一種棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明具體涉及一種棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法。該方法包括誘導(dǎo)棉花種子萌發(fā)、酶解分離保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體、離心等步驟。本發(fā)明所提供的棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，對(duì)棉花葉片的保衛(wèi)細(xì)胞采用一步酶解法，與兩步酶解法相比大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作流程，提高了實(shí)驗(yàn)效率，而且保持了原生質(zhì)體較高的生理活力，更解決了棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體分離的難題。棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的成功分離，為研究保衛(wèi)細(xì)胞膜通透性、離子轉(zhuǎn)運(yùn)以及氣孔運(yùn)動(dòng)機(jī)理提供了較好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【專利說明】一種棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 棉花，錦葵科棉屬植物，植株灌木狀。棉花是世界上最主要的農(nóng)作物之一，而我國 也是棉花產(chǎn)量最高的國家之一。棉花的主副產(chǎn)品都有較高的利用價(jià)值，它既是最重要的纖 維作物，又是重要的油料作物，也是含高蛋白的糧食作物，還是紡織、精細(xì)化工原料和重要 的戰(zhàn)略物資。
[0003] 棉花作為重要的經(jīng)濟(jì)作物和纖維作物，將現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用于棉花育種和生產(chǎn)有 著廣闊的前景。近年來棉花生物技術(shù)發(fā)展很快，先后在雜種植株的培育、抗性突變體篩選、 轉(zhuǎn)基因抗病蟲害植株的培育方面都取得了很大的進(jìn)展。
[0004] 保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體是研究氣孔運(yùn)動(dòng)、膜通透性和離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程的重要材料。保衛(wèi) 細(xì)胞可說是植物體中最奇妙的細(xì)胞，能感受內(nèi)、外環(huán)境信號(hào)而調(diào)節(jié)其本身體積，從而控制氣 孔大小，主宰植物體與外界環(huán)境所進(jìn)行的水分、氣體等交換，從而更好地適應(yīng)不利的環(huán)境。 然而如何獲得純化有活性的棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，利用電生理膜片技術(shù)解析棉花保衛(wèi)細(xì) 胞質(zhì)膜離子的跨膜流動(dòng)，特別是監(jiān)控K+和Ca 2+跨膜流動(dòng)情況是解釋棉花響應(yīng)逆境條件氣孔 運(yùn)動(dòng)機(jī)理的重要前提。遺憾的是，目前沒有對(duì)棉花保衛(wèi)細(xì)胞的原生質(zhì)體分離純化描述，最近 有對(duì)棉花葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離的報(bào)道(李妮娜，作物學(xué)報(bào)2014,40(2) : 231 - 239)。葉肉 細(xì)胞原生質(zhì)體的獲得，主要用于轉(zhuǎn)化基因表達(dá)檢測(cè)。目前，如何分離和純化棉花保衛(wèi)細(xì)胞原 生質(zhì)體，已成為限制棉花氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)控機(jī)制研究的主要因素。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，可以制備較為純凈 的棉花保衛(wèi)細(xì)胞的原生質(zhì)體。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0007] -種棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，包括以下步驟： (1) 取棉花種子，誘導(dǎo)萌發(fā)； (2) 取步驟（1)中萌發(fā)3~4周后的棉花真葉，漂洗干凈，優(yōu)選采用無菌水漂洗，撕取表皮 條，將收集的表皮條轉(zhuǎn)入酶解液中，于23~28°C水浴震蕩1. 5~2h游離保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體； (3) 向步驟（2)中酶解結(jié)束后混合液中加入混合液5~10倍體積的基本介質(zhì)，濾網(wǎng)雙層 過濾，濾液低速離心，棄上清液，保留離心管管體下端1/3的溶液，所述低速離心為20(Γ300 轉(zhuǎn)/min，離心5~8分鐘； (4) 將步驟（3)中保留溶液加入基本介質(zhì)重新懸浮，高速離心，棄上清，所述高速離心為 700~800轉(zhuǎn)/min,離心8~10min，重復(fù)此步驟2~3次，可獲得純凈的原生質(zhì)體； 步驟（3)、步驟（4)中所述基本介質(zhì)為液體，其組分為：谷氨酸鉀10 mmol/ L、MgCl2 2 mmol/ L、Mes(2_(N_嗎啉）乙磺酸一水合物）10 mmol/ L，用山梨醇調(diào)調(diào)滲透壓至55CT600 mOsmol /Kg, 1 mmol / L KOH 調(diào)節(jié) pH 至 5. 0?6. 0。
