一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組s1蛋白及其亞單位疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白及其亞單位疫苗，該蛋白系將含有KDEL3基因序列、缺失III區(qū)的銅綠假單胞菌外毒素A基因序列和S1(m)基因序列的融合基因片段PE(△III)-S1(m)-KDEL3克隆至桿狀病毒載體中獲得重組載體，將所述的重組載體陽轉(zhuǎn)DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組載體位點特異性轉(zhuǎn)座獲得重組桿狀質(zhì)粒，將該重組桿狀質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得重組Sf9細(xì)胞，經(jīng)該重組Sf9細(xì)胞表達(dá)獲得。本發(fā)明在對S1基因哺乳動物密碼子偏嗜性優(yōu)化的基礎(chǔ)上，首次利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PE(△III)-S1(m)-KDEL3融合蛋白，以期獲得正確并高效表達(dá)融合蛋白的重組桿狀病毒。經(jīng)IFA和Western?blot驗證重組桿狀病毒可正確表達(dá)融合蛋白且融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
【專利說明】一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白及其亞單 位疫苗 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1 蛋白及其亞單位疫苗。 【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是具有囊膜的單鏈 正股RNA病毒，屬于I型冠狀病毒。同其他冠狀病毒一樣，PEDV S蛋白在誘導(dǎo)中和抗體、結(jié) 合細(xì)胞、促進(jìn)病毒和細(xì)胞融合等方面發(fā)揮著重要作用[2]。研究表明，S蛋白的中和表位區(qū)域 大多位于S1區(qū)；另外，比較PEDV變異毒株和傳統(tǒng)毒株，S蛋白變異最大，主要變異發(fā)生在S1 區(qū)。
[0003] 銅綠假單胞菌外毒素 A (Pseudomonas exotoxin A, PEA)是由銅綠假單胞菌分泌的 細(xì)胞毒性外毒素。PEA由613個氨基酸組成，可分為三個不同結(jié)構(gòu)域：1區(qū)包括la (l-252aa) 和Ib(365-404aa)兩部分，具有受體識別功能；II區(qū)（253-364aa)與毒素的跨膜就位有關(guān)； III區(qū)（405-613aa)是細(xì)胞毒性區(qū)域。PEA因具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性常作為生物導(dǎo)彈用于腫瘤 的治療，Pirker等將PEA和抗體偶聯(lián)用于抗腫瘤治療，取得了較好的結(jié)果；Batra等將PEA 和抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體偶聯(lián)制備免疫毒素，經(jīng)小鼠試驗發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗腫瘤活性。另外， PEA還具有佐劑的功能，缺失了 III區(qū)的ΡΕΑ(ΡΕ( Λ III))沒有細(xì)胞毒性，但具有結(jié)合細(xì)胞 并進(jìn)入細(xì)胞的功能，ΡΕ( Λ III)可以作為載體使保護(hù)性抗原進(jìn)入細(xì)胞，促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞 遞呈功能。LyS-ASp-Gl U-LeU(KEDL)基序是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向轉(zhuǎn)運信號，能有效使與之偶聯(lián)的 外源抗原從高爾基體轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，延長在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留時間。
[0004] 目前，研究人員嘗試了多種方法研究關(guān)于PEDV的疫苗，比如DNA疫苗、轉(zhuǎn)基因植物 疫苗和重組腺病毒疫苗等，但均沒有取得較好的免疫效果。因此需要提供一種具有良好反 應(yīng)原性的PEDV的疫苗。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白及其亞單 位疫苗。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] -種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白，該蛋白系將含有KDEL3基因 序列、缺失III區(qū)的銅綠假單胞菌外毒素 A基因序列和Sl(m)基因序列的融合基因片段 ΡΕ(Λ III)-Sl(m)-KDEL3克隆至桿狀病毒載體中獲得重組載體，將所述的重組載體陽轉(zhuǎn) DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組載體位點特異性轉(zhuǎn)座獲得重組桿狀質(zhì)粒，將該重組桿狀質(zhì)粒 在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得重組Sf9細(xì)胞，經(jīng)該重組Sf9細(xì)胞表達(dá)獲得。
