一種利用ssr指紋圖譜鑒別白蠟種的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用SSR指紋圖譜鑒別白蠟種的方法，步驟包括：(1)白蠟總DNA提取，(2)SSR序列PCR擴(kuò)增，(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳、染色及鑒定；其中：步驟(2)公開(kāi)的4對(duì)SSR引物組合即可將白蠟DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)條帶差異性明顯的結(jié)果，并以此構(gòu)建了白蠟種的SSR指紋圖譜。本發(fā)明方法從分子水平上對(duì)白蠟種質(zhì)資源進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定，解決了白蠟種質(zhì)鑒定困難的問(wèn)題，且檢測(cè)時(shí)間短、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、在收集的12個(gè)種中具有專(zhuān)一性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種利用SSR指紋圖譜鑒別白蠟種的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用SSR指紋圖譜鑒別白蠟種的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]指紋圖譜最重要的應(yīng)用之一是種質(zhì)的鑒定。種質(zhì)鑒定不清會(huì)導(dǎo)致劣種趨多，種質(zhì)資源浪費(fèi)，甚至種群退化。因此，種質(zhì)鑒定無(wú)論在生產(chǎn)上或者研究中都非常的重要。傳統(tǒng)的鑒定方法過(guò)程復(fù)雜，鑒定周期長(zhǎng)，并且易受取樣部位、發(fā)育時(shí)期及環(huán)境等多種因素的影響，準(zhǔn)確率不高，對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員的操作技術(shù)要求比較精細(xì)，因而無(wú)法大規(guī)模推廣應(yīng)用，鑒定效率低。尤其在植物苗木的鑒定上，近緣種內(nèi)不同種源、無(wú)性系、品種間很難區(qū)分。近年來(lái)發(fā)展的指紋圖譜技術(shù)方便快捷且結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，被越來(lái)越多的應(yīng)用與植物品種鑒定工作中。目前 DNA 指紋圖譜技術(shù)主要有 RFLP (Restrict1n Fragment Length Polymorphism,限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性)、RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA，隨機(jī)多態(tài)擴(kuò)增DNA)、AFLP (Amplified fragment length polymorphism,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)、SSR(SimpleSequence Repeat,簡(jiǎn)單序列重復(fù))、ISSR(Inter Simple Sequence Repeat,簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性)等。綜合比較當(dāng)今應(yīng)用廣泛的幾種分子標(biāo)記方法，SSR標(biāo)記是種質(zhì)鑒定方面最靈敏、最可靠的一種分子標(biāo)記。
[0003]白蠟屬植物為風(fēng)媒花，混栽時(shí)很容易發(fā)生天然授粉雜交，尤其是絨毛白蠟(F.velutina)、紅柊(F.pennsylvanica)、白柊(F.americana)等同為柊亞屬柊組,其形態(tài)特征非常相似，親緣關(guān)系極為親近，雜交后代，傳統(tǒng)的方法往往無(wú)法區(qū)分。以往在區(qū)分種苗時(shí)都是采用宏觀遺傳分析的生物學(xué)特性和形態(tài)特征指標(biāo)，難以區(qū)分形態(tài)極為相似或親緣關(guān)系極近的種苗，尤其是種內(nèi)不同水平的良種更是無(wú)法識(shí)別，以致生產(chǎn)中出現(xiàn)混種、混系、混株，以假亂真的情況，其結(jié)果給生產(chǎn)帶來(lái)了極大損失。因此，尋求從分子水平真正準(zhǔn)確識(shí)別白蠟良種是極具現(xiàn)實(shí)意義的。在分子水平上對(duì)種質(zhì)進(jìn)行鑒定不受環(huán)境和生長(zhǎng)階段的影響，結(jié)果穩(wěn)定，可靠性強(qiáng)。同時(shí)，使用的標(biāo)記技術(shù)需要具有高度靈敏性，獲得的標(biāo)記需要具有個(gè)體特異性，目前，白蠟在分子水平上的研究極少，王健兵等進(jìn)行了白蠟SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選(2014)，但關(guān)于白蠟SSR指紋圖譜方面的實(shí)際應(yīng)用及研究鮮見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種利用SSR指紋圖譜鑒別白蠟種的方法。
