因產(chǎn)物的量的測試化合物可以被選為控制(尤其是抑制)本發(fā)明的蛋白的啟動子或增強子活性的化合物，即作為抑制本發(fā)明的蛋白的表達的化合物。
測試化合物可以如前所述。
可以通過現(xiàn)有的技術(shù)構(gòu)建或分析含有報告基因的載體(例如，參見Molecular Biotechnology 13，29-43，1999)。
因為抑制本發(fā)明的致癌蛋白的表達的化合物可以抑制本發(fā)明的致癌蛋白的生物學活性，它作為一種安全、低毒的抑制本發(fā)明的致癌蛋白的生物學活性的醫(yī)用藥物是有用的。具體來說，它在作為癌癥如肺癌、腎癌、肝癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌、特別是宮頸癌的預防或治療劑方面是有用的。
使用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒獲得的化合物或其鹽可以是，例如從下面的物質(zhì)中選出的一種化合物肽、蛋白、非肽化合物、合成的化合物、發(fā)酵產(chǎn)品、細胞提取物、植物提取物、動物組織提取物和血漿?；衔锏柠}可以是如同描述的本發(fā)明的致癌蛋白衍生的肽的鹽。
當使用利用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒獲得的化合物作為上述的治療或預防試劑時，它可以照常使用。例如象在含有本發(fā)明的蛋白的藥物中描述的那樣，它可以制成片劑、膠囊、酏劑(elixir)、微囊、無菌溶液和懸浮液。
化合物或其鹽的劑量依賴于多種因素，例如它的效果、靶疾病、接受者和給藥路線。例如，抑制本發(fā)明的蛋白表達的化合物的口服給藥來治療癌癥，它的劑量對于正常成年人(體重60公斤)來說每天為大約0.1到100mg，優(yōu)選為大約1.0到50mg，更優(yōu)選為大約1.0到20mg。盡管化合物的劑量依賴于多種因素諸如接受者和靶疾病，但在非腸道給藥時，在給一個正常的成年人(體重60公斤)施用抑制本發(fā)明的蛋白的化合物治療癌癥時，每天靜脈內(nèi)注射的適當劑量為大約0.01到30mg，優(yōu)選為大約0.1到20mg，更優(yōu)選為大約0.1到10mg。對于其它的動物，可以施用將重量轉(zhuǎn)換為60公斤的量。
(3)本發(fā)明的致癌蛋白的分析本發(fā)明的抗體可以特異性識別本發(fā)明的致癌蛋白，因此可用于在測試溶液中測定本發(fā)明的致癌蛋白，尤其是使用三明治免疫測試方法的分析。
因此，本發(fā)明提供了(i)一種在測試溶液中測定本發(fā)明的致癌蛋白的方法，包含下列步驟將本發(fā)明的抗體與測試溶液和本發(fā)明標記的蛋白進行競爭性反應(yīng)，然后測定結(jié)合到抗體上的本發(fā)明的標記的蛋白的比例；以及(ii)一種在測試溶液中分析本發(fā)明的致癌蛋白的方法，包含下列步驟將測試溶液同時或連續(xù)地與在載體上不溶的本發(fā)明的抗體以及另一個標記的本發(fā)明的抗體進行反應(yīng)，然后測定在不溶性載體上的標記試劑的活性。
在(ii)中描述的測定中，理想的情況是一個抗體是能夠識別本發(fā)明的致癌蛋白的N-末端的抗體，而另一個抗體是能夠與本發(fā)明的致癌蛋白的C-末端反應(yīng)的抗體。
針對本發(fā)明的致癌蛋白的單克隆抗體可以使用例如組織染色的方法用來測定本發(fā)明的致癌蛋白或進行檢測。為了這些目的，可以使用抗體分子本身，也可以使用抗體分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。
對使用本發(fā)明的抗體測定本發(fā)明的致癌蛋白的步驟沒有特別的限制，它可以是任何步驟，只要在測量溶液中相對于抗原的量(例如肽的量)的抗體、抗原或抗體-抗原復合物的量可以通過化學的或物理的方法來測定，并且可以使用利用含有已知量的抗原的標準溶液作出的標準曲線來計算所需的值。例如，濁度測定法、競爭測定、放免分析和三明治分析方法都適合使用，根據(jù)靈敏度和特異性，下面描述的三明治分析方法是特別優(yōu)選的。
在使用這樣的標記材料的分析中使用的標記試劑的例子包括放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)和發(fā)光材料。放射性同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]和[14C]。在這些當中，優(yōu)選的是表現(xiàn)出很高比活性的穩(wěn)定的酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶。熒光物質(zhì)的例子包括熒光胺和異硫氰酸熒光素。發(fā)光材料的例子包括氨基苯二酰肼、氨基苯二酰肼衍生物、熒光素和硝酸雙-N-甲基吖啶。生物素-親和素系統(tǒng)可用于將抗原或抗體與標記試劑結(jié)合。
抗原或抗體可以使用物理吸附，或者使用通常用于不溶化或固定化肽或酶的化學鍵進行不溶化。載體的例子包括不溶性的多糖如瓊脂糖、葡聚糖、和纖維素；合成樹脂例如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚硅氧烷；以及玻璃。
在三明治分析中，本發(fā)明的不溶性的單克隆抗體與測試溶液反應(yīng)(第一個反應(yīng))，然后與另一個標記的本發(fā)明的單克隆抗體反應(yīng)(第二個反應(yīng))。然后，可以測定在不溶性的載體上的標記試劑的活性來分析在測試溶液中的本發(fā)明的蛋白的量。第一個和第二個反應(yīng)可以以相反的次序，同時或連續(xù)地進行。標記試劑和不溶化的方法可以是如上所述的方法。在使用三明治分析的免疫測定方法中，并不必需只使用一個抗體來作為固定介質(zhì)或進行標記，而是可以使用兩個或多個抗體的混合物來例如提高測量的靈敏度。
在根據(jù)本發(fā)明使用三明治分析法測定本發(fā)明的致癌蛋白中，用于第一個和第二個反應(yīng)的本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選為結(jié)合到本發(fā)明的癌蛋白上不同位點的抗體。具體來說，對于用于第一個和第二個反應(yīng)的抗體而言，當用于第二個反應(yīng)的抗體識別本發(fā)明的致癌蛋白的C-末端時，用于第一個反應(yīng)的抗體為識別C-末端以外的位點，例如N-末端的抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體可以用于三明治分析法以外的測量系統(tǒng)中，例如競爭分析法、免疫測量法和濁度測定法。
在競爭分析法中，測試溶液中的抗原和標記的抗原與抗體進行競爭性反應(yīng)，未反應(yīng)的標記抗原(F)與結(jié)合的標記抗原(B)分開(B/F分離)，測定被標記B或F的量來分析在測試溶液中抗原的量。這種反應(yīng)分析可以在液相方法中使用，其中一種可溶性的抗體用作抗體，聚乙二醇和針對上述抗體的第二抗體被用于B/F分離，此外也可以在固相方法中使用，其中一種固定化的抗體被用作第一抗體，或者第一抗體是可溶性的，第二抗體是一種固定化抗體。
在免疫測量法中，在測試溶液中的抗原和一個固定化抗原與給定量的標記的抗體進行競爭反應(yīng)，然后分離固相和液相，也可以是測試溶液中的抗原與過量的標記抗體進行反應(yīng)，然后加入一種固定化的抗原將未反應(yīng)的標記抗體結(jié)合到固相上，然后將固相和液相分離。然后，測定在兩種相中的標記的量以分析在測試溶液中的抗原的量。
濁度測定法測定在凝膠或溶液中由于抗原-抗體反應(yīng)形成的不溶性沉淀的量。即使當測試溶液中的抗原量很少以至于只形成少量的沉淀時，利用激光散射的激光濁度測定法也可以適當使用。
對于實施每一種分析本發(fā)明的免疫測定方法而言，不需要特殊的條件或操作?？梢愿鶕?jù)每種方法的通用條件和操作進行對熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人來說熟知的修改，來建立本發(fā)明的蛋白的測量系統(tǒng)。有關(guān)這些通用的技術(shù)步驟的詳細情況可以在各種綜述和教科書中發(fā)現(xiàn)。
這些文獻可以是，例如“放射免疫分析”Hiroshi Irie編，Kodansha，1974年出版；“放射免疫分析第二版”Hiroshi Irie編，Kodansha，1979年出版；“酶免疫分析”Eiji Ishikawa等編，Igaku-Shoin，1978年出版；“酶免疫分析第二版”Eiji Ishikawa等編，Igaku-Shoin，1982年出版；“酶的免疫分析第三版”Eiji Ishikawa等編，Igaku-Shoin，1987年出版；“酶學方法”Vol.70(免疫化學技術(shù)(部分A))；“酶學方法”Vol.73(免疫化學技術(shù)(部分B))；“酶學方法”Vol.74(免疫化學技術(shù)(部分C))；“酶學方法”Vol.84(免疫化學技術(shù)(部分D免疫分析精選))；“酶學方法”Vol.92(免疫化學技術(shù)(部分E單克隆抗體和普通免疫分析方法))；和“酶學方法”Vol.121(免疫化學技術(shù)(部分I雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體))(這些由Academic Press出版)。
當使用本發(fā)明的抗體分析本發(fā)明的致癌蛋白的水平檢測到該水平降低時，例如，可以得出診斷，受試者有與本發(fā)明的致癌蛋白不足有關(guān)的疾病，或者在將來可能得此病。
當檢測到本發(fā)明的蛋白的水平增加時，例如，可以得出診斷，受試者有由本發(fā)明的致癌蛋白過量表達所誘導的疾病，包括癌癥例如肺癌、腎癌、肝癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌(特別是宮頸癌)，或者在將來可能得病。
本發(fā)明的抗體可用于檢測存在于樣品例如體液和組織中的本發(fā)明的致癌蛋白。它也可以用于制備抗體柱，用于純化本發(fā)明的致癌蛋白，在純化中檢測每個級分中的本發(fā)明的蛋白，以及分析本發(fā)明的蛋白在測試細胞中的特性。
(4)基因診斷試劑本發(fā)明的多核苷酸或反義多核苷酸也可用作例如核酸探針，用于檢測主要是人體編碼本發(fā)明的致癌蛋白的DNA或mRNA的異常(基因缺陷)。例如，它可用作損傷、突變、或DNA或mRNA的表達減少或mRNA的過量表達的基因診斷試劑。
上述的使用本發(fā)明的多核苷酸或反義多核苷酸的基因診斷，可以根據(jù)例如現(xiàn)有的Northern雜交或PCR-SSCP來進行(參見Genomics，Vol.5，pp.874-879(1989)；Proceecling of the National Acaclemy of Science ofthe United States of America，Vol.86，pp.2766-2770(1989))。
例如，當使用Northern雜交檢測到mRNA表達降低時，可以得出診斷，受試者有與本發(fā)明的致癌蛋白不足有關(guān)的疾病，或者在將來可能得病。
當使用Northern雜交檢測到mRNA過量表達時，例如，可以得出診斷，受試者有由本發(fā)明的致癌蛋白過量表達所誘導的疾病，包括癌癥例如肺癌、腎癌、肝癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌(特別是宮頸癌)，或者在將來可能得病。
(5)含有反義多核苷酸的藥物能夠互補結(jié)合到本發(fā)明的多核苷酸(例如DNA)上并抑制多核苷酸(例如DNA)的表達的本發(fā)明的反義多核苷酸具有較低的毒性，并且可以在體內(nèi)抑制本發(fā)明的蛋白或本發(fā)明的多核苷酸(例如DNA)的活性。因此，它可用作由本發(fā)明的蛋白的過量表達誘導的疾病的預防或治療劑，例如癌癥如肺癌、腎癌、肝癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌。
當使用反義多核苷酸作為上述的預防或治療劑時，反義多核苷酸可以配制成上述的本發(fā)明的多核苷酸的劑型。
這樣獲得的制劑具有較低毒性，可以口服或非胃腸道施用到人或哺乳動物(例如大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、狗和猴)。
反義多核苷酸可以這樣給藥，為了促進攝入也可以與生理可接受的載體如佐劑結(jié)合使用，使用基因槍或?qū)Ч苋缢z導管。
反義多核苷酸的劑量依賴于許多因素而變化，例如靶疾病、接受者以及給藥路線，當本發(fā)明的反義多核苷酸局部給藥到器官(例如，肝臟、肺、心臟和腎臟)以治療癌癥時，劑量為例如每個成年人(60公斤體重)每天大約0.1到100mg。
此外，反義多核苷酸可以用作診斷的核苷酸探針，用來測定組織或細胞中本發(fā)明的癌基因的存在或其表達狀態(tài)。
本發(fā)明還提供了(i)一個含有編碼本發(fā)明的蛋白的RNA或其互補RNA的一部分的雙鏈RNA；
(ii)一種含有雙鏈RNA的藥物；在適當時(iii)一個含有編碼本發(fā)明的蛋白的RNA一部分的核酶；以及(iv)一個含有核酶的藥物。
這些雙鏈RNA(RNAi；RNA干擾方法)和核酶象上述的反義寡聚核苷酸一樣能夠抑制本發(fā)明的多核苷酸(例如，DNA)的表達，并能夠在體內(nèi)抑制本發(fā)明的致癌蛋白或多核苷酸(例如DNA)的活性。因此，它可以用作預防或治療劑用于由本發(fā)明的致癌蛋白過量表達所誘導的疾病，例如癌癥例如肺癌、腎癌、肝癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌，尤其是宮頸癌。
雙鏈RNA可以在本發(fā)明的多核苷酸序列的基礎(chǔ)上根據(jù)現(xiàn)有的方法(參見例如Nature，Vol.411，p.494，2001)來設(shè)計和生產(chǎn)。
核酶可以在本發(fā)明的多核苷酸的基礎(chǔ)上根據(jù)現(xiàn)有的方法(參見例如Trends in Molecular Medicine，Vol.7，p.221，2001)來設(shè)計和生產(chǎn)。例如，它可以通過將現(xiàn)有的核酶連接到編碼本發(fā)明的蛋白的RNA的一個部分上來產(chǎn)生。編碼本發(fā)明的蛋白的RNA的一個部分的例子是一個靠近本發(fā)明的RNA上能夠被現(xiàn)有的核酶降解的限制性位點的部分(RNA片段)。
當使用雙鏈RNA或核酶作為上述的預防或治療劑時，它可以象使用反義多核苷酸中描述的那樣配制和給藥。
(6)含有本發(fā)明的抗體的醫(yī)療藥物能夠中和本發(fā)明的致癌蛋白的癌變活性的本發(fā)明的抗體可以用作預防或治療劑用于本發(fā)明的致癌蛋白過量表達所誘導的疾病，例如癌癥例如肺癌、腎癌、肝癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌，尤其是宮頸癌。
上述的含有本發(fā)明的抗體的用于預防和治療疾病的藥物可以口服或非胃腸道施用給人或哺乳動物(例如，大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、狗和猴)，可以作為溶液或藥物組合物的合適劑型使用。劑量可以依賴于許多因素而變化，例如接受者、靶疾病、癥狀以及給藥路線，本發(fā)明的抗體的劑量可以是，例如，一般為0.01到20mg/Kg，優(yōu)選為0.1到10mg/Kg，更優(yōu)選為0.1到5mg/Kg，每天大約1次到5次，優(yōu)選為每天1到3次。它可以通過靜脈內(nèi)注射而適當?shù)亟o藥。在其它的非胃腸道或口服給藥方式中，可以使用與上述相似的劑量。如果癥狀特別嚴重，劑量也可以根據(jù)癥狀增加。
