獲得人源OPCs的方法和OPCs培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及獲得人源OPCs的方法和OPCs培養(yǎng)基。本發(fā)明將神經(jīng)干細胞作為分選來源，通過免疫磁珠的方法分離得到人源OPCs，并找到了適合OPCs體外培養(yǎng)和傳代的較經(jīng)濟型的培養(yǎng)基，可以在短時間內(nèi)獲得大量的高純度的人源OPCs，為臨床應(yīng)用提供了新的選擇。
【專利說明】獲得人源OPCs的方法和OPCs培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獲得人源OPCs的方法和OPCs培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0002]腦白質(zhì)損傷、脊髓損傷、多發(fā)性硬化等髓鞘相關(guān)疾病由于神經(jīng)元的髓鞘化障礙或脫髓鞘化，導(dǎo)致了神經(jīng)元不能正常傳遞電興奮，從而導(dǎo)致機體運動等功能失能。由于目前還沒有任何一種藥物可以有效地治療這些髓鞘相關(guān)疾病，這給這些疾病的患者及家庭帶來了極大的傷害，這使得有效治療髓鞘相關(guān)疾病成為當今急待解決的社會和醫(yī)學(xué)難題。
[0003]不論是髓鞘化障礙還是脫髓鞘病變，其根源都是神經(jīng)元軸突髓鞘程度減少或丟失，因此如果能夠恢復(fù)神經(jīng)元軸突的髓鞘化程度，使得神經(jīng)元電流得以穩(wěn)定快速地傳導(dǎo)，理論上這些疾病就可以被治愈。研究發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)前體細胞(oligodendrocyte progenitorcells, OPCs)是負責中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘化的關(guān)鍵細胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，OPCs可以分化為少突膠質(zhì)細胞(oligodendrocyte, 0L), OL進一步包繞神經(jīng)元軸突形成完整的髓鞘結(jié)構(gòu)，從而保證神經(jīng)元電流的穩(wěn)定快速傳導(dǎo)。髓鞘相關(guān)的疾病一方面是因為疾病破壞了已經(jīng)形成的髓鞘結(jié)構(gòu)；另一方面更是由于神經(jīng)系統(tǒng)中OPCs受到了損傷，使得OL失去了源泉。少突膠質(zhì)細胞減少，導(dǎo)致腦白質(zhì)髓鞘化延遲或被破壞，從而使得神經(jīng)電信號傳導(dǎo)異?；蛘咻S突受損，導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷。
[0004]對脫髓鞘病變患者來說，由于內(nèi)源性O(shè)PCs大量丟失，要促進腦中髓鞘的再生，植入外源成髓鞘細胞是一個有希望的治療方法。由于OPCs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中成髓鞘細胞的天然來源，OPCs移植可能對治療脫髓鞘病變起到很好的療效。實驗發(fā)現(xiàn)，將嚙齒類動物的OPCs移植到新生的嚙齒類動物腦內(nèi)，植入細胞能在宿主腦內(nèi)廣泛遷移、增殖并分化為成熟0L，形成包繞軸突的髓鞘結(jié)構(gòu)并恢復(fù)神經(jīng)功能，表明外源植入OPCs能發(fā)揮與內(nèi)源OPCs同樣的功能，OPCs移植可能是治療髓鞘損傷疾病的一個新的方向，這對脫髓鞘病變治療具有積極的意義。
[0005]盡管嚙齒類動物的OPCs很容易獲得，人源OPCs獲得卻相當困難。依賴于免疫表型，通過流式細胞術(shù)或是免疫磁珠技術(shù)從胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織或是成人腦白質(zhì)組織中分選可以得到OPCs。Windrem等從胎兒或是成人腦組織中分離出了型的細胞，認為該細胞即為OPCs，將該細胞移植入先天脫髓鞘的小鼠內(nèi)，可以形成髓鞘。然而由于人源的供體組織較少，分離得到的OPCs數(shù)量相當有限，且其存在倫理學(xué)問題，因此距離臨床應(yīng)用還非常遙遠。另一種可以通過胚胎干細胞或是神經(jīng)干細胞定向誘導(dǎo)分化獲得人源OPCs0美國的Hans等人研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細胞體外可以分化為OPCs，且OPCs移植有助于脊髓損傷的神經(jīng)功能恢復(fù)，該方法在美國進入了臨床I期的治療研究。但胚胎干細胞的全能性是把雙刃劍，既能分化為各種細胞，也有致瘤的風(fēng)險，因此該方法獲得的OPCs在臨床應(yīng)用上還存在一定的致瘤風(fēng)險。神經(jīng)干細胞是一種成體干細胞，由于成體干細胞分化能力受到限制，在一定程度上避免了致瘤的風(fēng)險，臨床應(yīng)用上更為安全。但這兩種細胞的誘導(dǎo)過程都需要較長時間及多種細胞因子的共同作用，這必然導(dǎo)致培養(yǎng)的費用增加，限制細胞的產(chǎn)量。
