一種mthfr、mtrr和rfc1基因多態(tài)性檢測引物組合物、試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及一種多重基因檢測試劑盒及其應(yīng)用，尤其是涉及一種MTHFR、MTRR和RFC1基因多態(tài)性檢測試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]葉酸屬B族維生素，是合成核酸所必須的元素，是細(xì)胞生長和組織修復(fù)所必需的物 質(zhì)，更是胚胎發(fā)育過程中不可缺少的營養(yǎng)素。近年來大量研究已經(jīng)證實(shí)，葉酸缺乏是導(dǎo)致出 生缺陷的主要原因。葉酸的臨床功能除了預(yù)防胎兒神經(jīng)管缺陷外，還能降低孕婦妊娠高血 壓、自發(fā)性流產(chǎn)和胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、早產(chǎn)以及新生兒低出生體重等發(fā)病率。
[0003]而中國是世界上出生缺陷的高發(fā)國家之一，每年的出生缺陷兒數(shù)量約占全世界的 20%。近年來大量研究已經(jīng)證實(shí)，孕婦葉酸缺乏是導(dǎo)致出生缺陷的主要原因之一。懷孕時(shí)補(bǔ) 充葉酸除了能預(yù)防胎兒神經(jīng)管缺陷外，還能降低孕婦妊娠高血壓、自發(fā)性流產(chǎn)和胎兒宮內(nèi) 發(fā)育遲緩、早產(chǎn)以及新生兒低出生體重等的發(fā)病率。另外，男性的葉酸攝入不足，機(jī)體葉酸 水平偏低，會引起兩方面的不良后果:一是精子密度低、活性下降、勃起功能減弱，二是精液 中攜帶的染色體數(shù)量異常(過多或過少，即精子中出現(xiàn)"非整倍體"），導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)或新生 兒唐氏綜合癥發(fā)生。因而，男性在妻子懷孕之前和女性懷孕期間保持足夠的葉酸水平，對胎 兒的健康發(fā)育有重要影響。科學(xué)研究證實(shí)，與甲基類維生素(葉酸及維生素B12)代謝密切相 關(guān)的是MTHFR、MTRR和RFC1基因的4個SNP(單核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)，基因突變時(shí)其編碼的葉酸 代謝關(guān)鍵酶活性降低，葉酸代謝障礙，導(dǎo)致神經(jīng)管畸形、先天性心臟病、唇腭裂等出生缺陷 發(fā)生。
[0004]現(xiàn)有的用于單核苷酸多態(tài)性（SNP)檢測方法主要為基因芯片、熒光定量PCR及 Sanger測序法。
[0005] (1 )qPCR檢測方法:采用熒光淬滅及雙末端標(biāo)記技術(shù)，針對SNP位點(diǎn)變異設(shè)計(jì)特異 性的探針。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)。其缺點(diǎn)是（1)通量低:不適宜多SNP位點(diǎn)的檢測;難 以設(shè)置內(nèi)控基因。（2)成本較高:探針標(biāo)記成本高;若需獲得所有相關(guān)SNP信息，需進(jìn)行多個 檢測試驗(yàn)，疊加成本更加昂貴。
[0006] (2)基因芯片法:基因芯片是通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計(jì)、乃至百萬計(jì)的特定序 列的DNA片段(基因探針），有規(guī)律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個二維DNA 探針陣列，利用這類芯片與標(biāo)記的生物樣品進(jìn)行雜交，可對樣品的基因表達(dá)譜生物信息進(jìn) 行快速定性和定量分析。DNA芯片：由于高通量等優(yōu)點(diǎn)在SNP檢測中得到大量應(yīng)用，依靠野生 型與突變型基因雜交動力學(xué)的差異對突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測。其優(yōu)點(diǎn)是：（1)高通量并行檢測； (2)操作簡便快速:整個檢測只需4-8小時(shí)基本可以出結(jié)果。缺點(diǎn)：1)不同SNP位點(diǎn)之間的雜 交動力學(xué)差異不同，在進(jìn)行多位點(diǎn)同時(shí)檢測時(shí)條件難以控制；2)技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜:每個 樣品需要一個芯片，成本大于Y1000/樣品，不利于大規(guī)模推廣;探針的合成與固定比較復(fù) 雜，特別是制作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟;3)重復(fù)性差，準(zhǔn)確性低，易出現(xiàn)假陽 性假陰性結(jié)果;4)靈敏度較低:芯片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴(kuò)增，由于引物較 多，容易自身產(chǎn)生二聚體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或由于Tm值不同，而導(dǎo)致擴(kuò)增目的片段效率不同，進(jìn)而 影響檢測的靈敏度;5)由于芯片的種類較多，難以制定一個統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
