-脂肪酸脫氫酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從深黃被孢霉M6-22中分離的編碼Δ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，通過構(gòu)建重組載體并在釀酒酵母中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有Δ6-脂肪酸脫氫酶功能，能催化亞油酸轉(zhuǎn)化成γ-亞麻酸。
【專利說明】
一種Δ6-脂肪酸脫氫酶基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】和遺傳工程領(lǐng)域，涉及從一種絲狀真菌---毛霉屬的深黃被孢霉(M^iereJJa Isabel I ina)m~22中克隆的Λ6-脂肪酸脫氫酶基因，并將該基因直接與不同載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌、酵母、植物或動(dòng)物中，利用其編碼Λ6-脂肪酸脫氫酶產(chǎn)生包括Y-亞麻酸等多不飽和脂肪酸。

【背景技術(shù)】
[0002]Y -亞麻酸(Y-1inolenic acid)是一種多功能油脂成分，是人體必需的多不飽和脂肪酸，具有多種重要的生理活性作用，在機(jī)體的生理調(diào)控和物質(zhì)代謝上發(fā)揮著重要的作用，如降血脂、抗血栓性心腦血管、預(yù)防和治療高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化，增強(qiáng)人體的免疫功能，還具有抗腫瘤、抗脂質(zhì)過氧化、抑制潰瘍和增強(qiáng)胰島素和減肥等方面的作用[董杰明等，2003，衛(wèi)生研究，32 (3): 299-301]。尤其是在糖尿病、心血管疾病及癌癥方面的醫(yī)療價(jià)值，Y-亞麻酸已成為學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。
[0003]Λ 6_脂肪酸脫氫酶能特異性催化亞油酸(linoleic acid, C18:2A9’12)和α-亞麻酸(a-1inolenic acid, C18:3 Δ9’12’15)羧基端的第6和第7位碳原子之間插入一個(gè)新的雙鍵，分別脫氫形成Y-亞麻酸(γ-linolenic acid, C18:3 Δ6’9’12)和十八碳四烯酸(stearidonic acid, C18:4 Δ6’9’12’15)，它們?cè)偻ㄟ^碳鏈延伸和脫氫進(jìn)一步形成其它長(zhǎng)鏈的多不飽和脂肪酸(long-chain polyunsaturated fatty acid, LC-PUFAs),因此 Δ6-脂肪酸脫氫酶是人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶。這些長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是機(jī)體組織生物膜組成成分，起到維持細(xì)胞正常功能和增加機(jī)體抗逆性的作用[NapierJA et al，1999，Curr.0pin.Plant B1l，2:123-127]，同時(shí)也是前列腺素、環(huán)前列腺素和白三烯類等具有強(qiáng)烈生理活性的自身調(diào)節(jié)物的前體[Horrobinn DF, 1992, Prog LipidRes.,31:163-194] ο Λ6-脂肪酸脫氫酶活性的降低將導(dǎo)致Y -亞麻酸的合成量減少，引起人體的各種機(jī)能紊亂，進(jìn)而引發(fā)各種疾病。因此，從不同生物體中克隆Λ6-脂肪酸脫氫酶基因，再與不同表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)入不同的宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，利用宿主產(chǎn)生Y-亞麻酸和其他長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸具有極大應(yīng)用前景。
[0004]由于人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到Y(jié) -亞麻酸和其他長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的重要性，因此將注意力又轉(zhuǎn)向?qū)Ζ?6-脂肪酸脫氫酶的研究上。Λ 6-脂肪酸脫氫酶屬于一類膜整合酶，由于分離和鑒定膜結(jié)合蛋白的難度很大[MaKeon，1981，酶學(xué)方法，12141-12147 ；wang等，1988，植物生理學(xué)生物化學(xué)，26:777-792]，因此常規(guī)的生物化學(xué)方法很難得到包括Λ6-脂肪酸脫氫酶在內(nèi)的各種膜結(jié)合蛋白性質(zhì)脫氫酶高級(jí)機(jī)構(gòu)，而只能通過對(duì)酶的核苷酸序列進(jìn)行初步研究，對(duì)于△ 6_脂肪酸脫氫酶的生物學(xué)功能驗(yàn)證，許多實(shí)驗(yàn)室采用了從各種生物體中克隆相關(guān)的基因并轉(zhuǎn)入各種受體細(xì)胞中，然后在受體細(xì)胞中觀察其脂肪酸改變的方法。序列對(duì)比的結(jié)果表明，編碼Λ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列具有共同的機(jī)構(gòu)特性:存在三個(gè)組氨酸保守區(qū)，形成四次跨膜的結(jié)構(gòu)[Kyte et al，1982，J.Mol.B1l.157:105-132]，此外，除了藍(lán)細(xì)菌外，真核生物的脂肪酸脫氫酶的氨基端都含有類似于細(xì)胞色素b5(Cytb5)血紅素結(jié)合區(qū)(HPGG) [Napier JA, Sayanova O, Stobart AK, et al., 1997, B1chem.J.，157:105-132]，這些都是維持脫氫酶活性所必須的。
[0005]目前，通過多種分子生物學(xué)方法已從動(dòng)物、植物、微生物等不同來源中分離到許多Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的同源序列，并且證明具有相應(yīng)的生物學(xué)功能，然而，盡管獲得了很多Λ6-脂肪酸脫氫酶的基因序列，但是在酶的純化方面存在的技術(shù)困難，目前仍沒有從酶水平揭示其在自然環(huán)境中的生化特性。因此，只能借助于發(fā)掘更多的不同來源的Λ6-脂肪酸脫氫酶基因序列，通過基因序列分析來更深入揭示△ 6_脂肪酸脫氫酶的生物學(xué)功能，并為將來酶的純化和生化特性的揭示以及進(jìn)一步的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。此外，這些不同來源分離到的脫氫酶基因催化活性較低且大多數(shù)對(duì)脂肪酸底物鏈長(zhǎng)、雙鍵數(shù)目及雙鍵位置不具有嚴(yán)格的專一性，除目標(biāo)產(chǎn)物外，還會(huì)生產(chǎn)一些非特異脂肪酸。