[0006]因此，臨床的治療研究需要一種簡單獲得且經(jīng)濟培養(yǎng)人源OPCs的方法。神經(jīng)干細胞體外有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力，且約有16%的細胞表達A2B5+PSA-NCAM_表型，同時由于是成體干細胞又在一定程度上避免了致瘤的風(fēng)險。神經(jīng)干細胞還可以在體外大量擴增，可以說神經(jīng)干細胞是很好的分選OPCs的來源。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是解決上述問題，提供一種獲得人源OPCs的新方法。為此， 申請人:經(jīng)過深入研究，將神經(jīng)干細胞(不論是低代數(shù)還是較高代數(shù))作為分選來源，通過免疫磁珠的方法分離得到人源OPCs，并找到了適合OPCs體外培養(yǎng)和傳代的較經(jīng)濟型的培養(yǎng)基，可以在短時間內(nèi)獲得大量的高純度的人源OPCs，為臨床應(yīng)用提供了新的選擇。
[0008]本發(fā)明提供的獲得人源OPCs的方法為，將神經(jīng)干細胞作為分選來源，通過免疫磁珠的方法分離得到人源OPCs，采用的磁珠為Ant1-PSA-NCAM磁珠。
[0009]優(yōu)選地，包括以下步驟:
[0010]①神經(jīng)干細胞在胰蛋白酶溶液中被消化成單個細胞，過篩網(wǎng)；
[0011]②離心收集細胞，去上清；
[0012]③細胞重懸在磁珠分選緩沖液中，混勻后在2_8°C中溫育；
[0013]④加入Ant1-PSA-NCAM磁珠，混勻后在2_8°C中溫育；
[0014]⑤加入磁珠分選緩沖液，離心；
[0015]⑥離心過程中，將分選柱放入磁珠分離器中，加入磁珠分選緩沖液平衡分選柱；
[0016]⑦離心后，完全棄去上清液，重懸于磁珠分選緩沖液，將細胞懸液加入到分選柱內(nèi)，收集流出液體，此為未標記的細胞；
[0017]⑧加入磁珠分選緩沖液洗分離柱，離心收集細胞；
[0018]⑨加入Ant1-A2B5磁珠，溫育，重復(fù)⑤_⑧步驟,此次收集細胞應(yīng)為柱內(nèi)集合上的細胞，緩沖液洗柱后，將分選柱從磁珠分離器內(nèi)取出放置在離心管內(nèi)；
[0019]⑩加入磁珠分選緩沖液后，立即推壓活塞洗脫掉結(jié)合上的細胞，離心，收集到的細胞為A2B5+PSA-NCAM_表型的亞細胞群，即為OPCs。
[0020]更優(yōu)選地，各步驟的具體操作方法如下:
[0021 ] ①神經(jīng)干細胞在0.025%胰蛋白酶溶液中被消化成單個細胞，過40 μπι尼龍篩網(wǎng)以濾除細胞團塊，臺酚藍計算細胞總數(shù)；以上“ ”是“g/100ml ”的慣常簡略表示方式，
0.025%即為 0.025g/100ml。
[0022]②取17細胞，300g離心10分鐘收集細胞，去上清；
[0023]③17細胞重懸在60 μ I的磁珠分選緩沖液中，混勻后在2_8°C中溫育10分鐘；
[0024]④加入20 μ I的Ant1-PSA-NCAM磁珠，混勻后在2_8°C中溫育15分鐘；
[0025]⑤加入1ml磁珠分選緩沖液，300g離心10分鐘；
[0026]⑥離心過程中，將MS分選柱放入磁珠分離器中，加入0.5ml的磁珠分選緩沖液平衡分選柱；
[0027]⑦離心后，完全棄去上清液，重懸于0.5ml的磁珠分選緩沖液，將細胞懸液加入到分選柱內(nèi)，收集流出液體，此為未標記的細胞；
[0028]⑧加入0.5ml的磁珠分選緩沖液洗分離柱，共三次，離心收集細胞；
[0029]⑨加入20 μ I的Anti_A2B5磁珠，溫育，重復(fù)上面⑤_⑧的步驟,此次收集細胞應(yīng)為柱內(nèi)集合上的細胞，緩沖液洗柱三次后，將分選柱從磁珠分離器內(nèi)取出放置在1.5ml的離心管內(nèi)；
[0030]⑩加入1ml磁珠分選緩沖液后，立即推壓活塞洗脫掉結(jié)合上的細胞，300g離心10分鐘，收集到的細胞為a2b5+psa-ncam_表型的亞細胞群，即為OPCs。
[0031 ] 優(yōu)選地，利用OPCs培養(yǎng)基對分離得到的人源OPCs進行體外擴增培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基由 Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和 L-glutamin 組成，Neurobasal A medium、B27和L-glutamin的體積比為97: 2: 1，bFGF的含量為20_40ng/ml，肝素的含量為5 μ g/ml ο