[0008] 上述SI (m)基因的序列為SEQ ID N0. 7,該SI (m)基因是以PEDV新變異株S基因 序列GenBank :KF453516為基礎(chǔ)，按昆蟲細(xì)胞偏性密碼子，設(shè)計出的密碼子優(yōu)化的基因，即 SI (m)基因。將該SI (m)基因克隆至pVAX載體，可構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX-Sl (m)，該重組質(zhì)粒 pVAX-Sl(m)可通過市場購買獲得。
[〇〇〇9] 所述的桿狀病毒載體為pFastBac?Dual質(zhì)粒。
[〇〇1〇] 一種重組載體pF-PE ( Λ III) -SI (m) -KDEL3,其在于是將含有KDEL3基因序 列、缺失III區(qū)的銅綠假單胞菌外毒素 A基因序列和Sl(m)基因序列的融合基因片段 ΡΕ( Λ III)-S1 (m)-KDEL3 克隆至桿狀病毒載體 pFastBac?Dual 質(zhì)粒的 Notl 和 Hindlll 兩 個酶切位點間所得。
[0011] 上述的重組載體pF-PE( Λ III)-Sl(m)-KDEL3,其克隆過程包含以下步驟：
[0012] (1)以pVAX-Sl (m)質(zhì)粒為模板，引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 3經(jīng)PCR擴(kuò)增含有 KDEL3基因序列的SI (m)，即SI (m)-KDEL3 ;以經(jīng)煮沸的假單胞菌菌液為模板，引物SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5擴(kuò)增缺失III區(qū)的PE基因，S卩PE( Λ III);
[0013] (2)通過Notl和Xhal兩個酶切位點將所得到的基因片段ΡΕ( Λ III)克隆 入桿狀病毒載體中獲得重組載體pF_PE( Λ III);通過Xhal和Hindlll兩個酶切位點 將所得到的基因片段Sl(m)-KDEL3克隆入重組載體pF-PE(A III)中獲得重組載體 pF-PE( Λ III)-S1(m)-KDEL3。
[0014] 一種重組重組桿狀質(zhì)粒，是將上述的重組載體pF-PE ( Λ III) -SI (m) -KDEL3陽轉(zhuǎn) DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組載體位點特異性轉(zhuǎn)座所得。
[0015] 一種重組Sf9細(xì)胞，其在于含有上述的重組桿狀質(zhì)粒。
[〇〇16] 上述豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白的制備方法，包括如下步驟：
[0017] (1)以pVAX-Sl (m)質(zhì)粒為模板，引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 3經(jīng)PCR擴(kuò)增含有 KDEL3基因序列的SI (m)，即SI (m)-KDEL3 ;以經(jīng)煮沸的假單胞菌菌液為模板，引物SEQ ID Ν0· 4和SEQ ID Ν0· 5擴(kuò)增缺失III區(qū)的PE基因，S卩PE( Λ III);
[0018] (2)通過Notl和Xhal兩個酶切位點將所得到的基因片段ΡΕ( Λ III)克隆 入桿狀病毒載體中獲得重組載體pF_PE( Λ III);通過Xhal和Hindlll兩個酶切位點 將所得到的基因片段Sl(m)-KDEL3克隆入重組載體pF-PE(A III)中獲得重組載體 pF-PE( Λ III)-SI(m)-KDEL3 ;
[0019] (3)將所述的重組載體pF-PE ( Λ III)-SI (m)-KDEL3陽轉(zhuǎn)DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn) 行重組載體位點特異性轉(zhuǎn)座獲得重組桿狀質(zhì)粒，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將重組桿狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞，經(jīng)該重組Sf9細(xì)胞表達(dá)獲得所述的重組蛋白。
[0020] 上述的制備方法，其所述的桿狀病毒載體為pFastBac?Dual質(zhì)粒。
[0021] 一種亞單位疫苗，其在于包含有上述的重組Sf9細(xì)胞表達(dá)的豬流行性腹瀉病毒新 變異毒株重組S1蛋白及佐劑。
[0022] 本發(fā)明所述的KDEL3是3個相同蛋白質(zhì)序列（Lys-Asp-Glu-Leu，KDEL)的串聯(lián)。
