小rna組成的指紋圖譜在胃癌中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及小RNA組成的指紋圖譜在人胃癌診斷和治療中的應(yīng)用，由數(shù)個(gè)microRNA組成的指紋圖譜可非常有效地區(qū)分胃癌組織和癌旁(正常)組織，靈敏度高，特異性強(qiáng)，可有效用于胃癌診斷。
【專利說明】
小RNA組成的指紋圖譜在胃癌中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)、生物工程和檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明公開了一組小 RNA(miRNA ;microRNA)指紋圖譜在人胃癌診斷中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，中國已經(jīng)成為全球胃癌高發(fā)區(qū)，每年新發(fā)病例40萬，死亡30萬，且超世界 平均水平兩倍以上。并且胃癌發(fā)病有明顯的地域性差別，在我國的西北與東部沿海地區(qū)胃 癌發(fā)病率比南方地區(qū)明顯為高。好發(fā)年齡在50歲以上，男女發(fā)病率之比為2:1。過去半個(gè) 世紀(jì)，人們對(duì)胃癌的基礎(chǔ)和臨床研究投入了大量精力，對(duì)胃癌潛在致癌因素有了一定了解 (如幽門螺旋桿菌）、胃癌高危人群的有效篩查和早診率的提高、外科手術(shù)和多種治療手段 的應(yīng)用，胃癌患者的預(yù)后有了顯著的提高，但總體的5年生存率仍然徘徊于20%。此外，大 部分胃癌患者依然難以早期發(fā)現(xiàn)，據(jù)我們前期研究顯示，胃癌患者初診時(shí)60%病例合并淋 巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而超過5%患者存在臟器轉(zhuǎn)移，即使行根治性切除，大部分患者還會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和 轉(zhuǎn)移。
[0003] 胃癌的分期系統(tǒng)是由美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)AJCC于國際抗癌聯(lián)盟UICC共同制定， 以胃癌數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，并確切指出淋巴結(jié)陽性患者的預(yù)后和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目有關(guān)?，F(xiàn)代 的胃癌分期是基于原發(fā)腫瘤/淋巴結(jié)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（TNM)的系統(tǒng)，而不是以腫瘤的大小為基 礎(chǔ)。
[0004] 對(duì)于胃癌的基礎(chǔ)和臨床研究已有相當(dāng)長的歷史，并且取得了顯著的進(jìn)展，尤其是 miRNAs在胃癌中的研究，近幾年進(jìn)展較快，業(yè)已發(fā)現(xiàn)miRNAs在胃癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移、診斷、評(píng)估 療效和判斷預(yù)后等方面發(fā)揮了極其重要的作用。
[0005] MicroRNA(miRNA)是一類長度約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，調(diào)節(jié)約 60%的人類編碼基因，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)多種病理生理反應(yīng)。MiRNAs在胃癌發(fā)生中起到促癌或者 抑癌的功能，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)或抑制胃癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。
[0006] 因此，深入挖掘胃癌發(fā)病相關(guān)miRNAs，并闡明其作用機(jī)制和臨床意義，對(duì)于指導(dǎo)胃 癌診療和評(píng)估預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一組與胃癌發(fā)病相關(guān)的miRNA，利用這些miRNA的表達(dá)量可以準(zhǔn)確 地區(qū)分胃癌組織和癌旁組織。
[0008] 本發(fā)明第一方面，提供了一種miRNA集合或組合，所述的miRNA集合或組合包括：
[0009] (a) SEQ ID N0. : 1-9 所示的 9 個(gè)序列；或
[0010] (b)與SEQ ID N0. : 1-9所示序列互補(bǔ)的9個(gè)互補(bǔ)序列；或
[0011] (c)來自（a)或（b)的組合，且來自（a)的序列與來自（b)的互補(bǔ)序列互相不為互 補(bǔ)。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA集合或組合還包括：
[0013] (al) -種或多種選自SEQ ID NO. :10-12所示的序列；或
[0014] (bl) -種或多種選自與SEQ ID NO. :10-12所示序列互補(bǔ)的互補(bǔ)序列；或
[0015] (c2)來自（al)或（bl)的組合，且來自（al)的序列與來自（bl)的互補(bǔ)序列互相 不為互補(bǔ)。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA集合或組合含有SEQ ID N0. : 1-9所示的全部序 列。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA集合或組合包括：
[0018] ⑴序列如SEQ ID N0:1-12所示的12個(gè)序列；或
[0019] (i i)與SEQ ID N0:1-12所示序列互補(bǔ)的12個(gè)序列。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA分離自人。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的序列可通過化學(xué)合成或構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá) 獲得。
[0022] 本發(fā)明第二方面，提供了一種分離的或人工構(gòu)建的前體miRNA集合或組合，所述 的前體miRNA集合或組合中的前體miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)剪切并表達(dá)成本發(fā)明第一方面所述 的miRNA集合或組合中的miRNA。
[0023] 本發(fā)明第三方面，提供了一種分離的多核苷酸集合或組合，所述的多核苷酸集合 或組合中的多核苷酸能被人細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，所述的前體miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪 切且表達(dá)成本發(fā)明第一方面所述miRNA集合或組合中的miRNA ;
