-脂肪酸脫氫酶基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從深黃被孢霉M6-22中分離的編碼Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，通過構建重組載體并在釀酒酵母中表達，表達產物具有Δ6-脂肪酸脫氫酶功能，能催化亞油酸轉化成γ-亞麻酸。
【專利說明】
一種Δ6-脂肪酸脫氫酶基因及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】和遺傳工程領域，涉及從一種絲狀真菌---毛霉屬的深黃被孢霉(M^iereJJa Isabel I ina)m~22中克隆的Λ6-脂肪酸脫氫酶基因，并將該基因直接與不同載體連接，轉入細菌、酵母、植物或動物中，利用其編碼Λ6-脂肪酸脫氫酶產生包括Y-亞麻酸等多不飽和脂肪酸。

【背景技術】
[0002]Y -亞麻酸(Y-1inolenic acid)是一種多功能油脂成分，是人體必需的多不飽和脂肪酸，具有多種重要的生理活性作用，在機體的生理調控和物質代謝上發(fā)揮著重要的作用，如降血脂、抗血栓性心腦血管、預防和治療高血壓、動脈粥樣硬化，增強人體的免疫功能，還具有抗腫瘤、抗脂質過氧化、抑制潰瘍和增強胰島素和減肥等方面的作用[董杰明等，2003，衛(wèi)生研究，32 (3): 299-301]。尤其是在糖尿病、心血管疾病及癌癥方面的醫(yī)療價值，Y-亞麻酸已成為學術界研究的熱點。
[0003]Λ 6_脂肪酸脫氫酶能特異性催化亞油酸(linoleic acid, C18:2A9’12)和α-亞麻酸(a-1inolenic acid, C18:3 Δ9’12’15)羧基端的第6和第7位碳原子之間插入一個新的雙鍵，分別脫氫形成Y-亞麻酸(γ-linolenic acid, C18:3 Δ6’9’12)和十八碳四烯酸(stearidonic acid, C18:4 Δ6’9’12’15)，它們再通過碳鏈延伸和脫氫進一步形成其它長鏈的多不飽和脂肪酸(long-chain polyunsaturated fatty acid, LC-PUFAs),因此 Δ6-脂肪酸脫氫酶是人和哺乳動物體內合成長鏈多不飽和脂肪酸的關鍵酶。這些長鏈多不飽和脂肪酸是機體組織生物膜組成成分，起到維持細胞正常功能和增加機體抗逆性的作用[NapierJA et al，1999，Curr.0pin.Plant B1l，2:123-127]，同時也是前列腺素、環(huán)前列腺素和白三烯類等具有強烈生理活性的自身調節(jié)物的前體[Horrobinn DF, 1992, Prog LipidRes.,31:163-194] ο Λ6-脂肪酸脫氫酶活性的降低將導致Y -亞麻酸的合成量減少，引起人體的各種機能紊亂，進而引發(fā)各種疾病。因此，從不同生物體中克隆Λ6-脂肪酸脫氫酶基因，再與不同表達載體連接后轉入不同的宿主細胞進行表達，利用宿主產生Y-亞麻酸和其他長鏈多不飽和脂肪酸具有極大應用前景。
[0004]由于人們越來越認識到Y -亞麻酸和其他長鏈多不飽和脂肪酸的重要性，因此將注意力又轉向對Λ 6-脂肪酸脫氫酶的研究上。Λ 6-脂肪酸脫氫酶屬于一類膜整合酶，由于分離和鑒定膜結合蛋白的難度很大[MaKeon，1981，酶學方法，12141-12147 ；wang等，1988，植物生理學生物化學，26:777-792]，因此常規(guī)的生物化學方法很難得到包括Λ6-脂肪酸脫氫酶在內的各種膜結合蛋白性質脫氫酶高級機構，而只能通過對酶的核苷酸序列進行初步研究，對于△ 6_脂肪酸脫氫酶的生物學功能驗證，許多實驗室采用了從各種生物體中克隆相關的基因并轉入各種受體細胞中，然后在受體細胞中觀察其脂肪酸改變的方法。序列對比的結果表明，編碼Λ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列具有共同的機構特性:存在三個組氨酸保守區(qū)，形成四次跨膜的結構[Kyte et al，1982，J.Mol.B1l.157:105-132]，此外，除了藍細菌外，真核生物的脂肪酸脫氫酶的氨基端都含有類似于細胞色素b5(Cytb5)血紅素結合區(qū)(HPGG) [Napier JA, Sayanova O, Stobart AK, et al., 1997, B1chem.J.，157:105-132]，這些都是維持脫氫酶活性所必須的。
[0005]目前，通過多種分子生物學方法已從動物、植物、微生物等不同來源中分離到許多Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的同源序列，并且證明具有相應的生物學功能，然而，盡管獲得了很多Λ6-脂肪酸脫氫酶的基因序列，但是在酶的純化方面存在的技術困難，目前仍沒有從酶水平揭示其在自然環(huán)境中的生化特性。因此，只能借助于發(fā)掘更多的不同來源的Λ6-脂肪酸脫氫酶基因序列，通過基因序列分析來更深入揭示△ 6_脂肪酸脫氫酶的生物學功能，并為將來酶的純化和生化特性的揭示以及進一步的應用打下基礎。此外，這些不同來源分離到的脫氫酶基因催化活性較低且大多數(shù)對脂肪酸底物鏈長、雙鍵數(shù)目及雙鍵位置不具有嚴格的專一性，除目標產物外，還會生產一些非特異脂肪酸。