[0008] 步驟（2)中所述酶解液體系為：纖維素酶RS質(zhì)量分?jǐn)?shù)1. 3%，果膠酶Y-23質(zhì)量分 數(shù)0.03%，牛血清蛋白（BSA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%，抗壞血酸0.5 mmol/L，山梨醇調(diào)滲透壓至 530?550 mOsmol /Kg，l mmol/ L Κ0Η 調(diào)節(jié) pH 至 5.0?6.0。
[0009] 步驟（1)中為打破棉花種子休眠，可先將成熟飽滿的棉花種子于80°C水浴浸種2 分鐘；然后在16 h光照/8 h黑暗、光強(qiáng)為22 KLux、溫度2(T29°C、相對(duì)濕度60%至70%的 條件下誘導(dǎo)萌發(fā)。
[0010] 步驟（3)中濾網(wǎng)為400目。
[0011] 本發(fā)明所提供的棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，對(duì)棉花葉片的保衛(wèi)細(xì)胞采用 一步酶解法，與兩步酶解法相比大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作流程，提高了實(shí)驗(yàn)效 率，而且保持了原生質(zhì)體較高的生理活力，更解決了棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體分離的難題。棉 花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的成功分離，為研究保衛(wèi)細(xì)胞膜通透性、離子轉(zhuǎn)運(yùn)以及氣孔運(yùn)動(dòng)機(jī)理 提供了較好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為酶解如后棉花保衛(wèi)細(xì)胞的20倍顯微圖像； 圖2為直接高速離心條件下分離棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的20倍顯微圖像； 圖3為先低速、后高速離心條件下分離棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的20倍顯微圖像； 圖4為膜片鉗實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)所分離的棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體活性的檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說明。 實(shí)施例
[0014] 棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，包括以下步驟： (1) 取棉花種子，誘導(dǎo)萌發(fā)； 為打破棉花種子休眠，可先將成熟飽滿的棉花種子于80°c水浴中浸種2分鐘； 棉花種子在16 h光照/8 h黑暗、光強(qiáng)為22 KLux、溫度2(T29°C、相對(duì)濕度65%的條件 下誘導(dǎo)萌發(fā)； (2) 取步驟（1)中萌發(fā)3~4周后的棉花真葉，無菌水漂洗干凈，撕取表皮條，將收集的表 皮條轉(zhuǎn)入酶解液中，于23~28°C水浴震蕩1. 5~2小時(shí)游離保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，酶解前后20倍 顯微結(jié)果如圖1所示； (3) 向步驟（2)中酶解結(jié)束后混合液中加入混合液5~10倍體積的基本介質(zhì)，400目濾 網(wǎng)雙層過濾，濾液低速離心，棄上清液，保留離心管管體下端1/3的溶液，所述低速離心為 20(Γ300轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘； (4) 將步驟（3)中保留溶液加入基本介質(zhì)重新懸浮，離心，棄上清，所述高速離心為 70(Γ800轉(zhuǎn)/分鐘，離心8~10分鐘，重復(fù)此步驟2~3次，即可獲得純凈的原生質(zhì)體； 步驟（3)、步驟（4)中所述基本介質(zhì)為液體，其組分為：谷氨酸鉀10 mmol/ L、MgCl2 2 mmol/ L、Mes (2-(N_嗎啉）乙磺酸一水合物)10 mmol/ L，用山梨醇調(diào)調(diào)滲透壓至55CT600 mOsmol /Kg, 1 mmol / L KOH 調(diào)節(jié) pH 至 5. 0?6. 0。