[0024] 較佳地，所述的多核苷酸具有式I所示的結(jié)構(gòu)：
[0025] Seq 正向-X-Seq 反向式 I，
[0026] 式 I 中，
[0027] Seq正向?yàn)槟茉谌思?xì)胞中表達(dá)成所述的miRNA的核苷酸序列，
[0028] Seq反向?yàn)榕cSeq正向基本上互補(bǔ)或完全互補(bǔ)的核苷酸序列；
[0029] X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和 Seq反向不互補(bǔ)，
[0030] 并且式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入人細(xì)胞后，形成式II所示的二級(jí)結(jié)構(gòu)：
[0031]
[0032] 式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述，
[0033] | |表示在Seq正向和Seq反向之間形成的堿基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系。
[0034] 本發(fā)明第四方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明第一方面所述的miRNA集合或 組合，或本發(fā)明第三方面所述的多核苷酸集合或組合。
[0035] 本發(fā)明第五方面，提供了一種miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：
[0036] 固相載體；以及
[0037] 有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對(duì)應(yīng) 于SEQ ID N0:1-9所示全部序列。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的特異性地對(duì)應(yīng)指的是所述的寡核苷酸探針上的序列分別 與SEQ ID NO. :1-9所示的序列互補(bǔ)或基本互補(bǔ)；或分別與SEQ ID NO. :1-9所示序列相同。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的芯片還含有特異性針對(duì)一種或多種選自SEQ ID NO. :10-12所示序列的寡核苷酸探針。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的寡核苷酸探針含有：
[0041] 互補(bǔ)結(jié)合區(qū)；和/或
[0042] 與固相載體相連的連接區(qū)。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的寡核苷酸探針特異性地對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1-12所示的全 部序列。
[0044] 本發(fā)明第六方面本發(fā)明第一方面所述miRNA集合或組合；和/或本發(fā)明第五方面 所述miRNA芯片的用途，用于制備區(qū)分胃癌組織和癌旁組織的芯片或試劑盒。
[0045] 本發(fā)明第七方面，提供了一種試劑盒，所述的試劑盒中含有本發(fā)明第五方面所述 的miRNA芯片和/或用于本發(fā)明第一方面所述miRNA集合或組合的檢測(cè)試劑。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有本發(fā)明第一方面所述的miRNA集合或組合 用于陽性對(duì)照。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括說明書，所述的說明書記載了利用本發(fā) 明miRNA芯片對(duì)SEQ ID NO. :1-12所示序列進(jìn)行測(cè)試的方法。
[0048] 本發(fā)明第八方面，提供了一種篩選治療胃癌候選藥物的方法，所述方法包括以下 步驟：
[0049] (a)在實(shí)驗(yàn)組中，在待測(cè)物質(zhì)存在下培養(yǎng)胃癌細(xì)胞；并且在對(duì)照組中，在與所述實(shí) 驗(yàn)組條件相同但不存在所述待測(cè)物質(zhì)的情況下培養(yǎng)相同的胃癌細(xì)胞；
[0050] (b)測(cè)定所述實(shí)驗(yàn)組中胃癌細(xì)胞的miRNA的表達(dá)水平，并與對(duì)照組中胃癌細(xì)胞的 miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較；
[0051] 其中，如果與所述對(duì)照組相比，所述實(shí)驗(yàn)組中的所述miRNA的表達(dá)水平發(fā)生了趨 向于癌旁組織細(xì)胞的表達(dá)水平的變化，則表明所述待測(cè)物質(zhì)是抗胃癌的候選藥物。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA為本發(fā)明第一方面所述的miRNA集合或組合。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述的"發(fā)生了趨向于癌旁組織細(xì)胞的表達(dá)水平的變化"指對(duì)于 某一 miRNA而言，滿足下式：
[0054] Q ^ 0. 6
[0055] 其中，Q = abs (A1-A0) /abs (A2-A0)
[0056] 式中，
[0057] A0為癌旁細(xì)胞中所述miRNA表達(dá)水平；
[0058] A1為實(shí)驗(yàn)組的所述miRNA表達(dá)水平；
[0059] A2為對(duì)照組的所述miRNA表達(dá)水平；
[0060] abs表示絕對(duì)值。
[0061] 在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述miRNA為胃癌上調(diào)型（即A2-A0 > 0)時(shí)，則A1-A0彡0 或Q < 0. 6 (較佳地< 0. 5)。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述miRNA為胃癌下調(diào)型（即A2-A0 < 0)時(shí)，則A1-A0彡0 或Q < 0. 6 (較佳地< 0. 5)。
[0063] 在另一優(yōu)選例中，在所述方法中，在步驟（a)中還包括陽性對(duì)照組，即在與所述實(shí) 驗(yàn)組條件相同且不存在所述待測(cè)物質(zhì)但存在已知治療胃癌藥物的情況下，培養(yǎng)相同的胃癌 細(xì)胞；
[0064] 并且，在步驟（b)中還包括將所述實(shí)驗(yàn)組中胃癌細(xì)胞的一種或多種miRNA的表達(dá) 水平，并與所述陽性對(duì)照組中胃癌細(xì)胞的miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較。
[0065] 本發(fā)明第九方面，提供了一種體外非診斷性的判斷細(xì)胞或組織是否為胃癌細(xì)胞或 組織的方法，包括步驟：測(cè)定所述的細(xì)胞或組織中本發(fā)明第一方面所述miRNA集合或組合 中miRNA的表達(dá)水平，當(dāng)所述的miRNA表達(dá)水平與正常組織或癌旁組織相比，具有顯著的差 異，則說明該細(xì)胞或組織是胃癌細(xì)胞或組織。