因此，需要繼續(xù)篩選具有高的底物特異性的脂肪酸脫氫酶基因，并應用基因工程技術構建特異性生產多不飽和脂肪酸的轉基因油料植物，直接改善油脂品質，更加具有實際應用價值。本研究通過多種手段發(fā)掘多不飽和脂肪酸合成的高效、特異性新基因，為新一代轉基因脂肪酸產品的品質改良奠定基礎。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的一個目的是提供一種從深黃被孢霉iMortierella IsabelIina ) M6-22中分離得到的△ 6_脂肪酸脫氫酶基因及該基因編碼的氨基酸，該基因核苷酸序列或核苷酸序列的片段如SEQ ID NO:1所示，或與SEQ ID NO:1互補的核苷酸序列，該基因序列長為1515bp(堿基)，其中1-1515為編碼Λ6-脂肪酸脫氫酶成熟多肽的開放閱讀框；該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽或其片段。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供一種含有Λ6-脂肪酸脫氫酶基因的重組表達載體，是將SEQ ID NO:1所示基因直接與不同表達載體(質粒、病毒或運載體)連接所構建的重組載體。
[0008]可用本領域的技術人員熟知的方法來構建含編碼來源于深黃被孢霉Μ6-22的Λ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等[Sambroook, et al, MolecularCloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989]。所述的編碼深黃被孢霉M6-22 Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列可有效連接到表達載體的恰當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有:大腸桿菌的Iac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子，通常大約有10_300bp，作用于啟動子以增強基因的轉錄，如腺病毒增強子。
[0009]本發(fā)明另一目的是提供一種含有Λ 6_脂肪酸脫氫酶基因或上述重組表達載體的宿主細胞，該細胞是細菌細胞、真菌細胞、植物細胞或動物細胞，或這些宿主細胞的后代，宿主細胞的代表性例子有:大腸桿菌；真菌細胞或酵母；植物細胞如油菜、煙草、大豆；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9 ;動物細胞如CH0、COS或Bowes黑素瘤細胞等。
[0010]用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體優(yōu)化宿主細胞可用本領域的技術人員熟知的方法進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期收集菌體，用CaCl2、電穿孔等方法進行。當宿主是真核生物，可選用DNA轉染法。顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等方法。
[0011]本發(fā)明的核苷酸序列是DNA形式的，DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA，DNA可以是單鏈的或是雙鏈的，編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID N0:2所示的編碼區(qū)序列相同或是簡并的變異體。
[0012]本發(fā)明還包括編碼從深黃被孢霉M6-22獲得的Λ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列的片段。如本發(fā)明所用，術語“片段”是指能編碼基本上保持本發(fā)明天然的相同的生物學功能或活性的多肽的核苷酸序列。通過本文的闡述，這樣的片段、被認為在本領域技術人員的知識范圍之內。
[0013]本發(fā)明中的多肽和核苷酸序列優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
[0014]本發(fā)明中特異核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離核苷酸序列。這些技術包括但不局限于:(1)用探針與基因組或CDNA文庫雜交以檢出同源的核苷酸序列；和(2)表達文庫的抗性篩選以檢出具有共同結構特征的克隆的核苷酸序列片段。
[0015]本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得:(1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；(2)化學合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