[0007] (3)Sanger(雙脫氧鏈終止法)測序法：Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開 始，隨機(jī)在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲 得可見的DNA堿基序列。其優(yōu)點(diǎn)是SNP分析金標(biāo)準(zhǔn)，能發(fā)現(xiàn)已知SNP，也能發(fā)現(xiàn)未知SNP。缺點(diǎn) 是每個樣本的每個位點(diǎn)均需要經(jīng)PCR擴(kuò)增，跑膠，然后切膠純化，再測序。步驟多而分散，成 本較高，工作量大，周期長，多個SNP位點(diǎn)檢測累計(jì)價(jià)格相對昂貴。
[0008]本發(fā)明的多重SNP位點(diǎn)檢測方法基于多重PCR和毛細(xì)管電泳(CE)分離技術(shù)。采用多 重PCR方法，在同一個反應(yīng)管中同時(shí)加入2 1對特異性基因擴(kuò)增引物及反應(yīng)內(nèi)參引物，根據(jù) 基因擴(kuò)增片段的大小用毛細(xì)管電泳分離分析多個SNP位點(diǎn)及基因型，能快速有效地檢測多 個SNP位點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)方法存在的缺陷，具有以下優(yōu)勢：
[0009] 1、高通量:本系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)單個反應(yīng)檢測30-40個位點(diǎn)。
[0010]2、準(zhǔn)確性強(qiáng):采用CE對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，可將非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體和 特異性擴(kuò)增產(chǎn)物分離，最大程度降低假陽性；
[0011] 3、敏感性高，結(jié)果重復(fù)性好:本系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增方法的不均等擴(kuò)增造成的 偏差，提高了對一套目的基因進(jìn)行定性的速度和敏感性，采用激光誘導(dǎo)熒光-PMT，具有超高 靈敏度；
[0012] 4、方法簡便，使用經(jīng)濟(jì):本發(fā)明提供從試劑、多重PCR引物設(shè)計(jì)、結(jié)果分析等全套實(shí) 驗(yàn)方案;每個樣品的檢測成本少于Y50，利于大規(guī)模推廣；
[0013] 5、靈活性強(qiáng):可隨時(shí)根據(jù)需求調(diào)整檢測的靶基因。
[0014] 6、易于實(shí)現(xiàn)自動化。
[0015]目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于基于多重PCR和CE分離的多重SNP檢測指導(dǎo)葉酸用藥的試 劑盒及其檢測方法的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、通量高、可靠性強(qiáng)、 成本低、無假陰性結(jié)果的基于多重SNP檢測系統(tǒng)的MTHFR(rsl801131和rsl801133)、MTRR (rsl801394)和RFCl(rsl051266)基因多態(tài)性檢測引物組合物。
[0017] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題還在于，提供包含上述引物組合物的MTHFR、MTRR和RFC1基 因多態(tài)性檢測試劑盒、及該試劑盒的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：
[0019] -種MTHFR、MTRR和RFC1基因多態(tài)性檢測引物組合物，所述的引物組合物包括以下MTHFR、MTRR和RFC1基因上的4個SNP位點(diǎn)上的不同基因型的正反向擴(kuò)增引物，其基因序列如 下表，表1所示：
[0020] 表 1
[0021]
[0022]其中，A/C表示該SNP位點(diǎn)有兩種可能基因型A或C，兩條反向引物分別指檢測該SNP位點(diǎn)相應(yīng)基因型A或基因型C的引物，在檢測該SNP位點(diǎn)時(shí)兩條引物要同時(shí)加到反應(yīng)液中，C/ T表示該SNP位點(diǎn)有兩種可能基因型C或T; A/G表示該SNP位點(diǎn)有兩種可能基因型C或T。
[0023]上述MTHFR基因上rsl801131片段的A型基因的反向擴(kuò)增引物與C型基因的反向擴(kuò) 增引物均采用核酸序列SEQID勵.3:6664了64六〇^666了〇：〇^(：;]?1'冊1?基因上^1801133片 段的C型基因的反向擴(kuò)增引物與T型基因的反向擴(kuò)增引物均采用核酸序列SEQIDN0.6: GGCTCTCCTGGGCCCCTCAC; MTRR基因上rs 1801394片段的A型基因的反向擴(kuò)增引物與G型基因 的反向擴(kuò)增引物均采用核酸序列SEQIDN0.9:AACAAACACATTTCTGTTAAAA;RFC1基因上 rsl051266片段的A型基因的反向擴(kuò)增引物與G型基因的反向擴(kuò)增引物均采用核酸序列SEQ IDNO.12:TATTCCAGACGCTGCTCCCC。
[0024] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的一種MTHFR、MTRR和RFC 1基因多態(tài)性檢測引物組合物，還 包括DNA內(nèi)參的正反向擴(kuò)增引物和反應(yīng)內(nèi)參的正反向擴(kuò)增引物，其基因序列如下表表2所 示：