因此，需要繼續(xù)篩選具有高的底物特異性的脂肪酸脫氫酶基因，并應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建特異性生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因油料植物，直接改善油脂品質(zhì)，更加具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究通過多種手段發(fā)掘多不飽和脂肪酸合成的高效、特異性新基因，為新一代轉(zhuǎn)基因脂肪酸產(chǎn)品的品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種從深黃被孢霉iMortierella IsabelIina ) M6-22中分離得到的△ 6_脂肪酸脫氫酶基因及該基因編碼的氨基酸，該基因核苷酸序列或核苷酸序列的片段如SEQ ID NO:1所示，或與SEQ ID NO:1互補(bǔ)的核苷酸序列，該基因序列長(zhǎng)為1392bp(堿基)，其中1-1392為編碼Λ6-脂肪酸脫氫酶成熟多肽的開放閱讀框；該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽或其片段。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供一種含有Λ6-脂肪酸脫氫酶基因的重組表達(dá)載體，是將SEQ ID NO:1所示基因直接與不同表達(dá)載體(質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體)連接所構(gòu)建的重組載體。
[0008]可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建含編碼從深黃被孢霉Μ6-22 Λ6 -脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等[Sambroook, et al, Molecular Cloning, aLaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989]。所述的編碼深黃被孢霉M6-22 Δ6 -脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列可有效連接到表達(dá)載體的恰當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有:大腸桿菌的Iac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體的PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會(huì)使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10_300bp，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄，如腺病毒增強(qiáng)子。
[0009]本發(fā)明另一目的是提供一種含有Λ 6_脂肪酸脫氫酶基因或上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，或這些宿主細(xì)胞的后代，宿主細(xì)胞的代表性例子有:大腸桿菌；真菌細(xì)胞或酵母；植物細(xì)胞如油菜、煙草、大豆；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9 ;動(dòng)物細(xì)胞如CH0、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
[0010]用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體優(yōu)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期手機(jī)菌體，用CaCl2、電穿孔等方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用DNA轉(zhuǎn)染法。顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等方法。
[0011]本發(fā)明的核苷酸序列是DNA形式的，DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA，DNA可以是單鏈的或是雙鏈的，編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID N0:2所示的編碼區(qū)序列相同或是簡(jiǎn)并的變異體。
[0012]本發(fā)明還包括編碼從深黃被孢霉M6-22獲得的Λ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列的片段。如本發(fā)明所用，術(shù)語“片段”是指能編碼基本上保持本發(fā)明天然的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽的核苷酸序列。通過本文的闡述，這樣的片段、被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
[0013]本發(fā)明中的多肽和核苷酸序列優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
[0014]本發(fā)明中特異核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離核苷酸序列。這些技術(shù)包括但不局限于:(1)用探針與基因組或CDNA文庫雜交以檢出同源的核苷酸序列；和(2)表達(dá)文庫的抗性篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的核苷酸序列片段。
[0015]本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得:(1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；(2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
[0016]上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學(xué)合成法是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是DNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)?；蚴删wcDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，用試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法。當(dāng)結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)時(shí)，即使極少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。