[0066] 本發(fā)明第十方面，提供了一種診斷胃癌樣本的方法，包括步驟：測(cè)定樣本中本發(fā)明 第一方面所述miRNA集合或組合中miRNA的表達(dá)水平，當(dāng)所述的miRNA表達(dá)水平與正常樣 本相比，具有顯著的差異，則說明該樣本為胃癌樣本。
[0067] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0068] 圖1顯示了通過SVM模型和留一法交叉驗(yàn)證法對(duì)12個(gè)選定的miRNA對(duì)胃癌區(qū)分：
[0069] 圖1A為通過SVM模型的方法得出基于留一法交叉檢驗(yàn)得出胃癌組與正常對(duì)照組 比較結(jié)果的R0C曲線圖，y軸表示靈敏性，X軸表示特異性，AUC = 0. 985 ;
[0070] 圖1B為留一法交叉驗(yàn)證結(jié)果基于SVM模型圖，y軸表示每個(gè)樣本的概率密度，X軸 表示SVM(支持向量機(jī)）算法之值，所有樣本（N = 61)，被分為兩部分，紅色為癌癥樣本包括 21種胃癌細(xì)胞系，綠色為對(duì)照正常組織，錯(cuò)誤率為4. 92% (61例樣品中錯(cuò)3個(gè)）。
[0071] 圖2顯示了通過SVM模型和留一法交叉驗(yàn)證法對(duì)9個(gè)選定的miRNA組合9A，對(duì)胃 癌區(qū)分：
[0072] 圖2A為通過SVM模型的方法得出基于留一法交叉檢驗(yàn)得出胃癌組與正常對(duì)照組 比較結(jié)果的R0C曲線圖，y軸表示靈敏性，X軸表示特異性，AUC = 0. 988 ;
[0073] 圖2B為留一法交叉驗(yàn)證結(jié)果基于SVM模型圖，y軸表示每個(gè)樣本的概率密度，X軸 表示SVM(支持向量機(jī)）算法之值，所有樣本（N = 61)，被分為兩部分，紅色為癌癥樣本包括 21種胃癌細(xì)胞系，綠色為對(duì)照正常組織，錯(cuò)誤率為6. 56% (61例樣品中錯(cuò)4個(gè)）。
[0074] 圖3顯示了通過SVM模型和留一法交叉驗(yàn)證法對(duì)9個(gè)選定的miRNA組合9B，對(duì)胃 癌區(qū)分：
[0075] 圖3A為通過SVM模型的方法得出基于留一法交叉檢驗(yàn)得出胃癌組與正常對(duì)照組 比較結(jié)果的R0C曲線圖，y軸表示靈敏性，X軸表示特異性，AUC = 0. 924 ;
[0076] 圖3B為留一法交叉驗(yàn)證結(jié)果基于SVM模型圖，y軸表示每個(gè)樣本的概率密度，X軸 表示SVM(支持向量機(jī)）算法之值，所有樣本（N = 61)，被分為兩部分，紅色為癌癥樣本包括 21種胃癌細(xì)胞系，綠色為對(duì)照正常組織，錯(cuò)誤率為13. 1 % (61例樣品中錯(cuò)8個(gè)）。
【具體實(shí)施方式】
[0077] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，通過對(duì)近兩千個(gè)miRNA初篩以及近800個(gè)與胃 癌相關(guān)的miRNA的進(jìn)一步篩選，首次篩選出數(shù)個(gè)特異性的miRNA，經(jīng)檢驗(yàn)證明，將這些特異 性的miRNA標(biāo)志物進(jìn)行一定的組合可非常有效地區(qū)分胃癌組織及癌旁組織。本發(fā)明提出了 miRNA組成的指紋圖譜在胃癌診斷中的應(yīng)用，而圍繞小RNA的表達(dá)可以通過熒光定量PCR反 應(yīng)檢測(cè)，提供在胃癌檢測(cè)中的應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0078] miRNA及其前體
[0079] 本發(fā)明提供了一組新的與胃癌相關(guān)的miRNA。如本文所用，所述的"miRNA"是指一 種RNA分子，從可形成miRNA前體的轉(zhuǎn)錄物加工而來。成熟的miRNA通常具有18-26個(gè)核 苷酸（nt)(更特別的約19-22nt)，也不排除具有其它數(shù)目核苷酸的miRNA分子。miRNA通 ?？杀籒orthern印跡檢測(cè)到。
[0080] 人來源的miRNA可被從人細(xì)胞中分離。如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始 環(huán)境中分離出來（如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài) 下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同 存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
[0081] miRNA 可從前體 miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而來，所述的前體 miRNA可折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)（發(fā)夾）結(jié)構(gòu)，所述的莖環(huán)結(jié)構(gòu)長度一般在50-100bp之間。 所述的前體miRNA可折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部兩側(cè)包含基本上互補(bǔ)的兩條 序列。所述的前體miRNA可以是天然的或是人工合成的。
[0082] 前體miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可與編碼基因的mRNA的至少一部 分序列基本上互補(bǔ)。如本文所用，"基本上互補(bǔ)"是指核苷酸的序列是足夠互補(bǔ)的，可以以一 種可預(yù)見的方式發(fā)生相互作用，如形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)）。通常，兩條"基本上互補(bǔ)" 的核苷酸序列互相之間至少有70%的核苷酸是互補(bǔ)的；優(yōu)選的，至少有80%的核苷酸是互 補(bǔ)的；更優(yōu)選的，至少有90%的核苷酸是互補(bǔ)的；進(jìn)一步優(yōu)選的，至少有95%的核苷酸是互 補(bǔ)的；如98%、99%或100%。一般地，兩條足夠互補(bǔ)的分子之間可以具有最多40個(gè)不匹配 的核苷酸；優(yōu)選的，具有最多30個(gè)不匹配的核苷酸；更優(yōu)選的，具有最多20個(gè)不匹配的核 苷酸；進(jìn)一步優(yōu)選的，具有最多10個(gè)不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11個(gè)不匹配的 核苷酸。