本發(fā)明的抗體可以本身或作為適當?shù)乃幬锝M合物給藥。用于上述給藥的藥物組合物含有上述的抗體或其鹽以及可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。這些組合物被提供為適合于口服或非胃腸道給藥的劑型。
具體而言，口服的組合物的例子包括固體和液體劑型，包括片劑如糖衣片劑和薄膜片劑、丸劑、顆粒、粉末、膠囊例如軟膠囊、糖漿、乳劑和懸浮劑。這樣的組合物使用現(xiàn)有的方法制備，并且含有在藥物領(lǐng)域常用的載體、稀釋劑或賦形劑。用于片劑的載體或賦形劑的例子包括乳糖、淀粉、蔗糖和硬脂酸鎂。
用于非胃腸道給藥的組合物的例子包括注射液和栓劑。注射液的例子包括靜脈內(nèi)注射液、皮下注射液、皮內(nèi)注射液、肌內(nèi)注射液和靜脈內(nèi)滴注液。這樣的注射液可以用現(xiàn)有方法制備；例如，通過將上述的抗體或其鹽在注射液常用的無菌水或油液中溶解、懸浮或乳化。用于注射的水性液體的例子包括鹽水和含有葡萄糖或其它佐劑的等滲溶液，可以與適當?shù)闹軇┙Y(jié)合使用，包括醇類如乙醇；多元醇如丙二醇和聚乙二醇；非離子性表面活性劑如聚山梨酸酯80和HCO-50(氫化的蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加成物)。油狀液體的例子包括芝麻油和大豆油，可以與助溶劑如芐基苯甲酸和芐醇結(jié)合使用。這樣制備的注射液一般填充在適當?shù)陌碴持?。用于直腸給藥的栓劑一般通過將上述的抗體或其鹽與常用的栓劑基質(zhì)混合而制備。
口服或非胃腸道給藥的藥物組合物方便地制備成適合于活性組合物的劑型。這樣的單位劑型的例子包括片劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)和栓劑。每個單位劑型優(yōu)選一般含有大約5到500mg上述抗體。特別是，注射劑含有5到100mg，而另外的劑型含有10到250mg。
每個上述的組合物可以含有其它的活性組合物，只要當它們與抗體復合時不產(chǎn)生不需要的相互作用。
(7)轉(zhuǎn)化DNA的動物本發(fā)明提供了非人類的哺乳動物，例如一個“敲入”動物，它含有編碼本發(fā)明的人源致癌蛋白的DNA(以下稱為“本發(fā)明的癌基因DNA”)或其變體DNA。
具體來說，本發(fā)明提供了(1)一個具有本發(fā)明的人源癌基因DNA或其變體DNA的非人類哺乳動物(“敲入”動物)；(2)“敲入”動物，其中非人類哺乳動物為嚙齒動物；(3)“敲入”大鼠或小鼠，其中嚙齒動物是大鼠或小鼠；以及(4)一個重組載體，其中含有可以在非人類哺乳動物中表達的本發(fā)明的人源癌基因DNA或其變體DNA。
含有本發(fā)明的人源癌基因DNA或其變體DNA的非人類哺乳動物(以下稱為“本發(fā)明的轉(zhuǎn)化DNA的動物”)可以通過將所需的DNA轉(zhuǎn)入一個未受精的卵、一個受精卵、一個精子或生殖細胞包括它們的原始細胞而產(chǎn)生，優(yōu)選為在非人類哺乳動物發(fā)育的胚胎發(fā)生階段(更優(yōu)選為在單細胞或受精卵細胞階段并且通常直到8細胞階段)，可以使用適當?shù)姆椒ɡ缌姿徕}方法、電脈沖方法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、凝聚、微注射、微粒槍法和DEAE-葡聚糖進行。通過DNA轉(zhuǎn)化方法，可以將本發(fā)明所需的外源DNA轉(zhuǎn)化到體細胞、活器官或組織細胞中，用于細胞培養(yǎng)或組織培養(yǎng)。此外，可以通過現(xiàn)有的細胞融合方法將細胞與上述的生發(fā)細胞融合，以產(chǎn)生本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化的動物。
非人類哺乳動物的例子包括牛、豬、綿羊、山羊、兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、小鼠和大鼠。在這些動物中，優(yōu)選的為嚙齒動物，特別是小鼠(例如純系如C57BL/6和DBA2株，以及雜交系如B6C3F1、BDF1、B6D2F1、BALB/c、ICR株)或大鼠(例如，Wistar和SD)，因為對于產(chǎn)生一個疾病動物模型來說，它們的個體發(fā)育和生物學周期相對較短，并且易于飼養(yǎng)。
對于能夠在哺乳動物中表達的重組載體而言，“哺乳動物”除了上述的非人類哺乳動物外，還可以是人。
本發(fā)明的人源癌基因的變體DNA不是指在非人類哺乳動物中天生的與本發(fā)明的癌基因類似的DNA，而是人工突變的DNA。
本發(fā)明的變體DNA可以是這樣的本發(fā)明的人源癌基因DNA，其原始核苷酸序列已經(jīng)改變(例如，突變)，諸如添加了一個堿基、缺失、或用其它堿基取代的DNA，或是一個異常的DNA。
異常的DNA是指一個DNA，它能夠表達與本發(fā)明的正常致癌蛋白相同但活性不同的蛋白；例如一個DNA，它表達了一個本發(fā)明的正常致癌蛋白的活性被抑制的肽。
為了將本發(fā)明的癌基因DNA轉(zhuǎn)化入靶非人類哺乳動物，一般來說優(yōu)選使用的DNA為結(jié)合在一個能夠在非人類動物細胞中表達DNA的啟動子的下游的DNA構(gòu)建體。例如，當轉(zhuǎn)化本發(fā)明的人源DNA時，已經(jīng)結(jié)合了本發(fā)明的人源癌基因DNA的DNA構(gòu)建體(例如，載體)被微注射到一個靶非人類哺乳動物的受精卵中，例如，一個鼠的受精卵，該DNA構(gòu)建體位于任一的多種啟動子的下游，這些啟動子能夠表達從任何與本發(fā)明的DNA具有較高的同源性的多種非人類哺乳動物(例如兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠和小鼠)衍生的DNA，從而產(chǎn)生一個能夠高效表達本發(fā)明的癌基因DNA的DNA轉(zhuǎn)化的非人類哺乳動物。
適用于本發(fā)明的致癌蛋白的表達載體的例子包括大腸桿菌衍生的質(zhì)粒、枯草芽孢桿菌衍生的質(zhì)粒、酵母衍生的質(zhì)粒、噬菌體如λ-噬菌體、反轉(zhuǎn)錄病毒如莫洛尼白血病病毒和哺乳動物病毒如痘苗病毒和桿狀病毒，優(yōu)選為大腸桿菌衍生的質(zhì)粒、枯草芽孢桿菌衍生的質(zhì)粒和酵母衍生的質(zhì)粒。
調(diào)控DNA表達的啟動子的例子包括(i)從病毒(例如猿猴病毒、巨細胞病毒、莫洛尼白血病病毒、JC病毒、乳癌病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒)衍生的DNA的啟動子；(ii)從各種哺乳動物(例如人、兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠和小鼠)衍生的啟動子；例如白蛋白、胰島素II、uroplakin II、彈性蛋白酶、紅細胞生成素、內(nèi)皮素、肌酸激酶(muscle cretine kinase)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、血小板衍生生長因子β、角蛋白K1、K10和K14、I和II型膠原蛋白、環(huán)-AMP依賴性蛋白激酶βI亞基、肌營養(yǎng)不良蛋白、酒石酸抗性堿性磷酸酶、心房鈉利尿因子、內(nèi)皮受體酪氨酸激酶(一般縮寫為“Tie2”)、鈉鉀腺苷三磷酸酶(Na，K-ATPase)、神經(jīng)絲輕鏈、金屬硫堇I和IIA、金屬蛋白酶-1組織抑制劑、MHCI類抗原(H-2L)、H-ras、腎素、多巴胺β-羥化酶、甲狀腺過氧化物酶(TPO)、肽鏈延伸因子1α(EF-1α)、β-肌動蛋白、α-和β-肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈1和2、髓鞘基質(zhì)蛋白、甲狀腺球蛋白、Thy-1、免疫球蛋白、可變H鏈部分(VNP)、血清淀粉狀P組合物、肌紅蛋白、肌鈣蛋白C、平滑肌α-肌動蛋白、前腦啡肽原A和加壓素啟動子。在這些啟動子中，優(yōu)選的為能夠在全身高效表達的巨細胞病毒啟動子、人類肽鏈延伸因子1α(EF-1α)、人類和禽類β-肌動蛋白啟動子。
上述的載體優(yōu)選包含在DNA轉(zhuǎn)化的非人類哺乳動物中能夠終止所需信使RNA轉(zhuǎn)錄的序列(一般稱為“終止子”)。例如可以使用來自牛或多種哺乳動物的DNA序列，優(yōu)選為猿猴病毒SV40終止子。
此外，如果需要，可以給每個DNA連接上剪接信號，在啟動子區(qū)的5’-上游中、在啟動子區(qū)和翻譯區(qū)之間或在翻譯區(qū)的3’-下游連入增強子區(qū)或一部分真核DNA內(nèi)含子以更高地表達所需的癌基因DNA。
使用從人源的肝、腎或甲狀腺細胞得到的全部或部分基因組DNA、來自成纖維細胞的DNA或各種市售的基因組DNA文庫，或是通過現(xiàn)有方法從來自肝細胞、腎細胞、甲狀腺細胞或成纖維細胞的RNA制備的互補DNA作為起始材料，可以獲得本發(fā)明的正常致癌蛋白的翻譯區(qū)。為了通過突變誘導產(chǎn)生異常的DNA，可以通過點突變誘導方法對從上述細胞或組織獲得的正常肽的翻譯區(qū)進行突變以產(chǎn)生突變的翻譯區(qū)。
可以通過常用的DNA工程步驟將翻譯區(qū)產(chǎn)生為能夠在DNA轉(zhuǎn)化的動物中表達的DNA構(gòu)建體，其中翻譯區(qū)被連接在啟動子的下游，或者如果需要，可以連接在轉(zhuǎn)錄終止位點的上游。
本發(fā)明的人源癌基因DNA在受精卵細胞階段進行轉(zhuǎn)移以便DNA被靶非人類哺乳動物中所有的生殖細胞和體細胞所攜帶。在一個DNA轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的動物的生殖細胞中存在本發(fā)明的癌基因DNA意味著產(chǎn)生的動物的所有后裔在它們的所有生殖細胞和體細胞中都攜帶本發(fā)明的癌基因DNA。這類遺傳了本發(fā)明的癌基因DNA的動物的后代在它們的所有生殖細胞和體細胞中都攜帶本發(fā)明的癌基因DNA。
轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的人源的癌基因DNA的非人類哺乳動物，在經(jīng)過交配證實了該哺乳動物穩(wěn)定地攜帶了人源的癌基因DNA后，可以作為攜帶癌基因DNA的哺乳動物在常規(guī)的繁殖條件下連續(xù)地繁殖。
本發(fā)明的人源癌基因DNA在受精卵細胞階段進行轉(zhuǎn)移以便DNA被靶非人類哺乳動物中所有的生殖細胞和體細胞所攜帶。在一個DNA轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的哺乳動物的生殖細胞中存在本發(fā)明的癌基因DNA意味著產(chǎn)生的動物的所有后裔在它們的所有生殖細胞和體細胞中都攜帶本發(fā)明的癌基因DNA。這類遺傳了本發(fā)明的人源癌基因DNA的動物的后代在它們的所有生殖細胞和體細胞中都攜帶本發(fā)明的癌基因DNA。
可以產(chǎn)生在兩條同源染色體上都帶有轉(zhuǎn)導的DNA的純合動物，并且雄性和雌性動物可以交配以連續(xù)地繁殖，以便所有的后代都連續(xù)地帶有DNA。
在具有本發(fā)明的人源癌基因DNA的非人類哺乳動物中，本發(fā)明的正常DNA高效表達，固有的正常DNA的活性可以被促進，有時會導致出現(xiàn)本發(fā)明的蛋白的活性過強。因此，它可以被用作疾病的模型動物。例如，本發(fā)明的正常DNA轉(zhuǎn)化的動物可以被用來解釋本發(fā)明的致癌蛋白活性過強的機制、或是與本發(fā)明的致癌蛋白相關(guān)的疾病的機制，還可用來研究這些疾病的治療。
此外，因為轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的人源的癌基因DNA的非人類哺乳動物表現(xiàn)出本發(fā)明的游離蛋白量的增加，因此可用于篩選針對與本發(fā)明的致癌蛋白相關(guān)的疾病的治療劑。
另一方面，帶有異常的本發(fā)明的DNA的非人類哺乳動物，在經(jīng)過交配證實了該動物穩(wěn)定地攜帶了轉(zhuǎn)導的DNA后，可以作為攜帶DNA的動物在常規(guī)的繁殖條件下連續(xù)地繁殖。此外，所需的異常DNA可以整合到上述的質(zhì)粒中作為起始材料。帶有啟動子的DNA構(gòu)建體可以通過常規(guī)的DNA工程過程產(chǎn)生。異常的本發(fā)明的DNA在受精卵細胞階段被轉(zhuǎn)化，以便DNA被靶哺乳動物中所有的生殖細胞和體細胞所攜帶。在DNA轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的動物的生殖細胞中存在異常的本發(fā)明的DNA意味著產(chǎn)生的動物的所有后裔在它們的所有生殖細胞和體細胞中都攜帶異常的本發(fā)明的DNA。這類遺傳了異常的本發(fā)明的DNA的動物的后代在它們的所有生殖細胞和體細胞中都攜帶異常的本發(fā)明的DNA。可以產(chǎn)生在兩條同源染色體上都帶有轉(zhuǎn)化的DNA的純合動物，并且雄性和雌性動物可以交配以連續(xù)地繁殖，以便所有的后代都連續(xù)地帶有DNA。
在具有異常的本發(fā)明的DNA的非人類哺乳動物中，異常的本發(fā)明的DNA高效表達，固有的正常DNA的活性可以被抑制，有時會導致本發(fā)明的蛋白的失活型的失效。因此，它可以被用作疾病的模型動物。例如，本發(fā)明的異常DNA轉(zhuǎn)化的動物可以被用來解釋本發(fā)明的致癌蛋白失活型不應(yīng)性的機制，還可用來研究這些疾病的治療。
作為一種特殊的應(yīng)用，高度表達異常的本發(fā)明的DNA的動物可以用作一個模型，以解釋在本發(fā)明的蛋白的失活型不應(yīng)性中異常的本發(fā)明的肽對正常肽活性的抑制(顯著的負活性)。
此外，因為轉(zhuǎn)化了異常的本發(fā)明的DNA的非人類哺乳動物表現(xiàn)出本發(fā)明的游離致癌蛋白量的增加，因此可用于篩選針對致癌蛋白或其失活型不應(yīng)性的治療劑。
本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化的動物可用于研究與本發(fā)明的致癌蛋白相關(guān)的疾病的臨床癥狀，例如本發(fā)明的蛋白的失活型不應(yīng)性。此外，動物可以在與本發(fā)明的致癌蛋白相關(guān)的疾病模型中給出每個器官的更特異的病理觀察，并且對新的療法的開發(fā)以及研究和治療由于上述疾病引起的第二種疾病有貢獻。
可以從本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化的動物中提取每個器官、切碎，用蛋白酶如胰蛋白酶處理以獲得游離的DNA轉(zhuǎn)化的細胞。然后將細胞進行培養(yǎng)，并將培養(yǎng)的細胞進行世系研究。此外，它還可用于鑒定產(chǎn)生本發(fā)明的致癌蛋白的細胞，以及研究其中與細胞凋亡(apotosis)、分化或生長或信號傳導和畸形有關(guān)的機制。因此，它可以成為一種有效的研究對象，用來闡明本發(fā)明的致癌蛋白及其活性。
此外，為了開發(fā)針對與本發(fā)明的致癌蛋白相關(guān)的疾病如本發(fā)明的蛋白的失活型不應(yīng)性的治療劑，本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化的動物可用于提供一種有效和快速的篩選方法，使用上述的測試和分析步驟進行篩選。
