先天性甲狀腺功能減低癥多基因測(cè)序引物及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種先天性甲狀腺功能減低癥多基因測(cè)序引物及檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)和臨床檢驗(yàn)學(xué)領(lǐng)域。一組檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因PCR引物序列，由Pax-8基因PCR引物序列、TG基因PCR引物序列、IYD基因PCR引物序列、DUOX2基因PCR引物序列、NIS基因PCR引物序列、TSHR基因PCR引物序列和TPO基因PCR引物序列中的一種或多種引物序列組成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：利用新一代測(cè)序?qū)σ鹣忍煨约谞钕俟δ軠p低癥的多致病基因同時(shí)檢測(cè)，耗費(fèi)時(shí)間少、檢測(cè)效率高、成本低、靈敏度和特異度均較高，可以快速、全面實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床患者基因突變檢測(cè)及疾病分類。
【專利說(shuō)明】先天性甲狀腺功能減低癥多基因測(cè)序引物及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種先天性甲狀腺功能減低癥多基因測(cè)序引物及檢測(cè)方法，特別涉及 先天性甲狀腺功能減低癥（簡(jiǎn)稱先天性甲低，Congenital hypothyroidism, CH)多基因測(cè) 序檢測(cè)分析方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域和臨床檢驗(yàn)學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 先天性甲狀腺功能減低癥（簡(jiǎn)稱先天性甲低，Congenital hypothyroidism, CH) 是導(dǎo)致新生兒智力和體格發(fā)育障礙的最常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病之一，其患病率在不同地域、不 同種族、以及不同環(huán)境均可存在差異。CH患病率在全國(guó)平均水平為1/2050,而在廣西患病 率可達(dá)1/835,早期診斷和治療是降低疾病危害的主要措施。
[0003] 目前CH的診斷主要分為一般性診斷和甲狀腺核素掃描診斷。一般性診斷主要是 通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定血液TSH、FT3、FT4濃度水平，確定甲狀腺功能低下的程度和性質(zhì)。病因?qū)W診 斷，主要包括放射性核素甲狀腺掃描，以明確甲狀腺的發(fā)生、發(fā)育及功能情況。前者的影響 因素較多，靈敏度和特異度均有待于提高，且不能對(duì)疾病進(jìn)行分型，而甲狀腺核素掃描僅對(duì) 有形態(tài)學(xué)改變的永久性CH診斷有效。
[0004] 核酸測(cè)序通過(guò)對(duì)目的基因片段進(jìn)行DNA序列檢測(cè)，從而得到目的基因 DNA序列信 息，是現(xiàn)代分子生物學(xué)中應(yīng)用廣泛的一項(xiàng)重要技術(shù)，長(zhǎng)久以來(lái)廣泛應(yīng)用于基因突變檢測(cè)以 及基因分型等領(lǐng)域。一代測(cè)序又稱為"Sanger測(cè)序"，由于結(jié)果直觀，因此是DNA測(cè)序的 "金標(biāo)準(zhǔn)"，但因其成本高，通量過(guò)低，手工操作時(shí)間長(zhǎng)，只能對(duì)基因進(jìn)行單獨(dú)監(jiān)測(cè)檢測(cè)，對(duì)多 基因引起的疾病臨床應(yīng)用存在困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有CH檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一組能對(duì)導(dǎo)致先天性 甲狀腺功能減低癥的多基因進(jìn)行快速、全面檢測(cè)的、且適用于臨床患者基因突變檢測(cè)及疾 病分類的多基因測(cè)序引物。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種結(jié)果準(zhǔn)確、通量高、時(shí)的間短、成本低能同時(shí)檢測(cè) 先天性甲狀腺功能減低癥的多個(gè)候選基因的檢測(cè)方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] -組檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因 PCR引物序列，由Pax-8基因 PCR引 物序列、TG基因 PCR引物序列、IYD基因 PCR引物序列、DU0X2基因 PCR引物序列、NIS基因 PCR引物序列、TSHR基因 PCR引物序列和ΤΡ0基因 PCR引物序列中的一種或多種引物序列 組成。
[0009] 所述Pax-8基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 1-SEQ ID No. 12所示的核苷 酸序列。
[0010] 所述TG基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 13-SEQ ID No. 72所示的核苷酸 序列。
[0011] 所述IYD基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 73 - SEQ ID No. 82所示的核苷 酸序列。
[0012] 所述DU0X2基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 83-SEQ ID No. 100所示的核 苷酸序列。
[0013] 所述NIS基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 101 - SEQ ID No. 118所示的核 苷酸序列。
[0014] 所述TSHR基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 119-SEQ ID No. 136所示的核 苷酸序列。
[0015] 所述ΤΡ0基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 137 - SEQ ID No. 166所示的核 苷酸序列。
[0016] 本發(fā)明主要利用oligo 6. 0軟件設(shè)計(jì)DU0X2、TG、TSHR等七種CH相關(guān)基因共139 個(gè)外顯子的PCR擴(kuò)增引物（表1)，根據(jù)外顯子相距遠(yuǎn)近程度，合并部份外顯子共同設(shè)計(jì)引 物，共計(jì)83對(duì)引物。引物設(shè)計(jì)遵循如下幾個(gè)原則：引物的長(zhǎng)度范圍在19-23bp適宜；引物應(yīng) 無(wú)二聚體，尤其是3'端二聚體形成的可能性；無(wú)發(fā)夾結(jié)構(gòu)；上下游引物Tm值相差不宜超過(guò) 5°C;GC含量以45-55%為宜。當(dāng)上下游引物確定以后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用Blast對(duì)上游 和下游引物進(jìn)行比對(duì)分析，確保引物的特異性及擴(kuò)增效率。與目前illumina、安捷倫以及羅 氏公司的捕獲技術(shù)獲得150_400bp片段相比，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度平均在1. 5kb左右，通過(guò)PCR長(zhǎng) 片段擴(kuò)增，可以對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行有效地捕獲。