[0083] 如本文所用，"莖環(huán)"結(jié)構(gòu)也被稱作"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)，是指一種核苷酸分子，其可形成一 種包括雙鏈區(qū)域（莖部）的二級(jí)結(jié)構(gòu)，所述的雙鏈區(qū)域由該核苷酸分子的兩個(gè)區(qū)域（位于 同一分子上）形成，兩個(gè)區(qū)域分列雙鏈部分的兩側(cè)；其還包括至少一個(gè)"環(huán)"結(jié)構(gòu)，包括非互 補(bǔ)的核苷酸分子，即單鏈區(qū)域。即使該核苷酸分子的兩個(gè)區(qū)域不是完全互補(bǔ)的，核苷酸的雙 鏈部分也可保持雙鏈狀態(tài)。例如，插入、缺失、取代等可導(dǎo)致一個(gè)小區(qū)域的不互補(bǔ)或該小區(qū) 域自身形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或其它形式的二級(jí)結(jié)構(gòu)，然而，該兩個(gè)區(qū)域仍可基本上互補(bǔ)，并在可預(yù) 見的方式中發(fā)生相互作用，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈區(qū)域。莖環(huán)結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知 的，通常在獲得了一條具有一級(jí)結(jié)構(gòu)的核苷酸序列的核酸后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定該 核酸是否能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0084] 本發(fā)明所述的miRNA具有如SEQ ID Ν0:η所示的序列，其中η為選自1-12的正整 數(shù)。
[0085] 為了提高miRNA的穩(wěn)定性或其它性質(zhì)，還可在所述的miRNA的至少一端加上至少 一個(gè)保護(hù)性堿基，如" TT "等。
[0086] 在本文中，miRNA、miRN、小RNA、microRNA、miR具有相同的含義。
[0087] 對(duì)于本發(fā)明所揭示的胃癌特異性的miRNA，可以通過常規(guī)的miRNA芯片技術(shù)進(jìn)行 驗(yàn)證，例如包括用常規(guī)方法或常規(guī)試劑盒抽提miRNA，然后進(jìn)行檢測(cè)。代表性的試劑盒包括 (但并不限于）：Ambion公司的miRNAs抽提試劑盒抽提。
[0088] 此外，還可通過特異性擴(kuò)增并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物（或相應(yīng)的熒光信號(hào)等可檢測(cè)信號(hào)） 來檢測(cè)或驗(yàn)證本發(fā)明的胃癌特異性的miRNA。優(yōu)選的高靈敏度和高特異性的的技術(shù)包括 (但并不限于）：CN10267663A中所公開的技術(shù)。通常，所用引物的特異性結(jié)合區(qū)可根據(jù)所 需檢測(cè)的已知miRNA的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，優(yōu)選地?cái)U(kuò)增時(shí)所用引物的特異性結(jié)合區(qū)通常是與 miRNA完全互補(bǔ)的互補(bǔ)序列。
[0089] miRNA集合或組合
[0090] 本發(fā)明提供了一種miRNA的集合或組合，所述的miRNA集合或組合可用于制備區(qū) 分胃癌組織和癌旁組織的芯片或試劑盒。如本文所用，術(shù)語"miRNA集合或組合"、"miRNA指 紋圖譜"可互換使用，均指的是能夠特異地、靈敏地區(qū)分胃癌組織和正常組織（癌旁組織） 的miRNA的總和。
[0091] 在本發(fā)明中，所述的miRNA集合或組合含有SEQ ID N0. : 1-9所示的全部序列，優(yōu) 選地，還可以包括一種或多種選自SEQ ID NO. :10-12中所示的序列。通常，本發(fā)明miRNA集 合或組合除了含有SEQ ID N0. : 1-9所有的序列以外，還可以任意的含有SEQ ID NO. :10-12 中一種或多種序列從而構(gòu)成新的miRNA集合或組合。
[0092] 在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA集合或組合含有SEQ ID NO. :1-12所示的12個(gè)序 列。
[0093] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合含有9個(gè)小RNA (SEQ ID N0. : 1-9)組成 的小RNA指紋圖譜，用于區(qū)分胃癌組織和癌旁組織。
[0094] 在另一優(yōu)選例中，所述miRNA集合或組合有9個(gè)小RNA(SEQ ID N0. : 1-9、10-12) 組成的小RNA指紋圖譜，用于區(qū)分胃癌組織和癌旁組織。
[0095] 本發(fā)明SEQ ID NO. :1-12所示的序列如下：
[0096]

[0097] 其中，HSA-MIR-196a/b在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，而其他miRNA則在胃癌組織中下 調(diào)。
[0098] 應(yīng)理解，本發(fā)明的miRNA集合或組合可將SEQ ID N0. : 1-9所示的序列，較佳地SEQ ID NO. :1-12所示序列進(jìn)行任意地組合，優(yōu)選為含有SEQ ID NO. :1-2所示的序列，從而通過 本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)設(shè)計(jì)制備針對(duì)這些miRNA集合或組合的寡核苷酸探針，并制備成miRNA芯 片或試劑盒以區(qū)別胃癌和癌旁（正常）組織。
[0099] 此外，本發(fā)明miRNA集合或組合還可作為所述miRNA芯片或試劑盒的陽性對(duì)照，獨(dú) 立包裝或經(jīng)固相載體固定后作為對(duì)照。
[0100] 反義寡核苷酸
[0101] 根據(jù)本發(fā)明所提供的miRNA序列，可以設(shè)計(jì)出了它們的反義寡核苷酸，所述的反 義寡核苷酸可在體內(nèi)下調(diào)相應(yīng)的miRNA的表達(dá)。如本文所用，"反義寡核苷酸（antisense-ol igonucleotides，AS-〇ns或AS0) "又稱為"反義核苷酸"，是指長度約為18-26nt (更特別的 約19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其類似物。
[0102] 在本發(fā)明中，所述的"反義寡核苷酸"還包括采用如基于核酸鎖或核酸鏈骨架修飾 技術(shù)等手段獲得的經(jīng)修飾的反義核苷酸，所述的修飾基本不改變反義寡核苷酸的活性，更 佳地，所述修飾可提高反義寡核苷酸的穩(wěn)定性、活性或治療效果。核酸鎖（locked nucle ic acid，LNA)通常是指通過一個(gè)亞甲基橋?qū)⒑颂堑?'氧原子和4'碳原子連接起來的修飾技 術(shù)。LNA能延長miRNA的血清半衰期，提高對(duì)靶標(biāo)親和性，減少脫靶作用的范圍和程度?；?于核酸鏈骨架的修飾技術(shù)發(fā)展出的反義藥物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且 易于大量合成。寡核苷酸的骨架修飾方法有多種，包括硫代法，例如將脫氧核苷酸鏈硫代修 飾為硫代脫氧核苷酸鏈。該方法是將DNA骨架上的磷酸鍵的氧原子用硫原子替代，可抵抗 核酸酶降解。應(yīng)理解，任何能夠保持所述反義寡核苷酸的大部分或全部活性的修飾都包含 在本發(fā)明中。
[0103] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，對(duì)反義寡核苷酸進(jìn)行核酸鎖修飾；更佳地還進(jìn)行硫代修 飾。