一個其類似于本發(fā)明的癌基因的基因DNA是失活的非人類哺乳動物的生殖干細胞，對于產(chǎn)生不足以表達本發(fā)明的癌基因DNA的非人類哺乳動物模型是非常有用的。一個其類似于本發(fā)明的癌基因的基因DNA表達不足的非人類哺乳動物不具有可以被本發(fā)明的致癌蛋白誘導的各種生物活性。因此，它可以作為一個模型用于本發(fā)明的致癌蛋白的生物活性失活所引起的疾病。因此，它對于闡明疾病的原因以及研究其治療方法是有用的。
(8a)篩選針對由本發(fā)明的癌基因DNA缺失或損壞而引起的疾病的治療或預防化合物的方法一個其本發(fā)明的DNA表達不足的非人類哺乳動物可以用來篩選針對由本發(fā)明的DNA缺失或損壞而引起的疾病的治療或預防化合物。
因此，本發(fā)明提供了一種用于篩選針對由本發(fā)明的DNA缺失或損壞而引起的疾病的治療或預防化合物或其鹽的方法，包括下列步驟將測試化合物施用給本發(fā)明的DNA表達不足的非人類哺乳動物，然后觀察和/或測定動物中的變化。
用于篩選過程的本發(fā)明的DNA表達不足的非人類哺乳動物可以如前所述的非人類哺乳動物。
測試化合物的例子包括肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取物、植物提取物、動物組織提取物和血漿，它們可以是新的也可以是已知的化合物。
(8b)篩選促進或抑制本發(fā)明的癌基因DNA的啟動子活性的化合物本發(fā)明提供了一種篩選促進或抑制本發(fā)明的癌基因DNA的啟動子活性的化合物或其鹽的方法，包括下列步驟將測試化合物施用給本發(fā)明的DNA表達不足的非人類哺乳動物，然后測定報告基因的表達。
在篩選方法中，在本發(fā)明的DNA表達不足的非人類哺乳動物中，本發(fā)明的DNA表達不足的非人類哺乳動物可以是這樣的動物，其中本發(fā)明的DNA由于轉(zhuǎn)導了報告基因而失活，并且報告基因可以在本發(fā)明的DNA的啟動子控制下表達。
測試化合物的例子包括肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取物、植物提取物、動物組織提取物和血漿，它們可以是新的也可以是已知的化合物。
可以使用的報告基因可以如前所述；適當?shù)摩?半乳糖苷酶基因(lacZ)、可溶性堿性磷酸酶基因和熒光素酶基因。
在本發(fā)明的癌基因DNA被報告基因取代了的本發(fā)明的DNA表達不足的非人類哺乳動物中，報告基因在本發(fā)明的DNA的啟動子控制之下，以便可以跟蹤報告基因編碼的物質(zhì)以檢測啟動子的活性。
例如，當編碼本發(fā)明的致癌蛋白的DNA區(qū)的一部分被一個來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)所取代時，β-半乳糖苷酶代替了本發(fā)明的致癌蛋白在自然情況下表達本發(fā)明的致癌蛋白的組織中表達。因此，例如通過用β-半乳糖苷酶的底物如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)作為試劑進行染色，就可以方便地觀察在活動物中本發(fā)明的致癌蛋白的表達狀態(tài)。具體來說，一個與本發(fā)明的致癌蛋白同源的蛋白缺陷的小鼠或其組織切片通過例如戊二醛進行固定，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，然后在室溫或大約37℃下與含有X-gal的染色液反應(yīng)30分鐘到1小時。這樣獲得的組織樣品用1mM EDTA/PBS沖洗以終止β-半乳糖苷酶的反應(yīng)，然后可以觀察到顏色。此外，編碼lacZ的mRNA也可以這樣檢測。
使用上述篩選方法獲得的化合物或其鹽選自上述的測試化合物，所述測試化合物能夠促進或抑制本發(fā)明的癌基因DNA的啟動子活性。
通過上述篩選方法選出的化合物可以形成鹽，可以是生理可接受的酸(例如無機酸)或堿(例如有機堿)的鹽，優(yōu)選為酸加成的鹽。這樣的鹽的例子包括無機酸如鹽酸、磷酸、氫溴酸和硫酸、或有機酸如乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、甲基磺酸和苯甲基磺酸的鹽。
因為促進本發(fā)明的癌基因DNA的啟動子活性的化合物或其鹽促進肽的活性，它在作為例如預防和治療劑用于與本發(fā)明的致癌蛋白不足相關(guān)的疾病的醫(yī)用藥物方面是有用的。
在另一方面，抑制編碼本發(fā)明的致癌蛋白的DNA的啟動子活性的化合物及其鹽，在作為安全低毒的抑制本發(fā)明的致癌蛋白的癌癥誘導活性的藥物，例如作為癌癥如肺癌、腎癌、肝癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌的預防或治療劑方面是有用的。
從上述篩選選出的化合物的衍生物也可以使用。
含有通過篩選方法選出的化合物或其鹽的藥物可以制備成適合于運送到靶癌組織的劑型，如同含有針對給定癌癥的現(xiàn)有的抗癌藥的藥物。
因為這樣制備的劑型是安全和低毒的，它可以施用給主要的接受者人或可以預期獲得同樣的療效的哺乳動物(如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗和猴)。
化合物或其鹽的劑量依賴于多種因素例如靶疾病、接受者和給藥路線而改變。例如，口服施用抑制本發(fā)明的DNA的啟動子活性的化合物來治療癌癥，它的劑量對于正常成年病人(體重60公斤)來說每天為大約0.1到100mg，優(yōu)選為大約1.0到50mg，更優(yōu)選為大約1.0到20mg。盡管化合物的劑量依賴于多種因素如接受者和靶疾病而改變，但在非腸道給藥時，在給一個正常的成年病人(體重60公斤)使用抑制本發(fā)明的DNA的啟動子活性的化合物治療癌癥時，每天靜脈內(nèi)注射的適當劑量為大約0.01到30mg，優(yōu)選為大約0.1到20mg，更優(yōu)選為大約0.1到10mg。對于其它的動物，可以施用將重量轉(zhuǎn)換為60公斤的量。
因此，本發(fā)明的癌基因DNA表達不足的非人類哺乳動物，對于篩選促進或抑制本發(fā)明的癌基因DNA的啟動子活性的化合物或其鹽來說是相當有用的，并且對闡明由于本發(fā)明的癌基因DNA表達不足引起的各種疾病的原因，以及開發(fā)用于疾病的預防或治療劑，具有極大的貢獻。
此外，使用含有本發(fā)明的致癌蛋白的啟動子區(qū)域的DNA，編碼給定蛋白的基因可以連接在下游位點，并且產(chǎn)物可以被注射到動物卵細胞中以產(chǎn)生所謂的轉(zhuǎn)基因動物(滲入基因的動物)，以便可以特異性地引起癌基因的體內(nèi)表達而同時避免癌變。此外，合適的報告基因可以連接到啟動子區(qū)以建立一個表達基因的轉(zhuǎn)化細胞系，可以用作一個體內(nèi)搜索系統(tǒng)，用于搜索能夠特異性促進或抑制本發(fā)明自身的致癌蛋白的體內(nèi)生產(chǎn)能力的低分子量化合物。
當被用于預防或治療癌癥時，調(diào)節(jié)本發(fā)明的致癌蛋白的活性的化合物或其鹽可以和其它的抗癌試劑結(jié)合使用，例如ifosfamide、UTF、阿霉素、博來霉素(peplomycin)、順氯氨鉑、環(huán)磷酰胺、5-FU、UFT、氨甲蝶呤、絲裂霉素C和米托蒽醌。
實施例參考實施例本發(fā)明將更為具體。這些實施例包含在本發(fā)明的最優(yōu)選實施方案中，但是本發(fā)明不限于這些實施方案。
實施例1編碼人的hWAPL的cDNA的克隆和測序使用市售的cDNA文庫、人的睪丸cDNA試劑盒(Marathon-ReadyTMcDNA Kit；Clontech Inc.)作為模板，使用下述兩個引物進行PCR引物1(序列TTGGATCCATGACATCCAGATTTGGGAAAACATACAGTAGG)；和引物2(序列TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCAATCACTCTAGA)。在PCR反應(yīng)中使用了Advantage2聚合酶混合物試劑盒(Clontech Inc.)，參考試劑盒的說明用下列的溫度循環(huán)進行擴增(1)94℃1分鐘；(2)94℃10秒，72℃2分鐘，共5個循環(huán)；(3)96℃10秒，70℃2分鐘，共25個循環(huán)，然后在72℃進行延伸反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)后，參考pGEM-T easy(PROMEGA)的使用說明，將獲得的PCR擴增的產(chǎn)物被克隆到質(zhì)粒載體pGEM-T easy(PROMEGA)中。它被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α(Invitrogen)中，利用質(zhì)粒載體pGEM-T easy上的氨卞青霉素抗性基因，在含有氨卞青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選帶有質(zhì)粒的克隆。
每個選出的克隆帶有的質(zhì)粒被測序，獲得克隆的新的cDNA的序列(SEQ.ID.No.2)。含有從cDNA核苷酸序列中的ORF推導出的氨基酸序列(SEQ.ID.No.1)的新的蛋白被命名為人的WAPL(hWAPL)。帶有克隆在質(zhì)粒中的全長hWAPL cDNA的轉(zhuǎn)化子被命名為大腸桿菌DH5pGEMhWAPL。
實施例2hWAPL基因在人癌組織中的表達在東京醫(yī)學院醫(yī)院外科切除癌組織的受試病人的同意之下，提供了外科切除的癌組織的樣品。通過Northern雜交和實時PCR檢測了在外科切除的癌組織的樣品中存在hWAPL基因的表達，并測定了其表達量。
在Northern雜交中，利用具有與SEQ.ID.No.2的hWAPL全長序列中的核酸從2511到2813的部分互補的核苷酸序列的DNA為檢測探針，從制備的總RNA中鑒定了從hWAPL表達的mRNA。另一方面，在實時PCR中，使用擴增試劑盒SYBR Green I(TaKaRa Co.Ltd.)和下列的PCR引物對作為引物，擴增了hWAPL的cDNA5’-GAATTCATAGGCACAGCGCTGAACTGTGTG-3’和5’-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCA-3’此外，人的β-肌動蛋白被用作內(nèi)在的標準。用于擴增人的β-肌動蛋白的cDNA的PCR引物是市售的引物對(Clontech)5’-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’和5’-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3’。
實時PCR選擇的熱循環(huán)條件如下(a)95℃30秒；(b)95℃3秒，68℃30秒，共40個循環(huán)；然后(c)87℃6秒。
對于PCR反應(yīng)中的熱循環(huán)，使用了Smart Cycler System(TaKaRaCo.Ltd.)。雙鏈cDNA的量通過熒光標記的方法檢測，以測定擴增產(chǎn)物的量。
對于上面提到的癌組織樣品，總RNA的比較樣品是根據(jù)現(xiàn)有的方法(Oikawa等，Cancer Res.，61，5707-5709(2001))，從每個組織的正常細胞和癌細胞中制備的。在被檢測宮頸癌、子宮體癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌的癌細胞之中，大約40％的宮頸癌癌細胞樣品表現(xiàn)出明顯的hWAPL基因表達(圖5)。
檢測宮頸癌的癌細胞樣品中是否存在HPV的感染。具體來說，參考現(xiàn)有的方法(Nakagawa等，J.Med.Virol.，62，251-258(2000))，使用相應(yīng)的引物通過RT-PCR檢測了來自HPV的E6/E7基因的mRNA區(qū)域，并且在所有侵入性宮頸癌癌細胞樣品中，HPV的感染和E6/E7基因的表達都被證實了。意外的是，一些胃癌樣品也表現(xiàn)出hWAPL基因的高表達。
實施例3通過來自HPV16的E6和E7誘導hWAPL基因的表達使用下面的引物對通過RCR方法擴增和分離了來自HPV16的E6基因16E6attB15’-AAAAAGCAGGCTCCACCATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCC-3’，和16E6attB25’-AGAAAGCTGGGTTACAGCTGGGTTTCTCTACGTG-3’使用下面的引物對通過RCR方法擴增和分離了來自HPV16的E7基因
16E7attB15’-AAAAAGCAGGCTCCACCATGCATGGAGATACACCTACAT-3’，和16E6attB25’-AGAAAGCTGGGTTATGGTTTCTGAGAACAGATGGGG-3’然后，按照Naviaux等的步驟(Naviaux等，J.Virol.，70，5701-5705(1996))，每個這些基因被克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體pCLXSN中，產(chǎn)生了分別能夠產(chǎn)生E6和E7重組子的反轉(zhuǎn)錄病毒LXSN-16E6和LXSN-16E7。此外，同時產(chǎn)生了能夠產(chǎn)生E6和E7重組子的反轉(zhuǎn)錄病毒LXSN-16E6E7。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自HPV的E2基因的產(chǎn)物能夠結(jié)合到E6和E7基因的啟動子區(qū)域，具有抑制其轉(zhuǎn)錄的功能，并且來自牛乳頭瘤病毒(BPV)的E2基因的產(chǎn)物具有同樣的抑制轉(zhuǎn)錄的功能。以pBPV-MII為模板通過嵌套PCR獲得了BPV1 E2基因片段。在嵌套PCR中，所用的內(nèi)側(cè)引物對為5’-AAAAAGCAGGCTCCACCATGGAGACAGCATGCGAAC-3’和5’-AGAAAGCTGGGTCAGAAGTCCAAGCTGGCTGTAAAG-3’所用的外側(cè)引物對為5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’和5’-GGGGACAAGTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’這樣獲得的BPV1 E2基因片段被克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體pCMSVpuro中，這是一個基于通用目的的病毒載體pCMSV(Clontech)的載體，制備了能夠產(chǎn)生來自BPV的E2重組子的反轉(zhuǎn)錄病毒MSCV-puro BPV1 E2。反轉(zhuǎn)錄病毒載體pCMSVpuro含有一個嘌呤霉素抗性基因作為選擇標記。
用反轉(zhuǎn)錄病毒LXSN-16E6、LXSN-16E7和LXSN-16E6E7感染人表皮細胞HDK1(BioWhittaker)以分別產(chǎn)生來自HPV16的E6和E7重組蛋白。使用用反轉(zhuǎn)錄病毒載體pCLXSN感染的人表皮細胞HDK1作為陰性對照。通過將細胞在含有50μg/mL G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，篩選到了其中建立了連續(xù)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的細胞系。感染后，通過Western印跡，使用了識別致癌蛋白hWAPL的50到66的部分氨基酸序列區(qū)(氨基酸序列CNFKPDIQEIPKKPKVEE)的特異性抗體，測定了由來自HPV16的E6或E7重組蛋白誘導的hWAPL基因的表達(圖6)。