[0032]更優(yōu)選地，體外擴增培養(yǎng)的具體操作方法為:磁珠分選后得到的細胞按照4X 14/cm2密度接種至培養(yǎng)器皿內(nèi)，在OPCs培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每3_4天，更換2/3培養(yǎng)基為新鮮OPCs培養(yǎng)基，細胞達到80% -90%的融合度時，傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的次數(shù)為2-4次。
[0033]優(yōu)選地，所述神經(jīng)干細胞采用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基進行體外擴增而得，所述神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基由 DMED/F12、N2、bFGF、EGF、肝素和 L-glutamin 組成，DMED/F12、N2 和L-glutamin 的體積比為 98: I: 1，bFGF 的濃度為 10_30ng/ml，EGF 的濃度為 10_30ng/ml ο
[0034]更優(yōu)選地，神經(jīng)干細胞體外擴增的操作步驟如下:
[0035]①10g離心5分鐘收集神經(jīng)干細胞；
[0036]②將上清轉(zhuǎn)移入離心管內(nèi)，為舊培養(yǎng)基；
[0037]③向收集好的神經(jīng)干細胞內(nèi)加入1ml由0.01M dPBS稀釋得到的0.025%胰蛋白酶，混勻，置37°C培養(yǎng)箱孵育5-7min至細胞球松散；
[0038]④加入1.2mg/ml胰酶抑制劑100 μ 1，200 μ I移液器吸管輕輕吹打成單細胞懸液；
[0039]⑤加入15ml dPBS,細胞計數(shù)，10g離心5min ；
[0040]⑥棄上清，加入2/3新鮮神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基和1/3舊培養(yǎng)基，以2 X 106/mL密度接種于T25ml培養(yǎng)瓶，置細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
[0041]⑦每3-4天更換2/3培養(yǎng)基為新鮮培養(yǎng)基，每10天傳代一次。
[0042]本發(fā)明提供的獲得人源OPCs的方法也包括利用OPCs培養(yǎng)基對其它方式獲得的人源OPCs進行體外擴增培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基由Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和L-glutamin 組成，Neurobasal A medium、B27 和 L-glutamin 的體積比為 97: 2:1,bFGF的含量為20-40ng/ml,肝素的含量為5 μ g/ml。
[0043]優(yōu)選地，其它方式獲得的人源OPCs體外擴增培養(yǎng)的具體操作方法為:人源OPCs按照4X 1Vcm2密度接種至培養(yǎng)器皿內(nèi)，在OPCs培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每3-4天，更換2/3培養(yǎng)基為新鮮OPCS培養(yǎng)基，細胞達到80% -90%的融合度時，傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的次數(shù)為2-4次。
[0044]OPCs培養(yǎng)基也是本發(fā)明的保護內(nèi)容，其由Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和 L-glutamin 組成，Neurobasal A medium、B27 和 L-glutamin 的體積比為 97: 2:1,bFGF的含量為20-40ng/ml，肝素的含量為5μ g/ml。
[0045]本發(fā)明提供的獲得人源OPCs的方法易于操作，可以在短時間內(nèi)獲得大量的高純度的人源OPCs，為臨床應(yīng)用提供了新的選擇。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1顯示為流式分析分選得到的細胞純度到達85%以上。
[0047]圖2顯示為分選細胞表達了多種特異OPCs標志:A為分選三天后，細胞為典型的雙極或三極形態(tài)；B_D分別為免疫熒光染色表明分選細胞表達OPCs特異標志04、PDGF a R和SoxlO ；Ε為星形膠質(zhì)細胞標志GFAP陽性細胞；F為神經(jīng)元標志Tuj-1陽性細胞。比例尺:50 μ m (A-E)，100 μ m (F)。
[0048]圖3顯示為分選得到的OPCs可以體外至少培養(yǎng)四代:顯微鏡觀察第二代到第四代OPCs，均為典型的雙極或三極形態(tài)；免疫熒光染色表明各代數(shù)OPCs均高表達少突膠質(zhì)前體細胞標志04。比例尺:50 μ m。