[0104] 將本發(fā)明所述的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)后，它們能夠明顯下調(diào)相關(guān)miRNA的 表達(dá)。
[0105] 多核苷酸構(gòu)建物
[0106] 根據(jù)本發(fā)明所提供的人miRNA序列，可設(shè)計(jì)出在被導(dǎo)入后可被加工成可影響相應(yīng) 的mRNA表達(dá)的miRNA的多核苷酸構(gòu)建物，也即所述多核苷酸構(gòu)建物能夠在體內(nèi)上調(diào)相應(yīng) 的miRNA的量。因此，本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸（構(gòu)建物），所述的多核苷酸（構(gòu) 建物）可被人細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可被人細(xì)胞剪切且表達(dá)成所述的 miRNA〇
[0107] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的多核苷酸構(gòu)建物含有式I所示的結(jié)構(gòu)：
[0108] Seq正向-X-Seq反向式 I，
[0109] 式 I 中，
[0110] Seq正向?yàn)榭稍诩?xì)胞中表達(dá)成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向?yàn)榕cSeq正向基本 上互補(bǔ)的核苷酸序列；或者，3叫反自為可在細(xì)胞中表達(dá)成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正 向?yàn)榕cSeq正向基本上互補(bǔ)的核苷酸序列；
[0111] X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向 不互補(bǔ)；
[0112] 式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，形成式II所示的二級(jí)結(jié)構(gòu)：
[0113]
[0114] 式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述；
[0115] | |表不在Seq正向和Seq反向之間形成的喊基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系。
[0116] 通常，所述的多核苷酸構(gòu)建物位于表達(dá)載體上。因此，本發(fā)明還包括一種載體，它 含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體通常還含有啟動(dòng)子、復(fù)制起 點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。 這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的表達(dá)載體優(yōu)選地 包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如卡拉霉 素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。
[0117] 芯片
[0118] miRNA表達(dá)譜芯片通常含有多達(dá)幾百個(gè)探針，涵蓋多種miRNA，利用DNA雙鏈同源 互補(bǔ)的原理在全基因組水平上檢測(cè)樣本中所含各種miRNA的含量。因此，可在同一時(shí)間對(duì) 待測(cè)樣本中全基因組范圍內(nèi)的miRNA的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)。
[0119] 利用本發(fā)明所述的miRNA序列，還可以制備相應(yīng)的miRNA芯片，進(jìn)而研究其表達(dá)譜 以及miRNAs的調(diào)節(jié)方式。
[0120] 在另一方面，本發(fā)明還提供一種用于分析miRNA表達(dá)譜的芯片，所述的芯片可用 于區(qū)分胃癌和癌旁組織。
[0121] 本發(fā)明的所述的miRNA芯片包括：
[0122] 固相載體；以及
[0123] 有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對(duì)應(yīng) 于（互補(bǔ)或基本互補(bǔ)于）SEQ ID N0:1-9,較佳地還包括10-12所示的序列中的至少1種； 較佳地，所述的寡核苷酸探針至少特異性地對(duì)應(yīng)于（互補(bǔ)或基本互補(bǔ)于）SEQ ID NO. :1-12 所示的序列。
[0124] 具體地，可根據(jù)本發(fā)明所述的miRNA，設(shè)計(jì)出適合的探針，固定在固相載體上，形成 "寡核苷酸陣列"。所述的"寡核苷酸陣列"是指具有可尋址位置（即以區(qū)別性的，可訪問的 地址為特征的位置）的陣列，每個(gè)可尋址位置均含有一個(gè)與其相連的特征性寡核苷酸。根 據(jù)需要，可將寡核苷酸陣列分成多個(gè)亞陣。
[0125] 所述固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活 性基團(tuán)（如醛基、氨基等）修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。
[0126] 所述的miRNA芯片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法。例如， 如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷 酸探針配制成溶液，然后采用點(diǎn)樣儀將其點(diǎn)在修飾玻片或硅片上，排列成預(yù)定的序列或陣 列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修飾，則 其制備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊(cè)》;J. L. eris i，V. R. Iyer, P. 0. BROWN. Exploring the metabol ic and genetic control of gene express ion on a genomic scale. Science, 1997 ;278:680和馬立人，蔣中華主編·生物芯片·北 京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000,1-130。
[0127] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種通過miRNA芯片檢測(cè)人組織中miRNA表達(dá)譜的方 法，包括步驟：
[0128] (1)提供分離自人組織的RNA樣品，在所述的RNA上設(shè)置標(biāo)記物；
[0129] (2)將步驟（1)得到的RNA與所述的miRNA芯片接觸，使所述的RNA與固相載體上 的寡核苷酸探針發(fā)生雜交反應(yīng)，從而在固相載體上形成"寡核苷酸探針-RNA"二元復(fù)合物；
[0130] (3)檢測(cè)步驟（2)形成的二元復(fù)合物的標(biāo)記物，從而確定人組織中相應(yīng)的miRNA的 表達(dá)譜。