[0005]本發(fā)明所述利用SSR指紋圖譜鑒別白蠟種的方法，步驟包括:
[0006]1、白蠟總DNA提取:采用CTAB法提取白蠟總DNA ；
[0007]2、SSR序列PCR擴(kuò)增:以步驟⑴提取的白蠟總DNA樣品為模板，采用如下4對(duì)引物進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，
[0008]引物對(duì)1:上游:5 ‘TGTTCGGTTTCCTTGCTC’ 3
[0009]下游:5‘AAAGAGGGCTGCTGGAGT’ 3 ；
[0010]引物對(duì)2:上游:5 ‘ACTTGTAATGCTGGGAGG’ 3
[0011]下游:5‘AATTCCAGTGGTAGAGGC’ 3 ;
[0012]引物對(duì)3:上游:5 ‘TGGTGGAAACAAGATGGG’ 3 ；
[0013]下游:5‘CTCGGGACAGAATGGATG’ 3
[0014]引物對(duì)4:上游:5 ‘AGCAGCATTTATGAATGTTC’ 3
[0015]下游:5‘ATCAACTGAAGATGACGACG，3。
[0016]上述SSR-PCR 采用 1ul 反應(yīng)體系:25mmol.F1Mg2+0.8 μ 1、10 μ mol.1-1 引物
0.2 μ IUOmmol.ΜΝΤΡΟ.3 μ 1、5U.μ F1Taq 酶 0.05 μ l、5_10ng.μ F1DNA 模板 2.00 μ I,10 X PCR 緩沖液 1.0 μ 1，ddH205.45 μ I ；
[0017]上述PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，54°C _58°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5延伸lmin，4°C 1min終止反應(yīng)；
[0018]3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及染色:采用6%聚丙烯酞胺凝膠電泳及銀染顯色，觀察照相,記錄電泳結(jié)果；
[0019]4、SSR指紋圖譜結(jié)果分析及鑒定:采用統(tǒng)計(jì)電泳帶型，構(gòu)建供試材料SSR指紋圖譜，進(jìn)行白蠟種質(zhì)鑒定。上述4對(duì)SSR引物組合構(gòu)建的指紋圖譜見(jiàn)表1。
[0020]表1:4對(duì)SSR引物組合構(gòu)建的指紋圖譜
[0021]

【權(quán)利要求】
1.一種利用SSR指紋圖譜鑒別白蠟種的方法，步驟包括:(1)白蠟總DNA提取，(2) SSR序列PCR擴(kuò)增，(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳、染色及鑒定；其中:步驟⑴所述的白蠟總DNA提取，采用CTAB法，步驟(3)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳采用6%聚丙烯酞胺凝膠電泳，染色采用銀染法染色，鑒定采用統(tǒng)計(jì)電泳帶型，構(gòu)建供試材料SSR指紋圖譜，進(jìn)行白蠟種質(zhì)鑒定； 其特征在于: 步驟⑵所述SSR序列PCR擴(kuò)增是以步驟(1)提取的白蠟總DNA樣品為模板，采用如下4對(duì)引物進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增: 引物對(duì) 1:上游:5 ‘TGTTCGGTTTCCTTGCTC，3 下游:5 ‘AAAGAGGGCTGCTGGAGT’ 3 ； 引物對(duì) 2:上游:5 ‘ACTTGTAATGCTGGGAGG’ 3 下游:5 ‘AATTCCAGTGGTAGAGGC’ 3 ； 引物對(duì) 3:上游:5 ‘TGGTGGAAACAAGATGGG’ 3 ； 下游:5 ‘CTCGGGACAGAATGGATG’ 3 引物對(duì) 4:上游:5 ‘AGCAGCATTTATGAATGTTC’ 3
下游:5 ‘ATCAACTGAAGATGACGACG’ 3。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104164503SQ201410380064
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月4日
【發(fā)明者】燕麗萍, 李麗, 劉翠蘭, 劉桂民, 王振猛, 夏陽(yáng) 申請(qǐng)人:山東省林業(yè)科學(xué)研究院