[0016]上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學合成法是經常選用的方法。更經常選用的方法是DNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA并進行轉錄，形成質?；蚴删wcDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術，用試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得。而構建cDNA文庫也是通常的方法。當結合聚合酶鏈式反應技術(PCR)時，即使極少的表達產物也能克隆。
[0017]本發(fā)明提供的核苷酸序列是一種高效的特異性的脂肪酸脫氫酶，可以將其與載體連接后轉化至微生物細胞體內生產不飽和脂肪酸，具有產物特異性高、生產周期短、生產不受場地、氣候、季節(jié)的影響及利用不同的菌種和培養(yǎng)基適合開發(fā)功能油脂等優(yōu)點，可以用于商業(yè)化生產，直接改善油脂品質，更加具有實際應用價值。本發(fā)明應用基因工程技術構建特異性生產多不飽和脂肪酸的轉基因酵母細胞生產不飽和脂肪酸，具有操作簡單、成本低、可行性聞等優(yōu)點，為新一代轉基因脂肪酸廣品的品質改良奠定基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明的深黃被孢霉M6-22的Λ6-脂肪酸脫氫酶和魯氏毛霉Λ6-脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列同源性比較圖；其中MID6-1為本發(fā)明的深黃被孢霉Μ6-22 Δ6-脂肪酸脫氫酶，MRD6為魯氏毛霉Λ6-脂肪酸脫氫酶，Consensus為兩序列之間相同的氨基酸序列；
圖2為本發(fā)明所構建的釀酒酵母表達載體PY3MID6-1 ；
圖3為本發(fā)明含PYES3/CT空載體的轉基因酵母的氣相色譜圖；
圖4為本發(fā)明含重組質粒PY3MID6-1的轉基因酵母的氣相色譜圖。

【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內容，實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方法。
[0020]實施例1:從深黃被孢霉M6-22中分離Λ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列
根據(jù)深黃被孢霉Μ6-22的RNAseq分析結果，發(fā)現(xiàn)一條編碼△ 6_脂肪酸脫氫酶的mRNA序列，進一步分析獲得一段編碼完整蛋白質的編碼序列，并根據(jù)編碼序列設計合成特異性引物(引物I和引物2 )。同時將深黃被孢霉M6-22接種到PDA液體培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)48h，收集菌絲體，用液氮研磨成菌絲粉，然后采用真核細胞總RNA提取試劑盒(Promega公司產品)提取深黃被孢霉M6-22的總RNA，再利用反轉錄試劑盒(fermentas公司產品)反轉錄合成第一條cDNA，以此cDNA為模板,用引物I和引物2進行PCR反應，反應所用組份和擴增條件如下:
引物 1:MID6-lFl:5'-ATGCCTCCTAACAATAGGGCTATCGA-3'
引物 2:MID6-1R1:5'-TCACGCATGAGGTGCTACCATCTCT-3' ；
PCR擴增體系(25 PL)組成如下:
1XEx Taq Buffer2.5 M-L
dNTP (2.5 Mmol/L)2 μ?
模板3 ?
MID6-1F1 (10 Mmol/L)2 μ?
MID6-1R1 (10 Mmol/L)2 μ?
Ex Taq DNA polymerase (5U/M-L) 2 M-L
無菌ddH20 補足至25 ?
擴增條件:94°C變性4min，再用94°C lmin、58°C lmin、72°C 2min進行30個循環(huán)，擴增產物按照部分序列擴增中方法連接到PMD18-T載體中，驗證正確后送出測序。結果顯示所擴增得到的片段大小為1515bp，通過其編碼的氨基酸序列在Genebank數(shù)據(jù)庫中用Blast(Basic Local Alignment Search Tool)程序進行同源檢索,檢索結果表明與該片段最相似的同源片段為脂肪酸脫氫酶，但并不完全相同，證明所擴增的片段為新的潛在的脫氫酶基因的部分片段。
[0021]實施例2:所分離核苷酸序列的同源性搜索
將推測的脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列在Genbank上進行同源性搜索，所得同源序列大部分為編碼△ 6-脂肪酸脫氫酶的序列，少數(shù)為假定蛋白的序列，選擇已做功能驗證的Δ6-脂肪酸脫氫酶做同源性比較，其中與魯氏毛霉(ifocor的Λ6-脂肪酸脫氫酶
(AF290983_1)相似性最高，為56%。(圖1，MID6-1為本發(fā)明的深黃被孢霉M6-22 Λ6-脂肪酸脫氫酶，MRD6為魯氏毛霉Λ6-脂肪酸脫氫酶，Consensus為兩序列之間相同的氨基酸序列，這說明本發(fā)明提供的核苷酸序列所編碼的酶為潛在新的脂肪酸脫氫酶。
[0022]實施例3:釀酒酵母重組表達載體的構建