[0023] 本發(fā)明根據(jù)哺乳動物細(xì)胞偏性密碼子設(shè)計優(yōu)化豬流行性腹瀉病毒（PEDV)變 異毒株S1基因（Sl(m))，通過PCR方法擴(kuò)增構(gòu)建成功Sl(m)基因、含有KDEL3基因序列 的Sl(m)基因（Sl(m)-KDEL3)、含有KDEL3基因序列并缺失III區(qū)的銅綠假單胞菌外毒 素 A基因（ΡΕ(Λ III)-KDEL3)和ΡΕ(Λ III)-Sl(m)-KDEL3融合基因片段，分別克隆至 pFastBac?Dual質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序鑒定獲得重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài) 細(xì)胞，經(jīng)兩次藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定獲得重組Bacmid質(zhì)粒。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將重組Bacmid 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，經(jīng)過重組Sf9細(xì)胞表達(dá)獲得四種重組桿狀病毒。經(jīng)PCR、IFA和Western blot鑒定四種重組桿狀病毒均能在Sf9細(xì)胞中正確表達(dá)目的蛋白SI (m)、SI (m)-KDEL3和 PE ( Λ III) -S1 (m) -KDEL3。將這3種蛋白分別加入佐劑，制成PEDV亞單位疫苗，進(jìn)行小 鼠免疫試驗。將50只清潔級小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，第1、2和3免疫組分別免疫 rBac-PE ( Λ III) -SI (m) -KDEL3、rBac-Sl (m) -KDEL3 和 rBac-Sl (m);第 4 和 5 免疫組分別 免疫rBac-PE ( Λ III)-KDEL3和PBS，為陰性對照組。免疫途徑是背部皮下多點注射，首免 后21d以相同途徑和劑量加強(qiáng)免疫。首免后35d和49d采血和采取脾臟，檢測特異性抗體、 中和抗體、淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)、IL-4和IFN-γ含量。結(jié)果顯示：首免后21d，第1、2和3免 疫組均能產(chǎn)生PEDV特異性抗體和中和抗體，首免后49d達(dá)到最高，與對照組抗體水平相比 均差異顯著（P < 〇. 05)，并且第1免疫組的特異性抗體水平明顯高于第2和第3免疫組（P < 0. 05)。首免后49d，第1免疫組淋巴細(xì)胞增值指數(shù)的平均值明顯高于第2和3免疫組 (P<0.05);細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IFN-γ含量檢測，第1、2和3免疫組細(xì)胞因子含量明 顯高于對照組（P< 0.01)，并且第1免疫組IFN-γ含量與2和3免疫組相比差異明顯（P < 0. 05)。證明rBac-PE( Λ III)-Sl(m)-KDEL3蛋白具有PEDV免疫特性，可用于制備PEDV 亞單位疫苗。
[0024] 目前，還沒有利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備PEDV亞單位疫苗的報道。本研究首 次將ΡΕ(ΛΙΙΙ)與密碼子優(yōu)化的Sl(Sl(m))在桿狀病毒中融合表達(dá)，旨在提高S1蛋白的 免疫原性；并在此基礎(chǔ)上，制備亞單位疫苗，通過小鼠試驗驗證其免疫特性，為防控PEDV提 出新的思路。
[0025] 本發(fā)明的有益效果：
[0026] 本發(fā)明在對S1基因哺乳動物密碼子偏嗜性優(yōu)化的基礎(chǔ)上，首次利用桿狀病毒表 達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PE ( Λ III) -SI (m) -KDEL3融合蛋白，以期獲得正確并高效表達(dá)融合蛋白的重組 桿狀病毒。經(jīng)IFA和Western blot驗證重組桿狀病毒可正確表達(dá)融合蛋白且融合蛋白具有 良好的反應(yīng)原性。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1目的基因的PCR擴(kuò)增
[0028] A:M:DL5000DNA Marker ；1 :Negative control ；2:Sl(m) ；3:SI (m)-KDEL3
[0029] B:M: lOObp DNA Marker ； 1: Negative control ；2:ΡΕ(ΔΙΙΙ) -KDEL3 ；3:ΡΕ(ΔΙΙΙ)
[0030] 圖2重組載體的酶切鑒定
[0031] A:M: lkb DNA Marker ； 1 : pF-PE ( Δ III) -KDEL3 (Notl/Xhal)； 2:pFastBac?dual(Notl/Xhal)；
[0032] B:M: lkb DNA Marker ；1 :pF-PE ( Δ III) -SI (m) -KDEL3 (Notl/Xhal)； 2:pF-PE( Δ III)-S1(m)-KDEL3(XhaI/HindIII) ；3:pFastBac?dual(Notl/Xhal)
[0033] C : M : lkb plus DNA Marker ； 1 : pF~S 1 (m)-KDEL3 (Xha I/H i n d 111)； 2:pFastBac?dual(Xhal/HindlII)；