同時，通過Western印跡還測定了p53抑制蛋白的表達量。然后，再度證實了E6產(chǎn)物促進p53腫瘤抑制蛋白的切割，導致了致癌蛋白hWAPL的表達。
此外，當用MSCV-puro BPV1E2感染宮頸癌的癌細胞系CaSki、SiHa和C33A時，在產(chǎn)生來自HPV16的E6和E7的CaSki和SiHa細胞系中，由于來自BPV的E2抑制了E6和E7基因的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出剩余的p53腫瘤抑制蛋白增加。與此相伴隨，致癌蛋白hWAPL的表達被抑制了(圖6)。另一方面，在C33A細胞系中，誘導其癌變的機理不是由HPV感染引起的，剩余的p53腫瘤抑制蛋白的量或致癌蛋白hWAPL的表達量不受影響。這個結(jié)果表明，盡管致癌蛋白hWAPL的表達量增加與癌變緊密相關(guān)，可能還存在一種獨立的機制能夠引起致癌蛋白hWAPL的表達增加，這種機制不同于由來自HPV的E6和E7導致的致癌蛋白hWAPL表達的增加。
實施例4p53抑制蛋白抑制hWAPL基因的啟動子活性已經(jīng)證實了p53抑制蛋白具有從啟動子抑制hWAPL基因轉(zhuǎn)錄的功能。如下所述。
以DLD-1細胞的基因組DNA為模板，使用下述引物對通過PCR方法擴增和分離了hWAPL基因的啟動子引物1(序列GTGCATCCCACCCACAGTGGAAGACATGG)和引物2(序列CCGCTTCCGCCGGTGAATGGTCAGTGCTGG)。
PCR產(chǎn)物的DNA片段首先被克隆到pGEMT-easy(Promega)中，然后用限制性酶EcoRI酶切的片段被克隆到pBluescript(Stratagene)中。用SalI/XhoI酶切含有插入到質(zhì)粒中的hWAPL基因的啟動子區(qū)的區(qū)域，然后克隆到pGL3-Basic載體(Promega)中。
在用Qiagen Plasmid Maxi Kit(Qiagen)純化后，使用LipofectAmine2000(Invitrogen)將獲得的載體與p53表達載體共轉(zhuǎn)染HeLa細胞，以pHM6(Roche)作為對照，pGR3-tK載體作為熒光素酶分析的標準。在熒光素酶分析中使用雙熒光素酶試劑盒(Promega)測定標記蛋白熒光素酶的量，熒光素酶作為在hWAPL基因啟動子控制下轉(zhuǎn)錄和翻譯的報告基因產(chǎn)物。
結(jié)果證實了當轉(zhuǎn)導p53表達載體時，與對照相比，表達的p53抑制蛋白的量的增加減少了30％的標記蛋白熒光素酶的量，而熒光素酶是在hWAPL基因啟動子控制下轉(zhuǎn)錄和翻譯的。換句話說，證實了p53抑制蛋白具有導致hWAPL基因啟動子活性降低的功能。
實施例5構(gòu)建表達載體生產(chǎn)hWAPL重組蛋白通過使用PCR的點突變方法在具有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的cDNA的第1到3570堿基區(qū)域的末端分別轉(zhuǎn)導了一個HindIII和一個EcoRI限制性位點。獲得的PCR產(chǎn)物用HindIII/EcoRI酶切，相應(yīng)的DNA片段被插入一個HA-標記的哺乳動物表達載體pHM6(RocheDiagnostics)中，構(gòu)建了一個能夠生產(chǎn)重組的HA-標記的hWAPL蛋白的表達載體pHM6-hWAPL。該片段也被插入一個用于表達具有hrGFP融合部分的融合蛋白的哺乳動物表達載體phrGFP-N1(Stratagene)中，以構(gòu)建一個能夠生產(chǎn)重組的GFP融合的hWAPL蛋白的表達載體phrGFP-hWAPL。
使用LipofectAmine2000(Invitrogen)將產(chǎn)生重組蛋白的表達載體轉(zhuǎn)染宿主哺乳動物細胞。在轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2天后，在存在hrGFP標記表達的基礎(chǔ)上使用EPICS ALYRA HyperSort(Bechman Coulter)進行篩選。在進一步培養(yǎng)和另外篩選后，獲得了一個帶有所需的表達載體能夠生產(chǎn)hWAPL重組蛋白的轉(zhuǎn)化的宿主細胞系。
實施例6針對hWAPL蛋白的特異件抗體的產(chǎn)生為了產(chǎn)生針對致癌蛋白hWAPL的特異性抗體，通過化學合成制備了一個具有位于致癌蛋白hWAPL N-末端區(qū)域的50到66(序列CNFKPDIQEIPKKPKVEE)部分氨基酸序列的肽鏈(hWAPL50-66)作為免疫原肽。此外，通過重組產(chǎn)生了一個標記了6XH組氨酸的融合多肽，它含有位于致癌蛋白hWAPL C-末端區(qū)域814到1037的部分氨基酸序列。
按照常規(guī)的技術(shù)，這兩個免疫原肽被分別用來免疫兔，以產(chǎn)生特異性針對這些抗原肽的多克隆抗體，抗-hWAPL-N抗體和抗-hWAPL-C抗體。在實施例3等的Western印跡中，使用特異性針對hWAPL50-66抗原的抗-hWAPL-N抗體檢測致癌蛋白hWAPL。
實施例7hWAPL蛋白誘導染色體的不穩(wěn)定性用表達載體phrGFP-hWAPL感染HeLa細胞以生產(chǎn)hrGFP融合的hWAPL重組蛋白。執(zhí)行實施例5描述的步驟篩選產(chǎn)生GFP-hWAPL融合蛋白的GFP-hWAPL陽性細胞系和不產(chǎn)生GFP-hWAPL融合蛋白的GFP-hWAPL陰性細胞系。在篩選后傳代5代后，根據(jù)Buse的方法(J.Biol.Chem.，274，7253-7263(1999))用激光掃描細胞儀分析染色體基因DNA的含量。
GFP-hWAPL陰性細胞系表現(xiàn)出與宿主細胞HeLa細胞相當?shù)娜旧w基因含量，其中一半或以上由正常的二倍體組成，四倍體大約為二倍體的一半。另一方面，在GFP-hWAPL陽性細胞系中，正常的二倍體含量少，主要部分為多倍體，四倍體的含量略多于二倍體的含量，八倍體也存在，含量為10.1％。因此，可以判斷出hWAPL蛋白的過量表達誘導了染色體的不穩(wěn)定性(圖7)。
同樣地，核的異型、特別是多核化的誘導也源自于hWAPL蛋白的過量表達。在傳代3代以后，觀察到的多核化的比率在GFP-hWAPL陰性細胞系和用phrGFP-N1載體(對照)感染的HeLa細胞中分別只是5％和4％，而在GFP-hWAPL陽性細胞系中是15.6％(三倍或以上)(圖8)。
此外，與染色體的畸形、例如在染色體基因有絲分裂的分離過程中由于異常的著絲粒分裂而產(chǎn)生的核的異型相關(guān)，微核形成的誘導也是源自于hWAPL蛋白的過量表達。在GFP-hWAPL陽性細胞系中微核形成的頻率大約為在GFP-hWAPL陰性細胞系中的2倍(圖7)。
實施例8hWAPL蛋白誘導NIH3T3成纖維細胞的癌變用表達載體pHM6-hWAPL感染NIH 3T3成纖維細胞以產(chǎn)生HA-標記的hWAPL重組蛋白，產(chǎn)生了一個過量表達HA-標記的hWAPL蛋白的重組細胞系HA-hWAPL3T3細胞系。產(chǎn)生了用pHM6載體感染的HA-3T3細胞系作為陰性對照。當在平板上培養(yǎng)時，用于陰性對照的HA-3T3細胞系象宿主細胞NIH 3T3成纖維細胞一樣形成了類似均勻地鋪滿的單細胞層，而HA-hWAPL 3T3細胞系則形成了聚集的結(jié)構(gòu)。
對裸鼠在皮下注射了HA-hWAPL 3T3細胞系和HA-3T3細胞系。連續(xù)地追蹤表明在10天內(nèi)，在所有注射了HA-hWAPL 3T3細胞系的位點都誘導了腫瘤發(fā)生，而在注射了HA-3T3細胞系的位點沒有誘導腫瘤發(fā)生。使用抗-HA抗體和抗-hWAPL-C抗體進行Western印跡，證實了HA-標記的hWAPL蛋白在癌變細胞中確實過量表達了。在癌變細胞中，觀察到異型的有絲分裂；例如，也觀察到了三極分裂。
實施例9使用定向于hWAPL基因的siRNA抑制癌細胞的生長使用定向于hWAPL基因的siRNA，證實了抑制hWAPL蛋白的表達可以導致對癌細胞生長的抑制。
(1)使用siRNA體外抑制癌細胞的生長使用Silencer siRNA構(gòu)建試劑盒(Ambion)，分別生產(chǎn)了定向于下列基因序列(hWAPL AsiRNA)和對照(陰性對照)的siRNAhWAPL AsiRNACGGACTACCCTTAGCACAA陰性對照ACTACAACTGGTCGCAACC在實際中，針對每一個制備了兩個合成的寡聚體；具體來說，對于hWAPL AsiRNA來說，是AACGGACTACCCTTAGCACAAcctgtctc和AATTGTGCTAAGGGTAGTCCGcctgtctc對于陰性對照來說，是AAACTACAACTGGTCGCAACCcctgtctc和AAGGTTGCGACCAGTTGTAGTcctgtctc然后，在每個合成的寡聚體中，在ctgtctc部分與T7啟動子引物雜交，并用Klenow DNA聚合酶處理以制備完整的雙鏈DNA。然后，用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，制備的反義鏈和正義鏈RNA彼此雜交，然后用Rnase消化兩端的粘性末端，產(chǎn)生了具有平末端的雙鏈siRNA。
在一個來自宮頸癌的高度表達hWAPL的SiHa細胞中轉(zhuǎn)導濃度為1nM的hWAPL AsiRNA和陰性對照siRNA，以評估對細胞生長的影響。
siRNA被轉(zhuǎn)化到來自HPV16陽性的宮頸癌的SiHa細胞中，其中觀察到了hWAPL的高效表達。圖10顯示了以活細胞數(shù)(x103)為縱坐標對轉(zhuǎn)導siRNA后的時間(小時)為橫坐標的作圖的結(jié)果。在圖中，“siRNA”指轉(zhuǎn)染定向于DIF-2的siRNA，“cont”指轉(zhuǎn)染對照的siRNA，“TSA”表明了在轉(zhuǎn)染siRNA后分別向培養(yǎng)物中加入組蛋白脫乙酰酶抑制劑、制滴菌素A時獲得的結(jié)果。
直到轉(zhuǎn)染hWAPL AsiRNA后20小時，可以觀察到活的腫瘤細胞數(shù)的增加。在此期間，與對照進行比較，可以表明對腫瘤生長的抑制。然后，轉(zhuǎn)導hWAPL AsiRNA的細胞開始顯示出活細胞數(shù)量的減少，并且在100小時后，只有少量細胞存活。與之相反，當通過加入制滴菌素A抑制了包含在組蛋白中的乙酰化的賴氨酸的脫乙?；M程時，減弱了hWAPL AsiRNA對細胞生長的抑制效果。
這些結(jié)果表明通過抑制hWAPL造成的細胞死亡是由于抑制了組蛋白的修飾例如乙酰化而引起的，并且暗示了hWAPL本身可能參與了組蛋白編碼的控制。
(2)體內(nèi)抑制腫瘤生長的效果對6周齡的BALB3T3/裸鼠接種2×106的SiHa細胞。從接種后10天起，對接種的腫瘤細胞分別注射hWAPL AsiRNA和陰性對照siRNA，兩天一次，共5次。
取hWAPL AsiRNA注射組中的6只動物、陰性對照siRNA注射組中的6只動物和未處理組中的5只動物，對接種的腫瘤的大小的變化進行評估。結(jié)果表明，與未處理組相比，hWAPL AsiRNA注射組中平均的腫瘤大小減少了33％。
此外，證實了我們克隆的hWAPL的cDNA核苷酸序列位于人基因組的10q23.31到q23.32。其核苷酸序列在下面顯示，同時給出了闡述的hWAPL基因中5’-非翻譯區(qū)和啟動子區(qū)的核苷酸序列以及上面的小鼠WAPL的cDNA核苷酸序列。在cDNA的ORFs中，從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG之間的區(qū)域用大寫字母書寫，而在啟動子區(qū)中，在與EST比較的基礎(chǔ)上推測的轉(zhuǎn)錄起始位點之后的區(qū)域用大寫字母書寫。
hWAPL的cDNA序列g(shù)cgagcggctgttggaggaaggaggtgggggccgggagcgcaaatggcgttgagatggtycarggccctgttcaaactccagcactgaccattcaccggcggaagcggcggcgcaggaggcggcggcggcccagcgggggcacacagcaggctctgttaccagctccagcagtggcggccagcgagagctaggcccgsgcccggccggcggcgctcgaggcggggagggaagttgcggggccgccgctcctgcccccccaaccgggcttcctatttaccgaaagcagagtccctcgcctctctcggctctcacctgccggccctgctctcccgcgcgagggttccgcgcccgcccgcgggccgtarggagcgggagaaggcggargcggccccgtggccaaagcacccgccaggcttccgaggagaatatgaaactggtgtcaaaATGACATCCAGATTTGGGAAAACATACAGTAGGAAAGGTGGAAATGGCAGTTCAAAATTCGATGAAGTCTTTTCCAACAAACGGACTACCCTTAGCACAAAATGGGGAGAGACCACATTTATGGCTAAATTAGGGCAGAAGAGGCCCAATTTCAAACCAGATATCCAAGAAATTCCGAAGAAACCTAAAGTGGAAGAAGAAAGTACTGGAGATCCTTTTGGATTTGATAGTGATGATGAGTCTCTACCAGTTTCTTCAAAGAATTTAGCCCAGGTTAAGTGTTCCTCTTATTCAGAATCTAGTGAAGCTGCTCAGTTGGAAGAGGTCACTTCAGTACTTGAAGCTAATAGCAAAATTAGTCATGTGGTCGTTGAAGACACTGTCGTTTCTGATAAATGCTTCCCTTTGGAGGACACTTTACTTGGGAAAGAAAAGAGCACAAACCGAATTGTAGAAGATGATGCAAGCATAAGTAGCTGTAATAAATTAATAACTTCAGATAAAGTGGAGAATTTTCATGAAGAACATGAAAAGAATAGTCACCATATTCACA