根據(jù)SEQ ID Ν0:1所示編碼區(qū)序列，設計出一對基因特異性擴增引物(引物3和引物
4):
引物 3:MID6-1F2:5'-CGGGATCCATGCCTCCTAACAATAGGGCTA-3'
引物 4:MID6~1R2:5' -ATGCGGCCGCTCACGCATGAGGTGCTACCATC-3'
此兩個引物的5'端下劃線部分分別含有ifeMl I和Afoi I酶切位點，所用的擴增條件和反應組分和以cDNA為模板的PCR反應相同，擴增產物的測序結果顯示和SEQ ID NO:1所示l-1515bp的序列一致；然后取25ul PCR產物和1ul pYES3/CT (Invitrogen公司)分別進行雙酶切，電泳回收酶切大片段，并用T4連接酶在16°C連接4h，連接產物轉化大腸桿菌HD5ci，通過質粒提取和PCR篩選陽性克隆，并進行測序鑒定，質粒構建結果見圖2，所構建的含有Λ6-脂肪酸脫氫酶基因的表達載體命名為PY3MID6-1。
[0023]實施例4:釀酒酵母重組表達載體和空載體轉化釀酒酵母細胞
挑取釀酒酵母菌株INVScl單菌落于5ml YEPD液體培養(yǎng)基中，30°C搖床過夜培養(yǎng)，按1%的接種量轉接于10ml的YEH)液體培養(yǎng)基中，30°C搖床搖至0D600于1.3-1.5之間；4°C、4000g離心5min收集沉淀細胞，用10ml預冷的無菌ddH20洗滌細胞，4°C、4000g離心5min收集沉淀細胞，再用50ml預冷的無菌ddH20洗滌細胞，4°C、4000g離心5min收集沉淀細胞，用20ml預冷的IM山梨醇洗滌細胞，4°C、4000g離心5min收集沉淀細胞，細胞用0.5ml的預冷的IM山梨醇懸浮，每80ul分裝于1.5ml預冷的離心管中，取Iug線性化的重組表達載體PY3MID6-1和空載體pYES3/CT分別加入到80ul的感受態(tài)細胞中，混勻后轉至0.2cm的電轉杯中，冰上孵育5min，轉入電轉儀中電擊(電擊條件:電壓1.5kV，電容25uF，電阻200 Ω，電擊時間為4-10ms)，電擊完畢后立即加入Iml IM預冷的山梨醇并吹勻，30°C孵育2h后分別涂布于SC-Trp (無色氨酸)選擇培養(yǎng)基上，置30°C培養(yǎng)3-4天。
[0024]實施例5:酵母工程菌的誘導表達與脂肪酸甲酯的氣相色譜分析
挑取分別轉化了重組表達載體PY3MID6-1和空載體pYES3/CT并在SC-Trp選擇培養(yǎng)基(色氨酸合成缺陷型培養(yǎng)基)平板上出現(xiàn)的陽性轉化子，分別接種于15ml液體SC-Trp選擇培養(yǎng)基(含2%葡萄糖)，30°C搖菌培養(yǎng)24h，轉接于10ml的SC-Trp選擇培養(yǎng)基(含2%的半乳糖和1%的棉子糖)中，使其初始0D600為0.4，加入0.5mmol /L的外源底物亞油酸，30°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)72h，4000g離心收集菌體，用去離子水洗滌三次，菌體于50°C烘干，研碎，取10mg干菌體粉末加入5ml 5%的KOH-CH3OH溶液中，70°C反應3h，反應結束后冷卻至室溫，用6M的鹽酸調節(jié)溶液的pH值到2.0，加入4ml 14%BF3_CH30H，70°C反應1.5h，合成脂肪酸甲酯；再加入1ml飽和的NaCl溶液，劇烈震蕩混勻，轉移至分液漏斗中，用8ml 1:4的氯仿:環(huán)己烷抽提兩次，合并兩次的提取液，把含有脂肪酸甲酯的溶劑用氮氣吹干，用200ul的正己烷回溶樣品，最后用0.45um微孔濾膜過濾除去大顆粒雜質。
[0025]實施例6:脂肪酸氣相色譜分析
采用氣相色譜分析儀器分析轉基因酵母工程菌的誘導表達情況，氣相色譜分析儀器為島津GC-7A，柱子:彈性石英毛細管柱，0.32 X 30m，固相支持物:聚二乙二醇丁二酸酯鍍膜物:聚酰亞胺。載氣:N2，線速10cm/s。分流比:100:1，氣化室溫度:250°C，柱溫:180°C，尾吹:50ml/min，檢測器:氫火焰離子化檢測器。把上述制備的脂肪酸甲酯化樣品進行GC分析，上樣量為Iul;分析軟件:Anstar。
[0026]色譜分析結果見圖3、4，圖3顯示含pYES3/CT空載體的轉基因酵母，圖4顯示含重組質粒PY3MID6-1的轉基因酵母；與圖3相比，圖4中保留時間為15.05min對應的峰與Y-亞麻酸甲酯標準品一致，即為深黃被孢霉Μ6-22Λ6-脂肪酸脫氫酶催化亞油酸產生的
Y-亞麻酸。
【權利要求】
1.一種Λ6-脂肪酸脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，編碼如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。
2.一種宿主細胞，所述宿主細胞含有權利要求1所述的深黃被孢霉Λ6-脂肪酸脫氫酶基因。
3.權利要求1所述的脂肪酸脫氫酶基因在生產多不飽和脂肪酸中的應用。
【文檔編號】C12P7/64GK104250650SQ201410360120
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權日:2014年7月28日
【發(fā)明者】張琦, 楊曉霞, 魏云林, 林連兵, 季秀玲 申請人:昆明理工大學