[0049]圖4顯示為分選得到的第四代OPCs免疫熒光染色結(jié)果:0PCs高表達少突前體細胞標志F1DGF a R和SoxlO、極低表達星形膠質(zhì)細胞標志GFAP和神經(jīng)元標志Tuj-1。比例尺:50 μ m(PDGFa R、SoxlO 和 GFAP)，100 μ m(Tuj-1)。
[0050]圖5顯示為第一代到第四代OPCs增殖曲線:經(jīng)過四代的體外擴增，細胞增殖14倍以上。
[0051]圖6顯示為OPCs分化為少突細胞。A:顯微鏡下觀察分化后的細胞形態(tài)，細胞呈復(fù)雜多分枝結(jié)構(gòu):免疫熒光染色結(jié)果表明分化細胞可以表達多分枝的04 ；C:免疫熒光染色結(jié)果表明分化細胞表達Gale。比例尺:25 μ m。

【具體實施方式】
[0052]下面為本發(fā)明的具體的實施方式。
[0053]I從神經(jīng)干細胞中分選獲得OPCs
[0054]1.1人神經(jīng)干細胞體外擴增
[0055]①10g離心5分鐘收集神經(jīng)干細胞；
[0056]②將上清轉(zhuǎn)移入離心管內(nèi)，為舊培養(yǎng)基；
[0057]③向收集好的神經(jīng)干細胞內(nèi)加入1ml0.025%胰蛋白酶(0.01M dPBS稀釋)，混勻，置37°C培養(yǎng)箱孵育5-7min至細胞球松散；
[0058]④加入1.2mg/ml胰酶抑制劑100 μ 1，200 μ I移液器吸管輕輕吹打成單細胞懸液；
[0059]⑤加入15ml dPBS,細胞計數(shù)，10g離心5min ；
[0060]⑥棄上清，加入2/3新鮮神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基和1/3舊培養(yǎng)基，以2 X 1fVmL密度接種于T25ml培養(yǎng)瓶，置細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0061]⑦每3-4天更換2/3培養(yǎng)基為新鮮培養(yǎng)基，每10天傳代一次。
[0062]神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基:
[0063]

【權(quán)利要求】
1.獲得人源OPCs的方法，其特征在于，將神經(jīng)干細胞作為分選來源，通過免疫磁珠的方法分離得到人源OPCs，采用的磁珠為Ant1-PSA-NCAM和Anti_A2B5磁珠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: ①神經(jīng)干細胞在胰蛋白酶溶液中被消化成單個細胞，過篩網(wǎng)； ②離心收集細胞，去上清； ③細胞重懸在磁珠分選緩沖液中，混勻后在2-8°C中溫育； ④加入Ant1-PSA-NCAM磁珠，混勻后在2_8°C中溫育； ⑤加入磁珠分選緩沖液，離心； ⑥離心過程中，將分選柱放入磁珠分離器中，加入磁珠分選緩沖液平衡分選柱； ⑦離心后，完全棄去上清液，重懸于磁珠分選緩沖液，將細胞懸液加入到分選柱內(nèi)，收集流出液體，此為未標記的細胞； ⑧加入磁珠分選緩沖液洗分離柱，離心收集細胞； ⑨加入Ant1-A2B5磁珠，溫育，重復(fù)⑤-⑧步驟，此次收集細胞應(yīng)為柱內(nèi)集合上的細胞，緩沖液洗柱后，將分 選柱從磁珠分離器內(nèi)取出放置在離心管內(nèi)； ⑩加入磁珠分選緩 沖液后，立即推壓活塞洗脫掉結(jié)合上的細胞，離心，收集到的細胞為A2B5+PSA-NCAM_表型的亞細胞群，即為OPCs。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，各步驟的具體操作方法如下: ①神經(jīng)干細胞在0.025%胰蛋白酶溶液中被消化成單個細胞，過40 μ m尼龍篩網(wǎng)以濾除細胞團塊，臺酚藍計算細胞總數(shù)； ②取17細胞，300g離心10分鐘收集細胞，去上清； ③17細胞重懸在60μ I的磁珠分選緩沖液中，混勻后在2-8°C中溫育10分鐘； ④加入20μ I的Ant1-PSA-NCAM磁珠，混勻后在2_8°C中溫育15分鐘； ⑤加入1ml磁珠分選緩沖液，300g離心10分鐘； ⑥離心過程中，將分選柱放入磁珠分離器中，加入0.5ml的磁珠分選緩沖液平衡分選柱； ⑦離心后，完全棄去上清液，重懸于0.5ml的磁珠分選緩沖液，將細胞懸液加入到分選柱內(nèi)，收集流出液體,此為未標記的細胞； ⑧加入0.5ml的磁珠分選緩沖液洗分離柱，共三次，離心收集細胞； ⑨加入20μ I的Ant1-A2B5磁珠，溫育，重復(fù)上面⑤-⑧的步驟,此次收集細胞應(yīng)為柱內(nèi)集合上的細胞，緩沖液洗柱三次后，將分選柱從磁珠分離器內(nèi)取出放置在1.5ml的離心管內(nèi)； ⑩加入1ml磁珠分選緩沖液后，立即推壓活塞洗脫掉結(jié)合上的細胞，300g離心10分鐘，收集到的細胞為A2B5+PSA-NCAM_表型的亞細胞群，即為OPCs。