[0015] 步驟（2)中所述酶解液體系為：纖維素酶RS質(zhì)量分?jǐn)?shù)1. 3%，果膠酶Y-23質(zhì)量分 數(shù)0.03%，牛血清蛋白（BSA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%，抗壞血酸0.5 mmol/L，山梨醇調(diào)滲透壓至 530?550 mOsmol /Kg，l mmol/ L Κ0Η 調(diào)節(jié) pH 至 5.0?6.0。
[0016] 針對(duì)不同離心條件情況下，所獲得的原生質(zhì)體純度情況，發(fā)明人做了進(jìn)一步的探 討分析，相同情況下，針對(duì)直接高速離心，即70(Γ800轉(zhuǎn)/分鐘，離心8~10分鐘條件下，所獲 得的原生質(zhì)體純凈度情況如圖2所示，從圖2的20倍顯微結(jié)果可以看出，直接高速離心條 件下，所獲得的棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體純凈度較差。在采用先低速、后高速離心情況下，不 同條件下所獲得的棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體純凈度情況如圖3所示，從圖3的20倍顯微結(jié)果 可以明顯看出，相較于直接高速離心情況，采用先低速、后高速離心條件，所獲得的棉花原 生質(zhì)體的純凈度大幅提高。
[0017] 針對(duì)28°C水浴、酶解2h，先300轉(zhuǎn)/分鐘、低速離心5min，后800轉(zhuǎn)/分鐘、高速離 心10min情況下所獲得的棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，發(fā)明人對(duì)其做了進(jìn)一步的原生質(zhì)體活性 檢測(cè)。對(duì)分離的原生質(zhì)體，利用膜片鉗技術(shù)，鉗住單個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)K+跨膜流動(dòng)情況，發(fā)現(xiàn)其 K+電流正常(對(duì)照)，光照處理K+電流明顯增加，結(jié)果如圖4所示。上述結(jié)果表明，所分離純 化出的棉花保衛(wèi)細(xì)胞較好的保持了原始活性，可用于植物抗旱功能的相關(guān)研究，因而具有 較好的實(shí)用性。
【權(quán)利要求】
1. 一種棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 取棉花種子，誘導(dǎo)萌發(fā)； (2) 取步驟（1)中萌發(fā)3~4周后的棉花真葉，漂洗干凈，撕取表皮條，將收集的表皮條轉(zhuǎn) 入酶解液中，于23~28°C水浴震蕩1. 5~2h游離保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體； (3) 向步驟（2)中酶解結(jié)束后的混合液中加入混合液5~10倍體積的基本介質(zhì)，濾網(wǎng) 雙層過濾，濾液低速離心，棄上清液，保留離心管管體下端1/3的溶液，所述低速離心為 20(Γ300轉(zhuǎn)/min，離心5?8分鐘； (4) 將步驟（3)中保留溶液加入基本介質(zhì)重新懸浮，高速離心，棄上清，所述高速離心為 700~800轉(zhuǎn)/min,離心8~10min ;重復(fù)此步驟2~3次，可獲得純凈的原生質(zhì)體； 步驟（3)、步驟（4)中所述基本介質(zhì)為液體，其組成為：谷氨酸鉀10 mmol/ L、MgCl2 2 mmol / L、Mes 10 mmol / L，山梨醇調(diào)滲透壓至 550?600 mOsmol /Kg，1 mmol / L KOH 調(diào) pH 至 5. 0?6. 0。
2. 如權(quán)利要求1所述棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，其特征在于，步驟（2)中所述 酶解液體系組成為：纖維素酶RS 1.3wt%、果膠酶Y-23 0. 03wt%、牛血清蛋白BSA 0. 25wt%、 抗壞血酸0. 5 mmol/L，山梨醇調(diào)滲透壓至530?550 mOsmol /Kg，1 mmol / L KOH調(diào)節(jié)pH至 5. (Γ6. 0。
3. 如權(quán)利要求1所述棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，其特征在于，步驟（1)中誘導(dǎo) 棉花種子萌發(fā)的具體步驟為：取成熟飽滿的棉花種子，80°C水浴浸種2分鐘；浸種后，棉花 種子在16 h光照/8 h黑暗、光強(qiáng)為22 KLux、溫度2(T29°C、相對(duì)濕度60%至70%的條件下 誘導(dǎo)萌發(fā)。
4. 如權(quán)利要求1所述棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，其特征在于，步驟（3)中濾網(wǎng) 為400目。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK104152396SQ201410371954
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】張驍, 趙翔, 孔培濤, 王雪嬌, 高歌 申請(qǐng)人:河南大學(xué)