AAAATGCTGATGACAGTACTAAGAAACCCAATGCAGAAACTACAGTGGCTTCTGAAATCAAGGAAACAAATGATACTTGGAACTCCCAGTTTGGGAAAAGGCCAGAATCACCATCAGAAATATCTCCAATCAAGGGATCTGTTAGAACTGGTTTGTTTGAATGGGATAATGATTTTGAAGATATCAGATCAGAAGACTGTATTTTAAGTTTGGATAGTGATCCCCTTTTGGAGATGAAGGATGACGATTTTAAAAATCGATTGGAAAATCTGAATGAAGCCATTGAGGAAGATATTGTACAAAGTGTTCTTAGGCCAACCAACTGTAGGACGTACTGTAGGGCCAATAAAACGAAATCCTCCCAAGGAGCATCAAATTTTGATAAGCTGATGGACGGCACCAGTCAGGCCTTAGCCAAAGCAAACAGTGAATCGAGTAAAGATGGCCTGAATCAGGCAAAGAAAGGGGGTGTAAGTTGTGGGACCAGTTTTAGAGGGACAGTTGGACGGACTAGAGATTACACTGTTTTACATCCATCTTGCTTGTCAGTTTGTAATGTTACCATACAGGATACTATGGAACGCAGCATGGATGAGTTCACTGCATCCACTCCTGCAGATTTGGGAGAAGCTGGTCGTCTCAGAAAAAAGGCAGATATTGCAACTTCTAAGACTACTACTAGATTTCGACCTAGTAATACTAAATCCAAAAAGGATGTTAAACTTGAATTTTTTGGTTTTGAAGATCATGAGACAGGAGGTGATGAAGGAGGTTCTGGAAGTTCTAATTACAAAATTAAGTATTTTGGCTTTGATGATCTCAGTGAAAGCGAAGATGATGAAGATGATGACTGTCAAGTAGAAAGAAAGACAAGCAAAAAAAGAACTAAAACAGCTCCATCACCCTCCTTGCAGCCTCCCCCAGAAAGCAATGATAATTCCCAGGACAGTCAGTCTGGTACTAACAATGCAGAAAACTTGGATTTTACAGAGGACTTGCCTGGTGTGCCTGAAAGTGTGAAGAAGCCCATAAATAAACAAGGAGATAAATCAAAGGAAAATACCAGAAAGATTTTTAGTGGCCCCAAACGGTCACCCACAAAAGCTGTATATAATGCCAGACATTGGAATCATCCAGATTCAGAAGAACTGCCTGGGCCACCAGTAGTAAAACCTCAGAGTGTCACAGTGAGGCTGTCTTCAAAGGAACCAAATCAAAAAGATGATGGAGTTTTTAAGGCTCCTGCACCACCATCCAAAGTGATAAAAACTGTGACAATACCTACTCAGCCCTACCAAGATATAGTTACTGCACTGAAATGCAGACGAGAAGACAAAGAATTATATACTGTTGTTCAGCACGTGAAGCACTTCAACGATGTTGTAGAATTTGGTGAAAATCAAGAGTTCACTGATGACATTGAGTACTTGTTAAGTGGCTTAAAGAGCACTCAGCCTCTAAACACACGTTGCCTTAGTGTTATTAGCTTGGCTACTAAATGTGCCATGCCCAGTTTTCGAATGCACCTGAGAGCACATGGGATGGTAGCAATGGTCTTT
AAAACCTTGGATGATTCCCAGCACCATCAGAATCTGTCCCTCTGTACAGCTGCCCTCATGTATATACTGAGTAGAGATCGTTTGAACATGGATCTTGATAGAGCTAGCTTAGATCTAATGATTCGACTTTTGGAACTGGAACAAGATGCTTCATCAGCCAAGCTACTGAATGAAAAAGACATGAACAAAATTAAAGAAAAAATCCGAAGGCTCTGTGAAACTGTACACAACAAGCATCTTGATCTAGAAAATATAACGACTGGGCATTTAGCTATGGAGACATTATTATCCCTTACTTCTAAACGAGCAGGAGACTGGTTTAAAGAAGAACTCCGGCTTTTGGGTGGTCTGGATCATATTGTAGATAAAGTAAAAGAATGTGTGGATCATTTAAGTAGAGATGAGGATGAAGAGAAACTGGTAGCCTCACTATGGGGAGCAGAGAGATGTTTACGAGTTTTAGAAAGTGTAACTGTGCATAATCCCGAAAATCAAAGCTACTTGATAGCATATAAAGATTCCCAACTTATTGTTTCATCAGCTAAAGCATTACAGCATTGTGAAGAACTGATTCAGCAGTACAACCGTGCTGAGGACAGCATATGCTTAGCTGACAGTAAGCCTCTGCCTCACCAGAATGTAACTAACCATGTAGGCAAAGCAGTGGAGGACTGCATGAGGGCCATCATCGGGGTGTTGCTTAATTTAACTAATGATAATGAGTGGGGCAGCACCAAAACAGGAGAGCAGGACGGTCTCATAGGCACAGCGCTGAACTGTGTGCTTCAGGTTCCAAAGTACCTACCTCAGGAGCAGAGATTTGATATTCGAGTGCTGGGCTTAGGTCTGCTGATAAATCTAGTGGAGTATAGTGCTCGGAATCGGCACTGTCTTGTCAACATGGAAACATCGTGCTCTTTTGATTCTTCCATCTGTAGTGGAGAAGGGGATGATAGTTTAAGGATAGGTGGACAAGTTCATGCTGTCCAGGCTTTAGTGCAGCTATTCCTTGAGCGAGAGCGGGCAGCCCAGCTAGCAGAAAGTAAAACAGATGAGTTGATCAAAGATGCTCCCACCACTCAGCATGATAAGAGTGGAGAGTGGCAAGAAACAAGTGGAGAAATACAGTGGGTGTCAACTGAAAAGACTGATGGTACAGAAGAGAAACATAAGAAGGAGGAGGAGGATGAAGAACTTGACCTCAATAAAGCCCTTCAGCATGCCGGCAAACACATGGAGGATTGCATTGTGGCCTCCTACACGGCACTACTTCTTGGGTGTCTCTGCCAGGAAAGTCCAATCAATGTAACCACTGTGCGGGAATATCTGCCAGAAGGAGACTTTTCAATAATGACAGAGATGCTCAAAAAATTTTTGAGTTTTATGAATCTCACTTGTGCTGTTGGAACAACTGGCCAGAAATCTATCTCTAGAGTGATTGAATATTTGGAACATTGCTAGctgctttacctttgcttcaggtgctcggtaatgctggagctatccttagacaaagaaaagtcaagtcatgaaagaagtccttgaagatataccaagaacattcatcagtatcattcgtgtttggatttttaaggccacctgatttcttcgtcatgcattcggca
tttgctaaatgacagttactacatcaatctgcaactatcaaaaatgaggggaaaaggttcaggctgttaacaattccatgcagtatttaaatacatttactttggcagagtttataccctccccttgttttcttgctttattctgggcaagtttgaaggggaaaatttgtgctgctgttagtgcaactgctgtgtatgttgagccactgttgtcatgccagccaggtgcaaaggcagcttagctactgaggtagcgaatgttctgaggacattctagacaacagcttagttcctttttcaggctcatttgcttttgcttttttgttgaatgattccaatcgtaaataaagcttttaataattttgtgaattttttggttgttgttccctgaactactgtctatatttaaaattagatggaatccaaagatacacgggattaatagtatatttttttattcttgattaggtttgggttattgaactattttttacttttgagaccacaaccatattcaatatcataccataatgtgtcatagctataggcacaagaaaaacaacagtttgagagaatattatataagatgatgtgccctgttaaaaggaggaggcaaaatagtcaaacccagggtagtttacacttaatgctagggaggctcttaaaacattattagattttgaggaaagactctctagatatattttctaatgttcagtacaataaatataaggaagctaaaacaccaatgtggaattcctgtttccagataacatgtatattcttctatagagtgacaggatcaattgcataagcgcaaagccttaaattgctggtttagagaagacccttttttcattcagattctttgttcgtagagcagttatttgaaaaacagttatggaacacaaaacattttatagatttaatatcataacattgcaaatttttcttgtattattgttcacaccactggttatacttttttttttccttttttattgattgggcctgaatacaggctttctagagatctttttcattaatacttttaaatacctttcaggtagttacatcatgtttcttcattggatttgtaaaacttgaagccataaaaatattagtttggtgtgtattggggaaaatagctaaaagtctaatttttacccatttagactttgttatttccttgtataaagtgacaaatcggggctcttgtatcagtgccagctgtaatgtttttaaatgcagtggctgccttctattgtcttcctatttttgataatgcagattgttgggaaatctgtaaggaagtaactgattccaggcaaattgttttcttccttctacccaccccaacccctacccatcaccttttaagaacatagtacgccagtgtaacgtgggaaccattgagattgtatttgccctgagtattaaagctagcttagcaaaatacttttaaaaacatattggtaaatgatacccataaaattaaattagttatattttattttaaaatgcaaaatacattgatatttattaatcattggatttagggaaagggacagatttttggtgaacctgacttgtggcagatggtaaggaatattataaaacatttggatgagaacaatcagggcgaactgcatttttctgttacactggtaatcatttgaaaattgatttacctcagtgtttaacagttttttgttttgttttgttttttaaataataactaattgtcgagcactgatagagatgcagattttggtggggggaggtggtgggggagataatcacttcaccaactgcagtgcatttgtgtgtttttaaccctcagagaactctgcattttagggtacttgaggctgacttaactaaaagttttaaagtaaccttttttccattgtaaatatttctgtaaatactaccaattggaaattagaacagtagagtacttttctgaatccaatcctatttttattttatacagtatttctcagctgtgatctttggagcaaaagccaacggcaggaaaaaatagtttgtaccagtttcatgaagtatgtctttgggtttttgtaaataattttaactcaaataaaattgctactttcaatachWAPL基因的啟動子區(qū)序列atttttagtagagacggggtttcaccgtgttagccaggatggtctcgatctcctgacctcatgatccgcctgcctcggcctctcaaagtgctaggattacaggcgtgagccaccgtgcctggccgctgaacacaatttaaagcttcaattaatccaggtattcagtcaacaaatatttatagcacactttctgtgtgtgaggcactattctaggtgtgcttggcatataaaatgaacaaaagtcagcc
atcctcgtcctcatggagtttatattcttgtgaaacgaaatagataataaacaagttcatacacaaagcaaacgtaatgactatgttatggagaaaagcagcagggaaaaggagatacagggtgctggatgaccttaaatagcatggccaaggaaaacattactgagagacacacttgagcaaagacctgaaagcatgcagggaatgagttgtgtgtgtctcttgaggactaacagagggaacaagtacgaagagggcccacaggcaggagctggcttggcatgttctagtagtagacagaggcaggcccggcaaggtaggaagggataggagtactcaggggccagatcatgcagggccttttcaccgttaagaactttggattttagtattacaggaggacccttcagggtgtttgactaggcgggtatcatacagtattaagggtgaggatcctgaataaaaaagggctgtttccaggacaagggtcaggaagccagacttcttcgaggttgcttgtaccggtccttgtcaggcaatgtgctcctagagaatttcctttgctttgtgtttcatctacctagacagcagtgtattccccagaggacgtcactatctccagagaacatattccaattatcctgggaaatatgataattgggattataacagtactcattttctcaattctcagaatgaaaacctatccaaggcaagaacaaaagttctccagaaagcactcccctcccaattgtgaaaacccagttaacattttattagagctaccaggttatgtgaaactgttgatagttttatcactttcctttcaagatataggcaggggcagtggctcatgcctgtaattccagcactttgggaggccaaggtaggtggatggcttgagcccagaagttcaagaccagcctgggcaacaaggtgaaaccctatctctaccaaaaatacaaaaattagtggggcatgatagcatggacatgtagtcccagctacttgggaggctgaggtgggaggatggcttgaaccctggaggtggaggttgcagtgattggagatcgtgccactacattccagcctgggcgacagagcaagactctgtcaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatgtggccaggcatggtagctcacacctgtaatcccagcactttgggaggctgagccaggcggatcacaaggtcaagagatcgaaaccatcctggccaacatgcaaaacaccatctctactaaaatacaaaaaatgagctgggtgtggtggtgtgcgcctgtagtcccagctactggggaggctgaggcaggggaatcgcttgaaccagggaggcagagattgcagtgagccgagatcgcgccactgcactccagcctggtgacagagcgagactccgtctaaaaaaaaaaaaaaaaaaatatatatatatatatatataatatatgtatataattttacatgaaagaaggaaataaatgggtgcttttattcaacaaatatttattgagcacctactcttgtgccaggcagtcttctaggtgctagggttgcagcagaaaacaagacaggcagagatccctgccttcagagggagcacaacatttaagataaacatgcaaaatgcctgatatgttagatgggaagataaatgcccttaaagaaagtaaagcagggacagtgacatttaggagtgaggatgttgcaacaatttaagataggttggtcaggggagattcattgaaaagtcccatctgagtgaaaacctagaggagagaattgaagcaggctggtatctgggggagttgtaggcagagggaataggaaatacaaaggccctaaggtggggaaacagcaaggagtcaggtgtgggcagagcagaaagttggggctgcatgagcaaagggcagggcctggcccacatctcgtagagctttgtaatataaccacaacatgcaagtgtacaatttaacattttattccacatccgatggcaaagaaaaattgactgctaccaatatggtagtttctgacctgtagttccctaaatagaattctataagttgtaatacactttactacacattatcagaaaaagactaaaagttctatttagtaactccaattctgacagttctcatgtctgggctagaacaagggcatggcaatggcagaacagatgtcttctattttctttgcaggattttcttttttcagaggaaagtacaggtatgggcccactcaagtggagctccaggttagggggttctgtcctcacccaggcagcacacaggagggcagaggcccctcctaagggtactacaaacttggctctgatccatgatttcagtttctgacaaacacaacattcagtgggggaaagaaaatcaggtatctgagagcttgcacacaggcattctagcaaaaccaaaagcacctactggctacttgatgttagtgtgaagattctcatgaaatg