[0017]本發(fā)明提供的核苷酸序列是一種高效的特異性的脂肪酸脫氫酶，可以將其與載體連接后轉(zhuǎn)化至微生物細(xì)胞體內(nèi)生產(chǎn)不飽和脂肪酸，具有產(chǎn)物特異性高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)不受場(chǎng)地、氣候、季節(jié)的影響及利用不同的菌種和培養(yǎng)基適合開發(fā)功能油脂等優(yōu)點(diǎn)，可以用于商業(yè)化生產(chǎn)，直接改善油脂品質(zhì)，更加具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建特異性生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞生產(chǎn)不飽和脂肪酸，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、可行性聞等優(yōu)點(diǎn)，為新一代轉(zhuǎn)基因脂肪酸廣品的品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明的深黃被孢霉M6-22的Λ6-脂肪酸脫氫酶和魯氏毛霉Λ6-脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列同源性比較圖，其中MID6-2為本發(fā)明的深黃被孢霉Μ6-22Λ6-脂肪酸脫氫酶，MRD6為魯氏毛霉Λ6-脂肪酸脫氫酶，Consensus為兩序列之間相同的氨基酸序列；
圖2為本發(fā)明所構(gòu)建的釀酒酵母表達(dá)載體PY3MID6-2 ；
圖3為本發(fā)明含PYES3/CT空載體的轉(zhuǎn)基因酵母的氣相色譜圖；
圖4為本發(fā)明含重組質(zhì)粒PY3MID6-2的轉(zhuǎn)基因酵母的氣相色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方法。
[0020]實(shí)施例1:從深黃被孢霉M6-22中分離Λ6-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列
采用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(產(chǎn)品編號(hào):SK8259)提取深黃被孢霉Isabel I ina)W6-22的基因組DNA，取Iul為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，根據(jù)所發(fā)表的脂肪酸脫氫酶同源序列的組氨酸保守區(qū)I和III區(qū)氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(引物I和引物2)，以上述提取的DNA模板在PCR儀(B10ER公司)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)所用引物、組份和擴(kuò)增條件如下:
引物 I (MID6DPC1F):
5'-CA(G/A)CA(G/A)T(G/C)(T/C)GG(A/T)TGG(T/C)T(G/T)GCNCA(C/T)GA-3'
引物 2 (MID6DPC3R):
5'-GGGAA (C/A)A(C/G/A)(G/A)TG(G/A)TG(G/C/T)TC(G/A)AT(C/T)TG-3'
PCR擴(kuò)增體系(25 PL)組成如下:
1XEx Taq Buffer2.5 M-L
dNTP (2.5 Mmol/L)2 μ?
模板I ML
MID6DPC1F (10 Mmol/L)2 μ?
MID6DPC3R (10 Mmol/L)2 μ?
ExTaq DNA polymerase (5U/M-L) 2 M-L
無菌ddH20補(bǔ)足至25 ?
擴(kuò)增條件:94°C變性4min，再用94°C lmin、55°C lmin、72°C 2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C lOmin，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到大小約SOObp的片段，用多功能DNA純化回收試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)回收，把回收片段亞克隆到pMD-18T (TaKaRa公司產(chǎn)品)中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用CaCl2法處理的大腸桿菌DH5 α，在含氨芐青霉素(lOOug/ml)的LB固體平板上過夜培養(yǎng)，挑取平板上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落，通過菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆。將驗(yàn)證陽性的克隆子接入LB液體培養(yǎng)基(含lOOug/ml氨芐青霉素)中過夜培養(yǎng)，用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，結(jié)果顯示所擴(kuò)增得到的片段大小為778bp,通過其編碼的氨基酸序列在Genebank數(shù)據(jù)庫中用Blast (Basic Local AlignmentSearch Tool)程序進(jìn)行同源檢索，檢索結(jié)果表明與該片段最相似的同源片段為Λ6-脂肪酸脫氫酶，但并不完全相同，證明所擴(kuò)增的片段為新的潛在的脫氫酶基因的部分片段。
[0021]在獲得部分序列基礎(chǔ)上，利用Seegene公司的DNA Walking speedUp Primix Kit進(jìn)行染色體步移，獲取兩段未知序列，最后用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析。從擴(kuò)增得到DNA序列中分析獲得一段編碼完整蛋白質(zhì)的編碼序列，并根據(jù)編碼序列設(shè)計(jì)合成特異性引物(弓丨物3和引物4)。同時(shí)將深黃被孢霉M6-22接種到PDA液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)48h，收集菌絲體，用液氮研磨成菌絲粉，然后采用真核細(xì)胞總RNA提取試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)提取深黃被孢霉M6-22的總RNA,再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(fermentas公司產(chǎn)品)反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA，以此cDNA為模板，用引物3和引物4進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)所用組份和擴(kuò)增條件如下:
引物 3:MID6-2Fl:5'-ATGCCCCCTCAAGTAGCTGAAGCATTG-3'
引物 4:MID6-2R1:5' -TTAGAAAGCCTTCTTGCTGAGCTTG-3' ； PCR擴(kuò)增體系(25 μυ組成如下:
1XEx Taq Buffer2.5 M-L
dNTP (2.5 Mmol/L)2 μ?