[0131] 從人組織中提取RNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，包括Trizol法。
[0132] 更優(yōu)選的，在步驟（1)中，在從人組織組織中分離出RNA樣品后，對(duì)RNA樣品進(jìn)行 適當(dāng)處理，以富集具有一定長度的RNA，所述長度一般在10-100之間（小片段RNA)。在經(jīng)過 上述處理后，利用這些小片段RNA進(jìn)行后續(xù)的雜交，這樣可提高芯片捕獲miRNA的準(zhǔn)確性。 本領(lǐng)域人員可方便地分離出具有一定片段長度的RNA，比如可采用凝膠電泳法來分離。
[0133] 對(duì)RNA進(jìn)行標(biāo)記也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，其可通過在雜交時(shí)加入與RNA 特異性結(jié)合的標(biāo)記物的方法實(shí)現(xiàn)，所述標(biāo)記物比如是標(biāo)記基團(tuán)。所述的標(biāo)記基團(tuán)包括但不 限于：地高辛分子（DIG)、生物素分子（Bio)、熒光素及其衍生生物分子（FITC等）、其它熒 光分子（如Cy3、Cy5等）、堿性磷酸酶（AP)、辣根過氧化物酶（HRP)等。這些標(biāo)記及其標(biāo)記 方法都已是本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)。
[0134] 將上述的RNA與miRNA芯片進(jìn)行雜交時(shí)，可以先將miRNA芯片與預(yù)雜交緩沖液進(jìn) 行預(yù)雜交。
[0135] 本發(fā)明所述的RNA與miRNA芯片之間的固相雜交按照本領(lǐng)域的經(jīng)典方法進(jìn)行，本 領(lǐng)域一般人員依據(jù)經(jīng)驗(yàn)容易確定有關(guān)緩沖液、探針和樣本濃度、預(yù)雜交溫度、雜交溫度以及 時(shí)間等的最適條件。或者也可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的。
[0136] 然后根據(jù)標(biāo)記信號(hào)在miRNA芯片上的位置、強(qiáng)度等信息獲取待測(cè)信息。若擴(kuò)增產(chǎn) 物用熒光基團(tuán)標(biāo)記，也可直接用熒光檢測(cè)設(shè)備（如激光共聚焦掃描儀Scanarray 3000等） 獲取待測(cè)信息。
[0137] 檢測(cè)試劑盒
[0138] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述的試劑盒中含有本發(fā)明的芯片。所述的試劑盒 可用于檢測(cè)miRNA的表達(dá)譜；或用于區(qū)分胃癌組織和癌旁（正常）組織。
[0139] 更優(yōu)選的，所述的試劑盒中還含有用于標(biāo)記RNA樣品的標(biāo)記物，以及與所述標(biāo)記 物相對(duì)應(yīng)的底物。
[0140] 此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取RNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑， 包括但不限于：抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、對(duì)照液、顯色液、洗液、抗體等。擴(kuò)增液中還可含 有焚光染料，如EvaGreen、SYBRGreen等。所述的試劑盒中還可包括引物。
[0141] 另外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。
[0142] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
[0143] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0144] (1)本發(fā)明提供了一類可用于區(qū)分胃癌組織和癌旁（正常）組織的新的miRNA指 紋圖譜；
[0145] (2)本發(fā)明的miRNA指紋圖譜，可非常有效地區(qū)分胃癌組織和癌旁（正常）組織， 靈敏度高、特異性強(qiáng)。
[0146] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0147] 實(shí)施例1樣本的收集和信息分析
[0148] 本研究樣品為2011年至2013年期間，長征醫(yī)院收集所得存檔的石蠟樣本。所有 樣品收集經(jīng)過個(gè)人同意，并根據(jù)醫(yī)院的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)協(xié)議，病理診斷結(jié)果經(jīng)兩名以上病 理醫(yī)師確認(rèn)。所有病例均為腺癌，腫瘤組織或粘膜組織占到樣本的85%以上。患者臨床資 料包括發(fā)病年齡、性別、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、組織分化和腫瘤?#分期（AJCC 第七版）等。
[0149] 共93個(gè)樣品參與了本實(shí)驗(yàn)，包括40例胃癌樣本，32例正常組織樣本，中位年齡 59.5歲，以及21例胃癌細(xì)胞系。樣本從病人身體中移除并存儲(chǔ)于-80°C。其中樣本被分為 兩大部分，第一部分為訓(xùn)練樣本，包括20例胃癌樣本，12例正常組織樣本，共計(jì)32例樣本； 第二部分為檢測(cè)樣本，包括20例胃癌樣本，20例正常組織樣本，以及21種胃癌細(xì)胞系樣本， 共計(jì)61例樣本。
[0150] 實(shí)施例2總RNA抽提
[0151] 從石蠟FFPE組織切取7-8片5微米或者4片10微米的組織碎片，去除組織周圍 多余石蠟。剩余的組織常溫保存。
[0152] 切取的碎片勾衆(zhòng)后，參照 Deparaffinization solution(Qiagen，19093)說明書 先對(duì)石錯(cuò)樣本進(jìn)行脫錯(cuò)；之后再參照miRNeasy FFPE kit(Qiagen，217504)說明書，抽提總 RNA〇
[0153] 電泳檢測(cè)質(zhì)量，用紫外分光光度法測(cè)定0D260nm和0D280nm，計(jì)算RNA濃度。-80°C 保存。
[0154] 實(shí)施例3加 PolyA尾并反轉(zhuǎn)錄
[0155] 將上述實(shí)施例2抽提得到的總RNA用含有0· 1 % Tween-20 (Sigma)的0· lxRNA儲(chǔ) 存緩沖液（Ambion、USA)稀釋成125ng/ul。
[0156] 用盛元公司生產(chǎn)的Sharpvue? miRNA cDNA合成盒（盛元公司產(chǎn)品編號(hào)： 9000004)為miRNA加上PolyA的尾，并且反轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體步驟為：將1. 5ml離心管置 于冰上，加入66微升濃度為125ng/ul的總RNA，33微升盛元公司生產(chǎn)的Sharpvue? miRNA cDNA合成反應(yīng)液I (盛元公司產(chǎn)品編號(hào)：9000005) 11微升盛元公司生產(chǎn)的Sharpvue'? miRNA cDNA合成反應(yīng)液II (盛元公司產(chǎn)品編號(hào)：9000006)，和去核酸酶的超純水至165微 升。總RNA量的終濃度為50ng/ul，輕柔混勻后分裝入3個(gè)0. 2ml的PCR管，每管50ul。 lOOOrpm離心10s后放入ABI9700PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序：37°C 15min，25°C 25min， 37°C 30min，85°C 5min，4°C 保持。