gagacaaccattctaggggttgaggtggccagggggatggagcctgagctgagagaactaagaaaacaaaaacaatacaacaaaaagctgttcagccatgtgttacccacactggagttctgtttgctcattctggtgtggaacccagggccctggtaagggaatgaggggacttcagggcatttgcttgcctcagtggaagcagggaggtaaggggttaaggtggtggtacagcctgcagggccaggagtctgaactccctccaggaggggcccgaggggtgtctttagtgtgagccacacaagggtacagagcccagaagagctctgcttaatattcatatactaagcttccacagactaaatacacacacacacacacacacacacacacactcacacacactttacttctcaaatcatgtaccactttctaccagattcaagaacaccaagaagtactaaagggtatccaaccgtcaagaaaaagtttgactccctcattagttgtaacatacaagtcttcccatttccttacttgtaagatagagtaatggactgggaagcagacaaggcccctgaacagcctagcatcttacctgatgcataggaggttcttaatcatctcccttcctctccctcatcctaacgaaaaatactagattgctgtcaaatgctatgggtatactttaaatcagtgcttgtcaaactttaatgtgcagcccaatcagctgggggaatcctgttaaaatgcaggttctgattcagtggagctggggtgagggataggaattatgcgttccttacaggcttccaggtgatgctacactgctgattggggatcattctttgagtggcaagaatttgacactactaagtttcattacttaacacaaccatcacataaaagccctcaaaaggcaccagtctaaacaataagcccttccacttcagcctcatgcaggcactgaccctgccaagtgtccagcactagagaggccaggcataatagacatatcctttggtcttgggaggatcacgacaccctcctacaggaagatcttgcaattgtttcctcacctcttctggttttttgatcttaccttttgcctctgatgataattaccctttaattaccacccaccaccttgtcatctaaataattatagtaagtgcagcctgcacctctgccagaagatctttaaacaaaatgataaaaacaagttcctaaactgccaattaaaaaaagagacaaaactgacccaaataaaacagtcatgtgcatcccacccacagtggaagacatggacttgtttttcatataaactacagaagaagttgatttattttgaaacaagaaaaagtactgattcagtatttaggaaattgtaaatgtcagaatataaattctgcagtcaggtaggcaaaacaatccaaccacactaaaatccaccttaaattcctcttgggaagagctgcagggtctctgaactatttttcctttatttggagtttccccgattataccggagggagctggataacttctgggtgcattaaaagcaaattatccatttgtgggagaagggcgggcttctcactgaaagcaattagtagttttctaatttcccaggtgggtctccattaaccgcctaacaaacaccaaggctgtcggagtccgacgaatcatgcacctctcttagggggaactggttgcgctactctttagaacgctgttttcccatggtagccttaaaaaaaacttaccaattttctgaattaggtaacacattgaatgggaaaaacctaagatagcacaaaaaggcgtacagcgaaaaattaagactccttcctcccgtcatccgccacctcactgtcctccctagaggcaatcgctggttcacttctttaaactttttattatggaaaatttcagatacacaagtaaagagactgtatgatgagcacatatgctcgcatcacgcagcttcaacgatgaaaaacgttctgccagcttgttttattcctctcccccagttttcataggcgtattttacagtcctgacaccagatcactctgtcaacacatcagtaggtcttaaaaaaaaaaaaacaaaaaaccataaccacattaccgttaccacacccaacaaagttaatgataattgctcaataccatccaatattctcggggccactttcaatcggtgaggggcagacggacttagaggaaggactgcagggctggaggggcgcgaaaaagcgaggggcgacgctgctcgtggcctcgggtgtccggcgcctcgcggtccccgccatcgtcacctacgccgggccaggaccgaccaggccaggtcgagggcggctcttgaccacgcgccccctgcctcccagctcccgggcggcggcctccgcaggcccggcacagctgcacagcccgcggtccccaggcaccggcgggtccctggaggggaagcgattgatacagctgcctgcactgcgccacccgcccggctgccc
atctccgtggcacctgcgtctcccggctgggccgggagctagaagtggctgccgagaccgggagggcccggccagtcgcccgctcccgctcccgcgcctggccctcggcccgcgacctcgcggacctggactacaactcccgtggggctccgacggccgggccaatggcgggcgcccggagcatgcggggcgcagcgcctgcgcggcggtttgagtaagcggctgcgcgattggctgcggggtcgggcggccgcgcggggactgtgggaagcggagtgacggaGCGAGCGGCTGTTGGAGGAAGGAGGTGGGGGCCGGGAGCGCAAATGGCGTTGAGATGGTTCAGGGCCCTGTTCAAACTCCAGCACTGACCATTCACCGGCGGAAGCG小鼠WAPL的cDNA序列ncggccgccagggaggcctaggccctgtccggccggcgcgcctgaggtggggagggaagttgcggggccgccgctcaccccccaccccccctgtcgcccgagcttcctatttaccgaagcggagccgcggactgtgacggcagcagagcccctcgcccctctcggtggcaccggtcggcactggtctctcgcgcggggctcccgcgcccgcccgcgggccgttgggagccggagaggcggaggcggcccgaggccaaagcacccgccaggcgccgaggggaatatgaaacaggtgtcaaaATGACATCCAGATTTGGAAAAACTTACAGTAGGAAAGGAGGAAATGGCAGTTCAAAATTTGATGAAGTTTTTTCCAACAAACGGACTACTCTTAGTACAAAATGGGGTGAGACCACATTTATGGCTAAATTAGGGCAGAAGAGGCCCAATTTCAAACCAGATATTCAAGAAATTCCGAAGAAACCTAAAGTAGAAGAAGAAGATACTGGAGATCCCTTTGGTTTTGATAGTGATGATGAGTCTCTACCTGTTTCTTCAAAAAATTTAGCCCAGGGTAAGGGTTCATCTTACTCAGAATCTAGTGAGGCTGCTCAGCTGgAAGAAGTCACTTCTGTATTTGAAGCTAATAGCAAATGTAGTCATGTGGTGGGTGAAGACAGTTTTGCTTCCGACAGATGCTTACTTGTGGAGGATACTTTAATTGGGAAAGAGAAGAGCATAaGTAGAATTCCAGAAGACAACGCAAACAAAAGTAGTTGCACTAAGTTGCTAACTTCAGATAAAGTGGAGAATTTTAGTGAAGAACATGAAAAAAATAGTCACCACTTTCACAAAAATGCTGAAGATAGTACTAAGAAACCCAATGCAGAAACCGCAGTGGCTTCTGAATATAAAGCTGATGAAACTAAAGAAACAAATGATACTTGGAACTCCCAGTCTGGAAAAAGAACAGAGTCTCCATCTGAAAGTTGTCCAGTCAAAGGATCTGTAAGAACTGGTTTATATGAATGGGATAATGATTTTGAAGATATCAGGTCAGAAGACTGTATTTTAAGTTTGGATAATGAGTCTCTTTTGGAGATGAAAGACGAGGATTTAAAAAATCGGATTGGAGGATTGGAAAATCTAAATGAAACCTTTGAAGAAGATATCATACAAAGTGTTCTTAGGCCAAGCAACTGTAGGACGTACTGTAGGGCCAATAAAGCGAGATCCTCACAGGGAGCATCAAATTTT
GATAAGCTAATGGATGGCACCAGTCAGTCCTTAGCCAAAGCAAACAGTGAATCAAGTAAAGATGGCCTGAATCAGGCAAAGAAAGGTAGTGCAAGTTGTGGGACCAGTTTTCGAGGAACAGTTGGACGGACTAGAGATTACACTGTTTTACATCCATCTTGCTTGTCAGTGTGTAATGTTACCATCCAGGATACTATGGAACGGAGTATGGATGAGTTCACCGCATCCACTCCTGCAGATTTAGGAGAGGCTGGCCGGCTCAGAAAAAAGGCAGATATTGCAACCTCCAAGACCACTACTAGATTTCGACCTAGTAATACTAAATCCAAAAAGGATGTTAAACTTGAATTTTTTGGTTTTGAAGATCATGATGAGACAGGAGGTGATGAAGGGGGTTCTGGAAGTTCTAATTACAAAATTAAATATTTTGGCTTTGACGATCTCAGCGAAAGTGAAGATGATGATGATGACGACTGTCAAGTGGAAAGAAAGAAAGACAAAAAAAGAACTAAAACAGCTCCATCACCTTCCCAGCAGCCTCCTCCTGAAAGCAGCGACAATTCCCAGGATAGTCAGTCTAGTACTAATAATGCAGAAAACTTGGATTTTACAGAGGACTTGCCTGGTGTGCCTGAGAGTGTGAAGAAGCCCATAAGTAAACAAGGAGATAAATCCAAGGAAAATACCAGAAAGATTTTTAGTGGCCCCAAACGGTCACCTACAAAAGCTGTATATAATGCCAGGCATTGGAACCATCCAGACTCGGAAGAATTGCCTGGACCACCAATAGCAAAACCTCAGCGTGTCACAGTGAGGCTGTCTTCAAAGGAACCAAATCAAAAAGATGATGGAGTTTTTAAGGCTCCTGCACCACCACTCAAAGTGATAAAAACTGTGACAATACCTACTCAGCCCTACCAAGAAATAGTTACTGCACTGAAATGCAGAAAAGAAGACAAAGAATTATATACGGTTGTTCAGCACGTGAAACACTTCAATGATGTGGTGGAATTTGGTGAAAATCAAGAGTTCACTGATGACATTGAATACTTGTTAAGTGGCTTAAAGAGTACTCAGCCTCTAAACACACGTTGCCTTAGTGTTATCAGCTTAGCTACTAAATGTGCCATGCCCAGTTTTCGGATGCATCTGAGGGCACATGGGATGGTTGCAAtGGTCTTTAAAACTcTGGATGATTCCCAGCATCATCAGAATCTGTCCCTCTGTACAGCTGCTCTCATGTACATATTGAGTAGAGACCGtTTGAACATGGATCTTGATAGGGCCAGCCTAGATCTCATGATTCGGCTTGTGGAGTTGGAACAAGATGCCTCTTCAGCTAAGCTACTGAATGAAAAAGACATGAACAAGATCAAAGAAAAGATCCGAAGACTCTGTGAAACTGTGCACAACAAGCATCTTGATCTAGAAAACATAACGACTGGTCATTTAGCTATGGAGACATTGCTGTCCCTCACTTCCAAACGAGCAGGAGATTGGTTTAAAGAAGAGCTCCGACTTCTGGGTGGTCTGGATCATATTGTAGATAAAGTAAAAGAGTG