模板3 ?
MID6-2F1 (10 Mmol/L)2 μ?
MID6-2R1 (10 Mmol/L)2 μ?
Ex Taq DNA polymerase (5U/M-L)2 M-L
無菌ddH20補(bǔ)足至25 ?
擴(kuò)增條件:94°C變性4min，再用94°C lmin、58°C lmin、72°C 2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物按照部分序列擴(kuò)增中方法連接到PMD18-T載體中，驗(yàn)證正確后送出測(cè)序。結(jié)果顯示所擴(kuò)增得到的片段大小為1392bp，通過其編碼的氨基酸序列在Genebank數(shù)據(jù)庫中用Blast(Basic Local Alignment Search Tool)程序進(jìn)行同源檢索,檢索結(jié)果表明與該片段最相似的同源片段為脂肪酸脫氫酶，但并不完全相同，證明所擴(kuò)增的片段為新的潛在的脫氫酶基因的部分片段。
[0022]實(shí)施例2:所分離核苷酸序列的同源性搜索
將推測(cè)的脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列在Genbank上進(jìn)行同源性搜索，所得同源序列大部分為編碼△ 6-脂肪酸脫氫酶的序列，少數(shù)為假定蛋白的序列，選擇已做功能驗(yàn)證的Δ6-脂肪酸脫氫酶做同源性比較，其中與魯氏毛霉(ifocor的Λ6-脂肪酸脫氫酶
(AF290983_1)相似性最高，為56%。(圖1，圖1顯示本發(fā)明的深黃被孢霉M6-22中分離Λ6-脂肪酸脫氫酶和魯氏毛霉脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列同源性比較圖，MID6-2為本發(fā)明的深黃被孢霉Μ6-22Λ6-脂肪酸脫氫酶，MRD6為魯氏毛霉Λ6-脂肪酸脫氫酶，Consensus為兩序列之間相同的氨基酸序列，這說明本發(fā)明提供的核苷酸序列所編碼的酶為潛在新的Δ6-脂肪酸脫氫酶。
[0023]實(shí)施例3:釀酒酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)SEQ ID N0:1所示編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物(引物5和引物6): 引物 5:MID6~2F2:5'-CGGGTACCATGCCCCCTCAAGTAGCTGA-3'
引物 6:MID6-2R2:5' -ATCTCGAGTTAGAAAGCCTTCTTGCT-3'
此兩個(gè)引物的5'端下劃線部分分別含有式? I和通0 I酶切位點(diǎn)，所用的擴(kuò)增條件和反應(yīng)組分和以cDNA為模板的PCR反應(yīng)相同，擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示和SEQ ID N0:1所示l-1392bp的序列一致；然后取25ul PCR產(chǎn)物和1ul pYES3/CT (Invitrogen公司)分別進(jìn)行雙酶切，電泳回收酶切大片段，并用T4連接酶在16°C連接4h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HD5ci，通過質(zhì)粒提取和PCR篩選陽性克隆，并進(jìn)行測(cè)序鑒定，質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果見圖2，所構(gòu)建的含有Λ6-脂肪酸脫氫酶基因的表達(dá)載體命名為PY3MID6-2。
[0024]實(shí)施例4:釀酒酵母重組表達(dá)載體和空載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞
挑取釀酒酵母菌株INVScl單菌落于5ml YEPD液體培養(yǎng)基中，30°C搖床過夜培養(yǎng)，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于10ml的YEH)液體培養(yǎng)基中，30°C搖床搖至0D600于1.3-1.5之間；4°C、4000g離心5min收集沉淀細(xì)胞，用10ml預(yù)冷的無菌ddH20洗滌細(xì)胞，4°C、4000g離心5min收集沉淀細(xì)胞，再用50ml預(yù)冷的無菌ddH20洗滌細(xì)胞，4°C、4000g離心5min收集沉淀細(xì)胞，用20ml預(yù)冷的IM山梨醇洗滌細(xì)胞，4°C、4000g離心5min收集沉淀細(xì)胞，細(xì)胞用0.5ml的預(yù)冷的IM山梨醇懸浮，每80ul分裝于1.5ml預(yù)冷的離心管中，取Iug線性化的重組表達(dá)載體PY3MID6-2和空載體pYES3/CT分別加入到80ul的感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后轉(zhuǎn)至0.2cm的電轉(zhuǎn)杯中，冰上孵育5min，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)儀中電擊(電擊條件:電壓1.5kV，電容25uF，電阻200Ω，電擊時(shí)間為4-10ms)，電擊完畢后立即加入Iml