[0034] D:M:lkb plus DNA Marker ；l:pF-Sl(m) (Xhal/Hindlll) ；2:pFastBac?dual (Xhal/ Hindlll);圖 3 重組 Bacmid 的 PCR 鑒定
[0035] A:M:DL5000DNA Marker ；l:Negative control ；2:rBacmid-Sl (m) (SI (m)-F/M13R)； 3:rBacmid-Sl (m)-KDEL3(Sl (m)-F/M13R);
[0036] B:M:DL5000DNA Marker ； 1: rBacmid-PE ( Δ 111)-KDEL3 (PE ( Δ III)-F/ PE (Δ 111) -R) ； 2: Negat i ve contro 1 ； 3: rBacmi d-PE (Δ 111) -S1 (m) -KDEL3 (PE (Δ 111) -F/ M13R)；
[0037] 圖4重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞的CPE
[0038] A:rBac-PE( Λ III)-KDEL3 ;B:rBac-PE( Λ III)-Sl(m)-KDEL3 ;C:正常細(xì)胞； D:rBac-Sl(m) ；E:rBac-Sl(m)-KDEL3
[0039] 圖5IFA鑒定不同病毒感染的Sf9細(xì)胞內(nèi)重組SI蛋白和PE( Λ III)蛋白的表達(dá)
[0040] 圖6不同病毒感染的Sf9細(xì)胞中S1蛋白（Α)、ΡΕ( Λ III)蛋白⑶的Western blot鑒定
[0041] A: 1 :rBac-PE( Λ III)-SI (m)-KDEL3 ;2:rBac-Sl (m)-KDEL3 ;3:rBac-Sl (m) ;4:Sf9
[0042] B: 1:rBac-PE( Λ III)-S1 (m)-KDEL3 ;2:rBac-PE( Λ III)-KDEL3 ;3:Sf9
[0043] 圖 7ELISA 抗體（A)和中和抗體⑶檢測（Serum samples (n = 5)were collected at various time-points. Data were shown as mean + S. D.)
[0044] 圖 8PEDV 特異的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答（Data were shown as mean 土 S. D.)
[0045] 圖9脾臟淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-4⑷和IFN-r⑶含量（Data were shown as mean + S. D.) 【具體實施方式】
[0046] 1.材料與方法
[0047] 1. 1毒株、質(zhì)粒和細(xì)胞
[0048] E. coilDH5a、Vero細(xì)胞、PEDV弱毒株DR13由本實驗室保存。假單胞菌購自中國 獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的pFastBac TMDual質(zhì)粒、pVAX-Sl (m)質(zhì)粒、Sf9 昆蟲細(xì)胞和DHlOBac菌株購自Invitrogen。以上的試驗材料為常規(guī)材料，本領(lǐng)域技術(shù)人員 均可通過市場購買得到。
[0049] 1. 2試劑及實驗動物
[0050] 兔抗S1蛋白多克隆抗體、鼠抗假單胞菌外毒素 A蛋白多克隆抗體由本實驗室制 備保存（可通過常規(guī)實驗方法制備）。DNA凝膠回收試劑盒、Plasmid Miniprep Kit購自 BI0MEGA公司。HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG、羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的羊抗鼠 IgG、羊抗兔IgG購 自武漢博士德公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。T4DNA連接酶、 限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司。Grace, s培養(yǎng)基、FBS購自Gibco公司。 異丙醇和無水乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。三氯甲烷購自上海凌峰化學(xué)試劑有限 公司。
[0051] 清潔劑ICR小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。
[0052] 1.3目的基因的擴(kuò)增
[0053] 1.3.1 引物
[0054] 根據(jù)GenBank發(fā)布的假單胞菌外毒素 A基因（PE)、S1 (m)基因序列（SEQ ID N0. 7) 設(shè)計合成引物，引物序列如下：
[0055] 表1用于擴(kuò)增不同S1和ΡΕ( Λ III)片段的引物及其序列
[0056]
【權(quán)利要求】