TGTGGATCATTTAAGTAGAGATGATGAGGACGAAGAGAAACTAGTAGCCTCATTATGGGGAGCAGAGAGATGTTTACGAGTTTTAGAGAGTGTAACAGTGCATAATCCAGAGAATCAAAGCTACTTGATAGCCTATAAAGATTCACAACTCATTATTTCATCAGCTAAAGCATTACAGCATtGTGAAGACCTGAATCAGCAGTACAACCGTGCTGAGAACAGCATCTGTGTAGCAGACAGTAACCCTCTGCCTTACCAGAATGTAACTAACCATGtgGGcaAAGCAGTGGAGGACTGCaTGAGGGCTATAATTGGAGTATTGCTCAATTTAACTAATGATAATGAGTGGGGCAGCACAAAGACAGGAGAACAAGAAGGACTCATAGGCACAGCGATGAACTGTGTTCTTCAGGTTCCAAAGTACCTACCTCAGGAGCAGAGATTTGATATTCGAGTGCTGGGATTGGGTCTACTCATAAACCTGGTGGAGTATAGTGcCCGGAATCGACACTGCCTTGTCAACATGCAAACATCCTGTTCCTTTGATTCCTCCTTCTCTAGTGGAGAAGGCGATCATAGTTTAAGGCTAGCCGGACAAGTTCATGCTGTTCAAGCTTTAGTGCAGCTATTTCTCGAACGAGAGAGAGCAGCACAATTGGCAGAAAGTAAAACAGATGAATTGATTAAAGATGCTCCTACCACTCAGCATGATAAGAGTGGAGAGTGGCAAGAAACAAGTGGAGAAATACAGTGGGTATCAACTGAAAAGACTGATGGTGCAGAGGAGAAGCAGAAGAAGGAGGAGGAGGATGAAGAACTTGACCTCAATAAAGCCCTTCAGCATGCTGGCAAACACATGGAGGATTGCATCGTAGCCTCCTACACAGCCCTGCTTCTTGGGTGTCTCTGCCAGGAAAGTCCAATCAATGTAACTACAGTAAGGGAATATCTTCCAGAAGGAGATTTCTCCATAATGACAGAGATGCTTAAAAAGTTCTTAAGCTTCATGAATCTTACGTGTGCTGTTGGAACAACAGGCCAGAAGTCTATCTCTAGAGTGATTGAATATTTGGAACATTGCTAGctgctttacctttgcttcaggtgcttggtaatgctgaagctatccttagacaaagaaaattggatttttatgatcacccgatttcttcatcatgcattctgcgtttgctaaatgacagttactacatcaatctgcagctatcaaaaatgagggaaaaggttcaggctgttaacaatcccatgcagtatttaaatacacttac在描述和圖表中，當對核苷酸和/或氨基酸縮寫時，縮寫與IUPAC-IUB生物化學命名委員會或本領(lǐng)域的常規(guī)縮寫一致。下面列出了一些例子。當氨基酸存在光學異構(gòu)體時，除非特別說明，都是指L-異構(gòu)體。
DNA脫氧核糖核酸
cDNA互補的脫氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鳥嘌呤C胞嘧啶I肌苷R腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)Y胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)M腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)K鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)S鳥嘌呤(G)或胞嘧啶(C)W腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)B鳥嘌呤(G)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)D腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)V腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)或胞嘧啶(C)N腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)或未知的或其它堿基RNA核糖核酸mRNA信使核糖核酸dATP脫氧腺苷三磷酸dTTP脫氧胸苷三磷酸dGTP脫氧鳥苷三磷酸dCTP脫氧胞苷三磷酸ATP腺苷三磷酸EDTA乙二胺四乙酸SDS十二烷基硫酸鈉BHA二苯甲基胺pMBHA對-甲基二苯甲基胺Tos對-甲苯磺酰Bzl苯甲基
Bom芐氧甲基Boc叔-丁氧羰基DCM二氯甲烷HOBt1-羥基苯并三唑DCCN，N’-二環(huán)己基碳二亞胺TFA三氟乙酸DIEA二異丙基乙胺Gly或G甘氨酸Ala或A丙氨酸Val或V纈氨酸Leu或L亮氨酸Ile或I異亮氨酸Ser或S絲氨酸Thr或T蘇氨酸Cys或C半胱氨酸Met或M甲硫氨酸Glu或E谷氨酸Asp或D天冬氨酸Lys或K賴氨酸Arg或R精氨酸His或H組氨酸Phe或F苯丙氨酸Tyr或Y酪氨酸Trp或W色氨酸Pro或P脯氨酸Asn或N天冬酰胺Gln或Q谷氨酰胺pGlu焦谷氨酸Tyr(I)3-碘酪氨酸DMFN，N-二甲基甲酰胺
FmocN-9-芴基甲氧基羰基Trt三苯甲基Pbf2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰Clt2-氯三苯甲基But叔丁基；以及Met(O)甲硫氨酸亞砜工業(yè)實用性本發(fā)明的hWAPL癌基因的全長核苷酸序列可用于生產(chǎn)由hWAPL癌基因編碼的重組hWAPL致癌蛋白，以及用于研究在來自多種上皮細胞的細胞系中hWAPL致癌蛋白的過量表達誘導癌變的機理。此外，在本發(fā)明中，鑒定的hWAPL癌基因的啟動子區(qū)可以提供一個新的靶，在通過抑制癌基因的轉(zhuǎn)錄從而抑制由hWAPL致癌蛋白的過量表達所誘導的癌變的機制的基礎(chǔ)上，用于研究癌癥的預防或者治療。此外，生產(chǎn)本發(fā)明的hWAPL癌基因全長核苷酸序列的重組子，hWAPL致癌蛋白，可用于制備核酸探針或PCR引物，用于檢測由hWAPL癌基因轉(zhuǎn)錄引起的mRNA的表達，或者用于制備特異性抗體，用于檢測翻譯的hWAPL致癌蛋白肽。因此，這使得使用多種診斷試劑盒檢測直接參與癌癥發(fā)生的hWAPL癌基因的過量表達成為可能。
序列表<110>日本電氣株式會社(NEC Corporation)黑田雅彥(Masahiko KURODA)<120>新的癌基因、從其衍生的重組蛋白及其應(yīng)用(Novel Cancer Gene And Its Use)<130>SPI065619-47<160>2<210>1<211>
<212>PRT<213>人<400>1Met Thr Ser Arg Phe Gly Lys Thr Tyr Ser Arg Lys Gly Gly Asn Gly1 5 10 15Ser Ser Lys Phe Asp Glu Val Phe Ser Asn Lys Arg Thr Thr Leu Ser20 25 30Thr Lys Trp Gly Glu Thr Thr Phe Met Ala Lys Leu Gly Gln Lys Arg35 40 45Pro Asn Phe Lys Pro Asp Ile Gln Glu Ile Pro Lys Lys Pro Lys Val50 55 60Glu Glu Glu Ser Thr Gly Asp Pro Phe Gly Phe Asp Ser Asp Asp Glu65 70 75 80Ser Leu Pro Val Ser Ser Lys Asn Leu Ala Gln Val Lys Cys Ser Ser85 90 95Tyr Ser Glu Ser Ser Glu Ala Ala Gln Leu Glu Glu Val Thr Ser Val100 105 110Leu Glu Ala Asn Ser Lys Ile Ser His Val Val Val Glu Asp Thr Val115 120 125Val Ser Asp Lys Cys Phe Pro Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Lys Glu130 135 140Lys Ser Thr Asn Arg Ile Val Glu Asp Asp Ala Ser Ile Ser Ser Cys145 150 155 160Asn Lys Leu Ile Thr Ser Asp Lys Val Glu Asn Phe His Glu Glu His165 170 175Glu Lys Asn Ser His His Ile His Lys Asn Ala Asp Asp Ser Thr Lys180 185 190
Lys Pro Asn Ala Glu Thr Thr Val Ala Ser Glu Ile Lys Glu Thr Asn195 200 205Asp Thr Trp Asn Ser Gln Phe Gly Lys Arg Pro Glu Ser Pro Ser Glu210 215 220Ile Ser Pro Ile Lys Gly Ser Val Arg Thr Gly Leu Phe Glu Trp Asp225 230 235 240Asn Asp Phe Glu Asp Ile Arg Ser Glu Asp Cys Ile Leu Ser Leu Asp245 250 255Ser Asp Pro Leu Leu Glu Met Lys Asp Asp Asp Phe Lys Asn Arg Leu260 265 270Glu Asn Leu Asn Glu Ala Ile Glu Glu Asp Ile Val Gln Ser Val Leu275 280 285Arg Pro Thr Asn Cys Arg Thr Tyr Cys Arg Ala Asn Lys Thr Lys Ser290 295 300Ser Gln Gly Ala Ser Asn Phe Asp Lys Leu Met Asp Gly Thr Ser Gln305 310 315 320Ala Leu Ala Lys Ala Asn Ser Glu Ser Ser Lys Asp Gly Leu Asn Gln325 330 335Ala Lys Lys Gly Gly Val Ser Cys Gly Thr Ser Phe Arg Gly Thr Val340 345 350Gly Arg Thr Arg Asp Tyr Thr Val Leu His Pro Ser Cys Leu Ser Val355 360365Cys Asn Val Thr Ile Gln Asp Thr Met Glu Arg Ser Met Asp Glu Phe370 375 380Thr Ala Ser Thr Pro Ala Asp Leu Gly Glu Ala Gly Arg Leu Arg Lys385 390 395 400Lys Ala Asp Ile Ala Thr Ser Lys Thr Thr Thr Arg Phe Arg Pro Ser405 410 415Asn Thr Lys Ser Lys Lys Asp Val Lys Leu Glu Phe Phe Gly Phe Glu420 425 430Asp His Glu Thr Gly Gly Asp Glu Gly Gly Ser Gly Ser Ser Asn Tyr435 440 445Lys Ile Lys Tyr Phe Gly Phe Asp Asp Leu Ser Glu Ser Glu Asp Asp450 455 460Glu Asp Asp Asp Cys Gln Val Glu Arg Lys Thr Ser Lys Lys Arg Thr465 470 475480Lys Thr Ala Pro Ser Pro Ser Leu Gln Pro Pro Pro Glu Ser Asn Asp485 490 495Asn Ser Gln Asp Ser Gln Ser Gly Thr Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asp500 505 510Phe Thr Glu Asp Leu Pro Gly Val Pro Glu Ser Val Lys Lys Pro Ile
515 520 525Asn Lys Gln Gly Asp Lys Ser Lys Glu Asn Thr Arg Lys Ile Phe Ser530 535 540Gly Pro Lys Arg Ser Pro Thr Lys Ala Val Tyr Asn Ala Arg His Trp545 550 555560Asn His Pro Asp Ser Glu Glu Leu Pro Gly Pro Pro Val Val Lys Pro565 570 575Gln Ser Val Thr Val Arg Leu Ser Ser Lys Glu Pro Asn Gln Lys Asp580 585 590Asp Gly Val Phe Lys Ala Pro Ala Pro Pro Ser Lys Val Ile Lys Thr595 600 605Val Thr Ile Pro Thr Gln Pro Tyr Gln Asp Ile Val Thr Ala Leu Lys610 615 620Cys Arg Arg Glu Asp Lys Glu Leu Tyr Thr Val Val Gln His Val Lys625 630 635640His Phe Asn Asp Val Val Glu Phe Gly Glu Asn Gln Glu Phe Thr Asp645 650 655Asp Ile Glu Tyr Leu Leu Ser Gly Leu Lys Ser Thr Gln Pro Leu Asn660 665 670Thr Arg Cys Leu Ser Val Ile Ser Leu Ala Thr Lys Cys Ala Met Pro675 680 685Ser Phe Arg Met His Leu Arg Ala His Gly Met Val Ala Met Val Phe690 695 700Lys Thr Leu Asp Asp Ser Gln His His Gln Asn Leu Ser Leu Cys Thr705 710 715 720Ala Ala Leu Met Tyr Ile Leu Ser Arg Asp Arg Leu Asn Met Asp Leu725 730 735Asp Arg Ala Ser Leu Asp Leu Met Ile Arg Leu Leu Glu Leu Glu Gln740 745 750Asp Ala Ser Ser Ala Lys Leu Leu Asn Glu Lys Asp Met Asn Lys Ile755 760 765Lys Glu Lys Ile Arg Arg Leu Cys Glu Thr Val His Asn Lys His Leu770 775 780Asp Leu Glu Asn Ile Thr Thr Gly His Leu Ala Met Glu Thr Leu Leu785 790 795 800Ser Leu Thr Ser Lys Arg Ala Gly Asp Trp Phe Lys Glu Glu Leu Arg805 810 815Leu Leu Gly Gly Leu Asp His Ile Val Asp Lys Val Lys Glu Cys Val820 825830Asp His Leu Ser Arg Asp Glu Asp Glu Glu Lys Leu Val Ala Ser Leu835 840 845