[0025]表2
[0026]
[0027]本發(fā)明所述包括上述引物組合物的MTHFR、MTRR和RFC1基因多態(tài)性檢測試劑盒，還 包括超純水(ddH20)、X溶液、10XPCR緩沖液，25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品；所 述的X溶液包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物。
[0028]所述的X溶液包括三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和通用引物和1個質(zhì)粒pcDNA3.1( +)，所述的通用引物正向擴(kuò)增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA，如SEQ ID NO. 21所示;反向擴(kuò) 增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，如SEQ ID N0.22所示;所述的通用引物正向擴(kuò)增引物 帶熒光標(biāo)記。
[0029]所述的陽性對照品為克隆到載體PMD18-T上的11個DNA片段。所述的11個DNA片段 分別為包含有SNP位點(diǎn)上rsl801131的A型基因和C型基因、rsl801133的C型基因和T型基因、 rs1801394的A型基因和G型基因、rs1051266的A型基因和G型基因及人類基因NCAM2、 ARHGEF7 和RNaseP的片段。
[0030]一種利用MTHFR、MTRR和RFC1基因多態(tài)性檢測試劑盒的使用方法，具體包括以下步 驟：
[0031] (1 )DNA樣品的收集和提取
[0032]將刮取到口腔上皮細(xì)胞的口腔拭子放入300yL DNA裂解緩沖液中，在恒溫混勻儀 中于95°C，lOOOrpm的條件下，處理5分鐘后取出，室溫放置至冷卻，然后在樣品中加入30yL 提取緩沖液，混勻，12000g離心5分鐘，得到的上清液即為PCR的DNA樣品模板；
[0033] (2)以提取的核酸為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)
[0034]取DNA樣品2yL，10 X PCR緩沖液2yL，25mM的氯化鎂3.4yL，PCR引物溶液2yL，DNA聚 合酶2yL，X溶液2yL，超純水6.6yL混勻后加入到96孔樣品板上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:42°C 5分鐘，95°C 3分鐘，94°C 30秒鐘，60°C 30秒鐘，70°C 1分鐘，3到5步循環(huán)35次;72°C3分鐘； 4°C直至收取PCR產(chǎn)物；其中所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和通用引物和1 個質(zhì)粒pcDNA3.1 ( + )，所述的通用引物正向擴(kuò)增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA;反向擴(kuò)增 引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向擴(kuò)增引物帶熒光標(biāo)記;PCR引物溶 液中各PCR引物濃度均為200nM，所述的PCR引物包括以下3個與葉酸代謝基因上的4個SNP位 點(diǎn)上的不同基因型的正反向擴(kuò)增引物、DNA內(nèi)參的正反向擴(kuò)增引物及反應(yīng)內(nèi)參的正反向擴(kuò) 增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO. 1~N0.20所示；
[0035](3)GeXP遺傳分析儀毛細(xì)電泳分離樣品
[0036] 取PCR產(chǎn)物0.1-lyL，上樣緩沖液38.75yL，DNAMarker0.5yL，礦物油一滴混合均 勻后加入到96孔分離液板上進(jìn)行毛細(xì)電泳分離樣品，將遺傳分析儀的軟件獲得的圖譜與標(biāo) 準(zhǔn)圖譜對比，獲得與葉酸代謝基因相關(guān)的SNP位點(diǎn)的等位基因型。
[0037]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明是一種MTHFR、MTRR和RFC1基因多態(tài) 性檢測試劑盒及其檢測方法及其檢測方法，本試劑盒及檢測方法基于多重PCR和毛細(xì)電泳 技術(shù)，利用不同長度的PCR特異性擴(kuò)增片段來鑒定區(qū)分不同的基因，創(chuàng)立了一種同步檢測 MTHFR、MTRR和RFC1三個基因的四個SNP位點(diǎn)上的不同基因型的檢測方案，以指導(dǎo)葉酸的合 理補(bǔ)充劑量，本方法優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，對待測DNA樣品進(jìn)行特異性擴(kuò)增，再用毛細(xì)電泳 方法分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以鑒別不同的基因和基因型，其一天之內(nèi)可完成192個患者樣品的檢 測，既節(jié)約了生產(chǎn)成本和檢測成本，又提高了檢測效率及縮短了時(shí)間；反應(yīng)內(nèi)參的使用可用 于監(jiān)測整個反應(yīng)系統(tǒng)、PCR反應(yīng)的效率，避免假陰性。
[0038] 綜上所述，本發(fā)明是基于GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)的MTHFR、MTRR和RF