[0157] 取出PCR管，將3管RT產(chǎn)物合并，震蕩離心后_20°C保存或者直接用于qPCR反應(yīng)。
[0158] 實(shí)施例4熒光定量PCR檢測(cè)
[0159] 在15毫升的離心管中加入141微升實(shí)施例3得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10542微升 盛元公司生產(chǎn)的熒光定量PCR酶反應(yīng)液（盛元公司產(chǎn)品編號(hào)：9000008, Sharpvue? 2x Universal qPCR Master Mix High Rox)，4076微升去核酸酶超純水（盛元公司產(chǎn)品編號(hào)： 9000015)，輕柔混勻。
[0160] 將盛元公司生產(chǎn)的小RNA反應(yīng)模板，Sharpvue?Human miRNA Array-Avl. 0 (盛 元公司產(chǎn)品編號(hào)：1000002)，Sharpvue?Human miRNA Array-B vl.O(盛元公司產(chǎn)品編 號(hào)：1000003)，Sharpvue?Human miRNA Array-C vl.0(盛元公司產(chǎn)品編號(hào)：1000004)， Sharpvue?Human miRNA Array-D vl.0(盛元公司產(chǎn)品編號(hào)：1000005)，Sharpvue?Human miRNA Array-E vl.O (盛元公司產(chǎn)品編號(hào)：1000006)從-20°C冰箱中取出，待回復(fù)到室溫后 打開包裝袋，置于離心機(jī)上，2000g離心5min (Thermo、ST16R，轉(zhuǎn)頭型號(hào)：M-20)。共1888個(gè) 小RNA反應(yīng)液，每個(gè)反應(yīng)模板上有3對(duì)陽性對(duì)照和1個(gè)空白對(duì)照。小心解開封膜。
[0161] 將前述步驟得到的混合液倒入加樣槽中，使用12道連續(xù)移液器將混合液逐行分 別加入盛元公司生產(chǎn)的小RNA反應(yīng)模板中，每孔7ul。加樣完畢后檢查每個(gè)孔液體量是否均 〇
[0162] 使用定量封板膜（ABI，4711971)封板后顛倒混勻，室溫1000g離心5min。
[0163] 放入定量PCR儀中（ABI，7900Ht Fast)做定量PCR。程序?yàn)椋?5°C 2min，后運(yùn)行 96°〇58,60°(：11^11，3個(gè)循環(huán)；之后961€58,60 1€58,37個(gè)循環(huán)，溶解曲線。報(bào)告熒光設(shè)為 SYBR，參比熒光設(shè)為Rox。收集數(shù)據(jù)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
[0164] 實(shí)施例5miRNA生物統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的計(jì)算分析
[0165] 小RNA數(shù)據(jù)分析圖表通過使用R和Bioconductor軟件包進(jìn)行分析。在檢測(cè)的1888 個(gè)miRNA和兩個(gè)內(nèi)參對(duì)照（HSA-RNU6B和HSA-RNU48)，對(duì)1888種miRNA進(jìn)行進(jìn)一步的分析。 確定了檢測(cè)GC的miRNA panel (2塊384孔板包含758個(gè)miRNA和10個(gè)內(nèi)參）。發(fā)現(xiàn)在檢 測(cè)的72例石蠟組織樣本以及21例細(xì)胞系中，758個(gè)miRNA的Ct值均低于35。每個(gè)miRNA 的ct值和平均值被差減背景、歸一化。
[0166] 為了去除樣品中RNA加入量的差異，分位數(shù)-median函數(shù)的分析方法用于處理原 始的ct值（Sing等人；2005)，結(jié)果通過' arrayQual ityMetrics'進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過比 對(duì)去除腫瘤組織樣本（CZ-I 1-39號(hào)）和癌旁組織樣本（CZ-155N和CZ-428N)。
[0167] 因此，分析了 69例組織樣本和21例細(xì)胞系的miRNA表達(dá)。在隨后的統(tǒng)計(jì)分析，39 例腫瘤組織，30瘤旁脂肪組織和21例細(xì)胞系之間的miRNA比較，差異表達(dá)的miRNA通過使 用t檢驗(yàn)分析所得，倍數(shù)變化2以上的被稱為差異表達(dá)。
[0168] 差異表達(dá)的miRNA通過使用三種計(jì)算機(jī)算法：支持向量法（SVM, Bioconductor package "el071"），KNN算法（Bioconductor package "class"）和對(duì)角線線性判別分析 法（Bioconductor package "sfsmisc"），算法的性能采用留一交叉驗(yàn)證程序，對(duì)不同數(shù)量 的預(yù)測(cè)標(biāo)志物進(jìn)行初步評(píng)估。對(duì)每一組訓(xùn)練樣本中，miRNA基于胃癌組織和瘤旁組織比較 產(chǎn)生的t檢驗(yàn)值和p值進(jìn)行排名。前η的miRNA (η為2和35之間的閾值范圍）被用來構(gòu) 建基于對(duì)訓(xùn)練樣本的信息應(yīng)用得到其余的測(cè)試樣本的預(yù)算模型中。挑選FDR調(diào)整的ρ值低 于〇. 1，差異變化倍數(shù)變化大于2的miRNA。
[0169] miRNA的命名是根據(jù)miRBase Version 20的miRNA數(shù)據(jù)庫，在矛盾的情況下，遵循 miRNA數(shù)據(jù)庫。
[0170] 結(jié)果：12個(gè)miRNA組成的指紋圖譜被選為胃癌診斷的生物標(biāo)志物（表1)
[0171] 表 1
[0172]
[0173] 實(shí)施例6對(duì)所選定的12個(gè)miRNA進(jìn)行診斷特異性、靈敏度的驗(yàn)證
[0174] 對(duì)選定的12個(gè)miRNA用SVM的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，如圖1所示。列表中所選的 miRNA對(duì)所有的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，得到的R0C曲線，AUC為0. 985,所選擇的標(biāo)記物檢測(cè)胃癌組 織的靈敏度為97 %，特異性為90 %。
[0175] 實(shí)施例7從12個(gè)miRNA中進(jìn)一步挑選關(guān)鍵miRNA