Trp Gly Ala Glu Arg Cys Leu Arg Val Leu Glu Ser Val Thr Val His850 855 860Asn Pro Glu Asn Gln Ser Tyr Leu Ile Ala Tyr Lys Asp Ser Gln Leu865 870 875 880Ile Val Ser Ser Ala Lys Ala Leu Gln His Cys Glu Glu Leu Ile Gln885 890 895Gln Tyr Asn Arg Ala Glu Asp Ser Ile Cys Leu Ala Asp Ser Lys Pro900 905 910Leu Pro His Gln Asn Val Thr Asn His Val Gly Lys Ala Val Glu Asp915 920 925Cys Met Arg Ala Ile Ile Gly Val Leu Leu Asn Leu Thr Asn Asp Asn930 935 940Glu Trp Gly Ser Thr Lys Thr Gly Glu Gln Asp Gly Leu Ile Gly Thr945 950 955 960Ala Leu Asn Cys Val Leu Gln Val Pro Lys Tyr Leu Pro Gln Glu Gln965 970 975Arg Phe Asp Ile Arg Val Leu Gly Leu Gly Leu Leu Ile Asn Leu Val980 985 990Glu Tyr Ser Ala Arg Asn Arg His Cys Leu Val Asn Met Glu Thr Ser995 10001005Cys Ser Phe Asp Ser Ser Ile Cys Ser Gly Glu Gly Asp Asp Ser Leu101010151020Arg Ile Gly Gly Gln Val His Ala Val Gln Ala Leu Val Gln Leu Phe1025103010351040Leu Glu Arg Glu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Glu Ser Lys Thr Asp Glu104510501055Leu Ile Lys Asp Ala Pro Thr Thr Gln His Asp Lys Ser Gly Glu Trp10601065 1070Gln Glu Thr Ser Gly Glu Ile Gln Trp Val Ser Thr Glu Lys Thr Asp1075 10801085Gly Thr Glu Glu Lys His Lys Lys Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Asp1090 10951100Leu Asn Lys Ala Leu Gln His Ala Gly Lys His Met Glu Asp Cys Ile11051110 11151120Val Ala Ser Tyr Thr Ala Leu Leu Leu Gly Cys Leu Cys Gln Glu Ser11251130 1135Pro Ile Asn Val Thr Thr Val Arg Glu Tyr Leu Pro Glu Gly Asp Phe1140 1145 1150Ser Ile Met Thr Glu Met Leu Lys Lys Phe Leu Ser Phe Met Asn Leu115511601165Thr Cys Ala Val Gly Thr Thr Gly Gln Lys Ser Ile Ser Arg Val Ile
11701175 1180Glu Tyr Leu Glu His Cys11851190<210>2<211>3570<212>DNA<213>人<400>2atgacatcca gatttgggaa aacatacagt aggaaaggtg gaaatggcag ttcaaaattc 60gatgaagtct tttccaacaa acggactacc cttagcacaa aatggggaga gaccacattt 120atggctaaat tagggcagaa gaggcccaat ttcaaaccag atatccaaga aattccgaag 180aaacctaaag tggaagaaga aagtactgga gatccttttg gatttgatag tgatgatgag 240tctctaccag tttcttcaaa gaatttagcc caggttaagt gttcctctta ttcagaatct 300agtgaagctg ctcagttgga agaggtcact tcagtacttg aagctaatag caaaattagt 360catgtggtcg ttgaagacac tgtcgtttct gataaatgct tccctttgga ggacacttta 420cttgggaaag aaaagagcac aaaccgaatt gtagaagatg atgcaagcat aagtagctgt 480aataaattaa taacttcaga taaagtggag aattttcatg aagaacatga aaagaatagt 540caccatattc acaaaaatgc tgatgacagt actaagaaac ccaatgcaga aactacagtg 600gcttctgaaa tcaaggaaac aaatgatact tggaactccc agtttgggaa aaggccagaa 660tcaccatcag aaatatctcc aatcaaggga tctgttagaa ctggtttgtt tgaatgggat 720aatgattttg aagatatcag atcagaagac tgtattttaa gtttggatag tgatcccctt 780ttggagatga aggatgacga ttttaaaaat cgattggaaa atctgaatga agccattgag 840gaagatattg tacaaagtgt tcttaggcca accaactgta ggacgtactg tagggccaat 900aaaacgaaat cctcccaagg agcatcaaat tttgataagc tgatggacgg caccagtcag 960gccttagcca aagcaaacag tgaatcgagt aaagatggcc tgaatcaggc aaagaaaggg 1020ggtgtaagtt gtgggaccag ttttagaggg acagttggac ggactagaga ttacactgtt 1080ttacatccat cttgcttgtc agtttgtaat gttaccatac aggatactat ggaacgcagc 1140atggatgagt tcactgcatc cactcctgca gatttgggag aagctggtcg tctcagaaaa 1200aaggcagata ttgcaacttc taagactact actagatttc gacctagtaa tactaaatcc 1260aaaaaggatg ttaaacttga attttttggt tttgaagatc atgagacagg aggtgatgaa 1320ggaggttctg gaagttctaa ttacaaaatt aagtattttg gctttgatga tctcagtgaa 1380agcgaagatg atgaagatga tgactgtcaa gtagaaagaa agacaagcaa aaaaagaact 1440aaaacagctc catcaccctc cttgcagcct cccccagaaa gcaatgataa ttcccaggac 1500agtcagtctg gtactaacaa tgcagaaaac ttggatttta cagaggactt gcctggtgtg 1560cctgaaagtg tgaagaagcc cataaataaa caaggagata aatcaaagga aaataccaga 1620aagattttta gtggccccaa acggtcaccc acaaaagctg tatataatgc cagacattgg 1680aatcatccag attcagaaga actgcctggg ccaccagtag taaaacctca gagtgtcaca 1740gtgaggctgt cttcaaagga accaaatcaa aaagatgatg gagtttttaa ggctcctgca 1800ccaccatcca aagtgataaa aactgtgaca atacctactc agccctacca agatatagtt 1860
actgcactga aatgcagacg agaagacaaa gaattatata ctgttgttca gcacgtgaag 1920cacttcaacg atgttgtaga atttggtgaa aatcaagagt tcactgatga cattgagtac 1980ttgttaagtg gcttaaagag cactcagcct ctaaacacac gttgccttag tgttattagc 2040ttggctacta aatgtgccat gcccagtttt cgaatgcacc tgagagcaca tgggatggta 2100gcaatggtct ttaaaacctt ggatgattcc cagcaccatc agaatctgtc cctctgtaca 2160gctgccctca tgtatatact gagtagagat cgtttgaaca tggatcttga tagagctagc 2220ttagatctaa tgattcgact tttggaactg gaacaagatg cttcatcagc caagctactg 2280aatgaaaaag acatgaacaa aattaaagaa aaaatccgaa ggctctgtga aactgtacac 2340aacaagcatc ttgatctaga aaatataacg actgggcatt tagctatgga gacattatta 2400tcccttactt ctaaacgagc aggagactgg tttaaagaag aactccggct tttgggtggt 2460ctggatcata ttgtagataa agtaaaagaa tgtgtggatc atttaagtag agatgaggat 2520gaagagaaac tggtagcctc actatgggga gcagagagat gtttacgagt tttagaaagt 2580gtaactgtgc ataatcccga aaatcaaagc tacttgatag catataaaga ttcccaactt 2640attgtttcat cagctaaagc attacagcat tgtgaagaac tgattcagca gtacaaccgt 2700gctgaggaca gcatatgctt agctgacagt aagcctctgc ctcaccagaa tgtaactaac 2760catgtaggca aagcagtgga ggactgcatg agggccatca tcggggtgtt gcttaattta 2820actaatgata atgagtgggg cagcaccaaa acaggagagc aggacggtct cataggcaca 2880gcgctgaact gtgtgcttca ggttccaaag tacctacctc aggagcagag atttgatatt 2940cgagtgctgg gcttaggtct gctgataaat ctagtggagt atagtgctcg gaatcggcac 3000tgtcttgtca acatggaaac atcgtgctct tttgattctt ccatctgtag tggagaaggg 3060gatgatagtt taaggatagg tggacaagtt catgctgtcc aggctttagt gcagctattc 3120cttgagcgag agcgggcagc ccagctagca gaaagtaaaa cagatgagtt gatcaaagat 3180gctcccacca ctcagcatga taagagtgga gagtggcaag aaacaagtgg agaaatacag 3240tgggtgtcaa ctgaaaagac tgatggtaca gaagagaaac ataagaagga ggaggaggat 3300gaagaacttg acctcaataa agcccttcag catgccggca aacacatgga ggattgcatt 3360gtggcctcct acacggcact acttcttggg tgtctctgcc aggaaagtcc aatcaatgta 3420accactgtgc gggaatatct gccagaagga gacttttcaa taatgacaga gatgctcaaa 3480aaatttttga gttttatgaa tctcacttgt gctgttggaa caactggcca gaaatctatc 3540tctagagtga ttgaatattt ggaacattgc 3570
權(quán)利要求
1.一種反義多核苷酸，其含有與核苷酸序列SEQ.ID.No.2的部分核苷酸序列互補的核苷酸序列，所述部分核苷酸序列是一種具有至少15到300個堿基長度的DNA片段。
2.一種探針雜交試劑盒，其含有權(quán)利要求1中所述的反義多核苷酸作為DNA探針，可用于檢測含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA、其部分核苷酸序列或由所述mRNA制備的cDNA。
3.一種診斷試劑盒，其含有權(quán)利要求1中所述的反義多核苷酸作為雜交探針，通過探針雜交方法可用于檢測含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA的表達，所述mRNA被翻譯為含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1的致癌蛋白。
4.一種引物對，其用于對含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的cDNA進行PCR擴增，由下列成對引物組成核苷酸序列5’-TTGGATCCATGACATCCAGATTTGGGAAAACATACAGTAGG-3’；和核苷酸序列5’-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCAATCACTCTAGA-3’。
5.一種引物對，其用于對含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的cDNA的部分鏈進行PCR擴增，由下列成對引物組成5’-GAATTCATAGGCACAGCGCTGAACTGTGTG-3’；和5’-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCA-3’。
6.一種雙鏈的短鏈干擾RNA，其能夠抑制含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA在宮頸癌細胞中的表達，其中siRNA的核苷酸序列為CGGACTACCCTTAGCACAA。
7.一種藥物組合物，其用于抑制含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA在宮頸癌細胞中的表達，從而阻止癌細胞的生長，其中所述藥物組合物含有權(quán)利要求6中所述的雙鏈的短鏈干擾RNA。
全文摘要
本發(fā)明從人中鑒定了一個新的癌基因的全部核苷酸序列，該癌基因直接參與了例如由HPV感染宮頸上皮細胞而誘導的宮頸癌的癌變機制，并鑒定了由該癌基因編碼的致癌蛋白的氨基酸序列，還提供了編碼衍生自新癌基因的致癌蛋白肽鏈的全長多核苷酸，可用于致癌蛋白的重組生產(chǎn)，并提供了由此重組生產(chǎn)的致癌蛋白的肽鏈。具體來說，本發(fā)明提供了來自人的參與了宮頸癌的發(fā)生的新的癌基因多核苷酸，其中含有編碼氨基酸序列SEQ.ID.No.1的核苷酸序列，尤其是SEQ.ID.No.2的核苷酸序列的多核苷酸。
文檔編號C12P21/00GK1982324SQ200610149330
公開日2007年6月20日 申請日期2004年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月20日
發(fā)明者齊藤彰, 黑田雅彥 申請人:日本電氣株式會社, 黑田雅彥