[0017] 表1 :本發(fā)明多基因 PCR引物序列
[0018]

【權(quán)利要求】
1. 一組檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因 PCR引物序列，其特征在于：由Pax-8 基因 PCR引物序列、TG基因 PCR引物序列、IYD基因 PCR引物序列、DU0X2基因 PCR引物序 列、NIS基因 PCR引物序列、TSHR基因 PCR引物序列和TPO基因 PCR引物序列中的一種或多 種引物序列組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因 PCR引物序列，其特 征在于：所述Pax-8基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 1 - SEQ ID No. 12所示的核苷 酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因 PCR引物序列，其特 征在于：所述TG基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 13 - SEQ ID No. 72所示的核苷酸 序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因 PCR引物序列，其特 征在于：所述IYD基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 73-SEQ ID No. 82所示的核苷酸 序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因 PCR引物序列，其特 征在于：所述DU0X2基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 83 - SEQ ID No. 100所示的核 苷酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因 PCR引物序列，其特 征在于：所述NIS基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 101-SEQ ID No. 118所示的核苷 酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因 PCR引物序列，其特 征在于：所述TSHR基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 119 - SEQ ID No. 136所示的核 苷酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因 PCR引物序列，其特 征在于：所述TP0基因 PCR引物序列為序列表SEQ ID No. 137-SEQ ID No. 166所示的核苷 酸序列。
9. 一種檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因測(cè)序檢測(cè)方法，其特征在于：采用新一 代測(cè)序?qū)H多個(gè)致病基因和相關(guān)基因同時(shí)進(jìn)行突變檢測(cè)；所述CH多個(gè)致病基因?yàn)镻ax-8 基因、TG基因、IYD基因、DU0X2基因、NIS基因、TSHR基因和TPO基因中的一種或多種。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種檢測(cè)先天性甲狀腺功能減低癥的多基因測(cè)序檢測(cè)方 法，其特征在于所述方法包括以下步驟： (1) 設(shè)計(jì)多基因 PCR引物序列：為序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 166中的一種或 多種； (2) 提取DNA樣本：用常規(guī)方法提取測(cè)試者的DNA樣本； (3) 擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域：利用TAKARA高保真酶，按照25μ1體系，利用美國(guó)AB Veriti梯度 PCR儀，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，其中各基因外顯子PCR擴(kuò)增的熱循環(huán)條件如下： 95? 預(yù)變性 5min ;95°C，30sec，6(TC，30sec，72°C，2min30sec ;30 個(gè)循環(huán)，72? 延伸 10min ； (4) PCR產(chǎn)物純化：所有產(chǎn)物均取2. 5 μ 1進(jìn)行電泳鑒定；所有剩余PCR產(chǎn)物均采用美國(guó) Omega公司過(guò)柱試劑盒進(jìn)行純化回收； (5) 文庫(kù)的制備：攜帶測(cè)序引物片段的轉(zhuǎn)座子，隨機(jī)打斷上述步驟的擴(kuò)增產(chǎn)物（擴(kuò)增 子），并將測(cè)序引物片段連接于片段化的擴(kuò)增子（長(zhǎng)度約為300bp)的兩端進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè) 序引物由標(biāo)簽序列、P5/P7序列等組成，得到可用于測(cè)序的DNA片段； (6) miseq測(cè)序：利用MiSeq Reagent Kit(300 cycles PE)試劑盒測(cè)序，稀釋文庫(kù)并使 其變性，制備所需的預(yù)填充試劑盒，將文庫(kù)混合液裝到指定槽的試劑盒中，設(shè)置實(shí)驗(yàn)步驟并 檢查各運(yùn)行參數(shù)，選擇Sequence開(kāi)始運(yùn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后查看測(cè)序結(jié)果； (7) 生物信息學(xué)分析 首先對(duì)新一代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括剪除3'端質(zhì)量值低于20的序列、去除平均 質(zhì)量值低于20的序列；然后使用bwa將質(zhì)控后的序列比對(duì)到參考基因組序列上（版本號(hào) hgl9)，利用GATK工具判讀SNP和Indel位點(diǎn)；利用SNPnexus工具注釋SNP，找到可能性的 功能性位點(diǎn)，最后利用dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、HGMD等數(shù)據(jù)庫(kù)，過(guò)濾人群中存在的多態(tài) 性位點(diǎn)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104120186SQ201410383359
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】陳少科, 顧學(xué)范, 陳榮譽(yù), 付春云, 羅靜思, 范歆, 李川 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院