1. 一種豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白，其特征在于該蛋白系將含有KDEL3 基因序列、缺失III區(qū)的銅綠假單胞菌外毒素 A基因序列和SI (m)基因序列的融合基因片 段PE ( Λ III)-SI (m)-KDEL3克隆至桿狀病毒載體中獲得重組載體，將所述的重組載體陽轉(zhuǎn) DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組載體位點特異性轉(zhuǎn)座獲得重組桿狀質(zhì)粒，將該重組桿狀質(zhì)粒 在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得重組Sf9細(xì)胞，經(jīng)該重組Sf9細(xì)胞表達(dá)獲得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白，其特征在于所述 SI (m)基因的序列為SEQ ID NO. 7。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白，其特征在于所述 的桿狀病毒載體為pFastBac?Dual質(zhì)粒。
4. 一種重組載體pF-PE( Λ III)-SI (m)-KDEL3,其特征在于是將含有KDEL3基因 序列、缺失III區(qū)的銅綠假單胞菌外毒素 A基因序列和Sl(m)基因序列的融合基因片段 ΡΕ( Λ III)-S1 (m)-KDEL3 克隆至桿狀病毒載體 pFastBac?Dual 質(zhì)粒的 Notl 和 Hindlll 兩 個酶切位點間所得。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體pF-PE( Λ III)-S1 (m)-KDEL3,其特征在于其克隆 過程包含以下步驟： (1) 以pVAX-Sl (m)質(zhì)粒為模板，引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3經(jīng)PCR擴(kuò)增含有KDEL3 基因序列的SI (m)，即SI (m) -KDEL3 ;以經(jīng)煮沸的假單胞菌菌液為模板，引物SEQ ID NO. 4和 SEQ ID NO. 5擴(kuò)增缺失III區(qū)的PE基因，即ΡΕ (Λ III); (2) 通過Notl和Xhal兩個酶切位點將所得到的基因片段PE( Λ III)克隆入 桿狀病毒載體中獲得重組載體PF-PE(AIII);通過Xhal和Hindlll兩個酶切位點 將所得到的基因片段Sl(m)-KDEL3克隆入重組載體pF-PE( Λ III)中獲得重組載體 pF-PE (Δ III)-Sl(m)-KDEL3〇
6. -種重組重組桿狀質(zhì)粒，其特征在于是將權(quán)利要求4或5所述的重組載體 pF-PE ( Λ III) -SI (m) -KDEL3陽轉(zhuǎn)DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組載體位點特異性轉(zhuǎn)座所得。
7. -種重組Sf9細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求6所述的重組桿狀質(zhì)粒。
8. 權(quán)利要求1?3中任意一項所述豬流行性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白的制備 方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 以pVAX-Sl (m)質(zhì)粒為模板，引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3經(jīng)PCR擴(kuò)增含有KDEL3 基因序列的SI (m)，即SI (m) -KDEL3 ;以經(jīng)煮沸的假單胞菌菌液為模板，引物SEQ ID NO. 4和 SEQ ID NO. 5擴(kuò)增缺失III區(qū)的PE基因，S卩ΡΕ (Λ III); (2) 通過Notl和Xhal兩個酶切位點將所得到的基因片段PE( Λ III)克隆入 桿狀病毒載體中獲得重組載體pF_PE( Λ III);通過Xhal和Hindlll兩個酶切位點 將所得到的基因片段Sl(m)-KDEL3克隆入重組載體pF-PE(A III)中獲得重組載體 pF-PE(Λ III)-SI(m)-KDEL3 ; (3) 將所述的重組載體pF-PE (Λ III)-SI (m)-KDEL3陽轉(zhuǎn)DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行 重組載體位點特異性轉(zhuǎn)座獲得重組桿狀質(zhì)粒，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將重組桿狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì) 胞，經(jīng)該重組Sf9細(xì)胞表達(dá)獲得所述的重組蛋白。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述的桿狀病毒載體為 pFastBac?Dual 質(zhì)粒。
10. -種亞單位疫苗，其特征在于包含有權(quán)利要求1所述的重組Sf9細(xì)胞表達(dá)的豬流行 性腹瀉病毒新變異毒株重組S1蛋白及佐劑。
【文檔編號】C12N5/10GK104046637SQ201410315228
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】姜平, 趙攀登, 白娟 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)