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用OPCs培養(yǎng)基對分離得到的人源OPCs進行體外擴增培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基由Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和L-glutamin組成，Neurobasal A medium、B27 和 L-glutamin 的體積比為 97: 2:1, bFGF 的含量為20-40ng/ml,肝素的含量為5μg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,體外擴增培養(yǎng)的具體操作方法為:磁珠分選后得到的細胞按照4 X 1Vcm2密度接種至培養(yǎng)器皿內(nèi)，在OPCs培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37°C、.5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每3-4天，更換2/3培養(yǎng)基為新鮮OPCs培養(yǎng)基，細胞達到80% -90%的融合度時，傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的次數(shù)為2-4次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)干細胞采用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基進行體外擴增而得，所述神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基由DMED/F12、N2、bFGF、EGF、肝素和L-glutamin組成，DMED/F12、N2 和 L-glutamin 的體積比為 98: I: l，bFGF 的濃度為 10_30ng/ml，EGF的濃度為10-30ng/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，神經(jīng)干細胞體外擴增的操作步驟如下: ①10g離心5分鐘收集神經(jīng)干細胞； ②將上清轉(zhuǎn)移入離心管內(nèi)，為舊培養(yǎng)基； ③向收集好的神經(jīng)干細胞內(nèi)加入1ml由0.01M dPBS稀釋得到的0.025%的胰蛋白酶，混勻，置37°C培養(yǎng)箱孵育5-7min至細胞球松散； ④加入1.2mg/ml胰酶抑制劑100 μ I, 200 μ I移液器吸管輕輕吹打成單細胞懸液； ⑤加入15mldPBS,細胞計數(shù)，10g離心5min ； ⑥棄上清，加入2/3新鮮神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基和1/3舊培養(yǎng)基，以2X 106/mL密度接種于T25ml培養(yǎng)瓶，置細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)； ⑦每3-4天更換2/3培養(yǎng)基為新鮮培養(yǎng)基，每10天傳代一次。
8.獲得人源OPCs的方法，其特征在于，利用OPCs培養(yǎng)基對人源OPCs進行體外擴增培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基由 Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和 L-glutamin 組成，NeurobasalA medium、B27 和 L-glutamin 的體積比為 97: 2: 1，bFGF 的含量為 20_40ng/ml，肝素的含量為Sμg/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，體外擴增培養(yǎng)的具體操作方法為:人源OPCs按照4X 104/cm2密度接種至培養(yǎng)器皿內(nèi)，在OPCs培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每3-4天，更換2/3培養(yǎng)基為新鮮OPCS培養(yǎng)基，細胞達到80% -90%的融合度時，傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的次數(shù)為2-4次。
10.0PCS 培養(yǎng)基，其特征在于，由 Neurobasal A medium、B27、bFGF、肝素和 L-glutamin組成，Neurobasal A medium、B27 和 L-glutamin 的體積比為 97: 2:1，bFGF 的含量為.20-40ng/ml,肝素的含量為5μg/ml。
【文檔編號】C12N5/0797GK104073468SQ201410336947
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】欒佐 申請人:欒佐