IM預(yù)冷的山梨醇并吹勻，30°C孵育2h后分別涂布于SC-Trp (無色氨酸)選擇培養(yǎng)基上，置30°C培養(yǎng)3-4天。
[0025]實(shí)施例5:酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)與脂肪酸甲酯的氣相色譜分析
挑取分別轉(zhuǎn)化了重組表達(dá)載體PY3MID6-2和空載體pYES3/CT并在SC-Trp選擇培養(yǎng)基(色氨酸合成缺陷型培養(yǎng)基)平板上出現(xiàn)的陽性轉(zhuǎn)化子，分別接種于15ml液體SC-Trp選擇培養(yǎng)基(含2%葡萄糖)，30°C搖菌培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接于10ml的SC-Trp選擇培養(yǎng)基(含2%的半乳糖和1%的棉子糖)中，使其初始0D600為0.4，加入0.5mmol /L的外源底物亞油酸，30°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)72h，4000g離心收集菌體，用去離子水洗滌三次，菌體于50°C烘干，研碎，取10mg干菌體粉末加入5ml 5%的KOH-CH3OH溶液中，70°C反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用6M的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值到2.0，加入4ml 14%BF3_CH30H，70°C反應(yīng)1.5h，合成脂肪酸甲酯；再加入1ml飽和的NaCl溶液，劇烈震蕩混勻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用8ml 1:4的氯仿:環(huán)己烷抽提兩次，合并兩次的提取液，把含有脂肪酸甲酯的溶劑用氮?dú)獯蹈?，?00ul的正己烷回溶樣品，最后用0.45um微孔濾膜過濾除去大顆粒雜質(zhì)。
[0026]實(shí)施例6:脂肪酸氣相色譜分析
采用氣相色譜分析儀器分析轉(zhuǎn)基因酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)情況，氣相色譜分析儀器為島津GC-7A，柱子:彈性石英毛細(xì)管柱，0.32X30m，固相支持物:聚二乙二醇丁二酸酯鍍膜物:聚酰亞胺。載氣:N2，線速10cm/s。分流比:100:1，氣化室溫度:250°C，柱溫:180°C，尾吹:50ml/min，檢測(cè)器:氫火焰離子化檢測(cè)器。把上述制備的脂肪酸甲酯化樣品進(jìn)行GC分析,上樣量為Iul ;分析軟件:Anstar。
[0027]色譜分析結(jié)果見圖3、4，圖3顯示含pYES3/CT空載體的轉(zhuǎn)基因酵母，圖4顯示含重組質(zhì)粒PY3MID6-2的轉(zhuǎn)基因酵母；與圖3相比，圖4中保留時(shí)間為15.05min對(duì)應(yīng)的峰與Y-亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品一致，即為深黃被孢霉Μ6-22Λ6-脂肪酸脫氫酶催化亞油酸產(chǎn)生的
Y-亞麻酸。
【權(quán)利要求】
1.一種Λ6-脂肪酸脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求1所述的脂肪酸脫氫酶基因。
3.權(quán)利要求1所述脂肪酸脫氫酶基因在生產(chǎn)多不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104250651SQ201410360131
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】張琦, 許振寧, 魏云林, 林連兵, 季秀玲 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)