[0176] 對(duì)實(shí)施例5中所選定的miRNA進(jìn)一步進(jìn)行排列組合，篩選和測(cè)試出特異性、靈敏度 均能達(dá)到臨床檢測(cè)水平的miRNA組合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將部分特異性miRNA進(jìn)行組合后，也能夠 較有效地診斷出胃癌組織，其中優(yōu)選的例子如下：
[0177] 7. 1當(dāng)選取SEQ ID N0. : 1-9所示的序列時(shí)，標(biāo)記為9A組，用SVM的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn) 行驗(yàn)證，如圖2所示。列表中所選的miRNA對(duì)所有的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，得到的R0C曲線，AUC為 0. 988,所選擇的標(biāo)記物檢測(cè)胃癌組織的靈敏度為95. 1 %，特異性為95 %。
[0178] 7. 2當(dāng)選取SEQ ID N0. : 1-6、10-12所示的序列時(shí)，標(biāo)記為9B組，用SVM的統(tǒng)計(jì)學(xué) 方法進(jìn)行驗(yàn)證，如圖3所示。列表中所選的miRNA對(duì)所有的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，得到的R0C曲線， AUC為0. 924,所選擇的標(biāo)記物檢測(cè)胃癌組織的靈敏度為95. 1 %，特異性為70 %。
[0179] 結(jié)論：當(dāng)選擇SEQ ID N0. : 1-9作為miRNA指紋圖譜的組合時(shí)，就能達(dá)到滿足臨床 要求的診斷特異性和靈敏度，而將指紋圖譜中miRNA的數(shù)量擴(kuò)大到12個(gè)時(shí)，則所獲得的特 異性和靈敏度更高?？梢姳景l(fā)明miRNA指紋圖譜能夠非常高效地區(qū)分胃癌組織和正常組織 (癌旁組織）。
[0180] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種miRNA集合或組合，其特征在于，所述的miRNA集合或組合包括： (a) SEQ ID NO. : 1-9所示的9個(gè)序列；或 化）與SEQ ID NO. : 1-9所示序列互補(bǔ)的9個(gè)互補(bǔ)序列；或 (C)來自（a)或化）的組合，且來自（a)的序列與來自化）的互補(bǔ)序列互相不為互補(bǔ)。2. 如權(quán)利要求1所述的miRNA集合或組合，其特征在于，所述的miRNA集合或組合還包 括： (al) -種或多種選自SEQ ID NO. :10-12所示的序列；或 化1) 一種或多種選自與SEQ ID NO. :10-12所示序列互補(bǔ)的互補(bǔ)序列；或 (c2)來自（al)或化1)的組合，且來自（al)的序列與來自化1)的互補(bǔ)序列互相不為 互補(bǔ)。3. 如權(quán)利要求1所述的miRNA集合或組合，其特征在于，所述的miRNA集合或組合包 括： a)序列如SEQ ID NO: 1-12所示的12個(gè)序列；或 (i U與SEQ ID NO: 1-12所示序列互補(bǔ)的12個(gè)序列。4. 一種分離的或人工構(gòu)建的前體miRNA集合或組合，其特征在于，所述的前體miRNA集 合或組合中的前體miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)剪切并表達(dá)成權(quán)利要求1所述的miRNA集合或組合 中的miRNA。5. -種分離的多核巧酸集合或組合，其特征在于，所述的多核巧酸集合或組合中的多 核巧酸能被人細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA,所述的前體miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切且表達(dá)成權(quán) 利要求1所述miRNA集合或組合中的miRNA ; 較佳地，所述的多核巧酸具有式I所示的結(jié)構(gòu)： Seq正向-X-Seq反向 式I， 式I中， Seq正向?yàn)槟茉谌思?xì)胞中表達(dá)成所述的miRNA的核巧酸序列， Seq反向?yàn)榕cSeq正向基本上互補(bǔ)或完全互補(bǔ)的核巧酸序列； X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反 向不互補(bǔ)， 并且式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入人細(xì)胞后，形成式II所示的二級(jí)結(jié)構(gòu)：式H， 式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述， I表示在Seq正向和Seq反向之間形成的堿基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系。6. -種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的miRNA集合或組合，或權(quán)利要求5 所述的多核巧酸集合或組合。7. -種miRNA忍片，所述的miRNA忍片包括： 固相載體；W及 有序固定在所述固相載體上的寡核巧酸探針，所述的寡核巧酸探針特異性地對(duì)應(yīng)于 沈Q ID NO: 1-9所示全部序列。8. 權(quán)利要求1所述miRNA集合或組合、和/或權(quán)利要求7所述miRNA忍片的用途，其特 征在于，用于制備區(qū)分胃癌組織和癌旁組織的忍片或試劑盒。9. 提供了一種試劑盒，所述的試劑盒中含有權(quán)利要求7所述的miRNA忍片和/或用于 權(quán)利要求1所述miRNA集合或組合的檢測(cè)試劑。10. -種篩選治療胃癌候選藥物的方法，所述方法包括W下步驟： (a)在實(shí)驗(yàn)組中，在待測(cè)物質(zhì)存在下培養(yǎng)胃癌細(xì)胞；并且在對(duì)照組中，在與所述實(shí)驗(yàn)組 條件相同但不存在所述待測(cè)物質(zhì)的情況下培養(yǎng)相同的胃癌細(xì)胞； 化）測(cè)定所述實(shí)驗(yàn)組中胃癌細(xì)胞的miRNA的表達(dá)水平，并與對(duì)照組中胃癌細(xì)胞的miRNA 的表達(dá)水平進(jìn)行比較； 其中，如果與所述對(duì)照組相比，所述實(shí)驗(yàn)組中的所述miRNA的表達(dá)水平發(fā)生了趨向于 癌旁組織細(xì)胞的表達(dá)水平的變化，則表明所述待測(cè)物質(zhì)是抗胃癌的候選藥物。11. 一種體外非診斷性的判斷細(xì)胞或組織是否為胃癌細(xì)胞或組織的方法，其特征在于， 包括步驟：測(cè)定所述的細(xì)胞或組織中權(quán)利要求1所述miRNA集合或組合中miRNA的表達(dá)水 平，當(dāng)所述的miRNA表達(dá)水平與正常組織或癌旁組織相比，具有顯著的差異，則說明該細(xì)胞 或組織是胃癌細(xì)胞或組織。
【文檔編號(hào)】C40B40/06GK105985955SQ201510053868
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月2日
【發(fā)明人】譚若穎, 朱苗駿, 于觀貞, 王杰軍
【申請(qǐng)人】上海盛元生物技術(shù)有限公司, 常州盛達(dá)生物技術(shù)有限公司