一種通用弧菌電感受態(tài)細胞制備及電轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通用弧菌電感受態(tài)細胞制備及電轉(zhuǎn)化方法。它是將弧菌接種至腦心浸液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取菌液，離心收集菌體，菌體用洗滌緩沖液洗滌，離心收集菌體，如此用洗滌緩沖液洗滌若干次，收集的菌體重懸于洗滌緩沖液中，由此得到弧菌電感受態(tài)細胞；所述的洗滌緩沖液含有：133-266mM蔗糖、1-5mM?4-羥乙基哌嗪乙磺，溶劑為水。利用本發(fā)明的方法能夠成功的獲得弧菌電感受態(tài)細胞，獲得的感受態(tài)細胞按照本發(fā)明的電轉(zhuǎn)化方法能夠成功的將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入弧菌細胞中，從而實現(xiàn)了將各種遺傳資料轉(zhuǎn)入弧菌細胞中，為對弧菌致病機理的探索提供了成熟、便捷的遺傳操作技術(shù)。
【專利說明】-種通用弧菌電感受態(tài)細胞制備及電轉(zhuǎn)化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于細菌分子遺傳學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種通用弧菌電感受態(tài)細胞制備 及電
[0002] 轉(zhuǎn)化方法。

【背景技術(shù)】：
[0003] 弧菌是海洋環(huán)境中最為常見的異養(yǎng)細菌，至少有12種弧菌可引起人類致病，其中 霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌對人類健康危害最為嚴重。此外不少種類的弧菌也是水產(chǎn) 經(jīng)濟動物病原，其引發(fā)的弧菌病導(dǎo)致大量養(yǎng)殖經(jīng)濟損失。盡管很早已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了霍亂弧菌和 副溶血弧菌關(guān)鍵致病基因，科學(xué)家對弧菌致病機理的認識仍然嚴重滯后于腸桿菌科的致病 菌，缺乏成熟、便捷的遺傳操作技術(shù)是弧菌分子致病機理研究的主要障礙。腸桿菌科細菌分 子遺傳研究中應(yīng)用廣泛的技術(shù)包括：電轉(zhuǎn)化、依賴于宿主recA的廣泛同源重組系統(tǒng)、依賴 于噬菌體來源的λ重組系統(tǒng)、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0004] 電轉(zhuǎn)化技術(shù)是將各種遺傳材料通過瞬間高壓電擊的方式導(dǎo)入到組織或細胞中，它 是進行同源重組操作的基礎(chǔ)。對于腸科菌科的細菌而言，其電轉(zhuǎn)化條件已經(jīng)十分成熟，但 是其電轉(zhuǎn)化方法完全不能應(yīng)用于弧菌的電轉(zhuǎn)化操作中。存在的最大問題是：（1)弧菌在常 規(guī)的培養(yǎng)條件下，不能耐受高壓電擊，即使某些弧菌能夠耐受高電壓沖擊，恢復(fù)生長十分緩 慢，錯過了遺傳物質(zhì)重組的最佳時期；(2)電轉(zhuǎn)化中要求細胞懸液中不能存在較多的離子， 否則就會形成電弧，造成電擊失敗，大腸桿菌等腸科菌的電轉(zhuǎn)化常用去離子水對細胞進行 洗滌，但是弧菌生活在嗜鹽環(huán)境中，弧菌電感受態(tài)細胞置于去離子水環(huán)境中，細胞很快破裂 死亡；（3)常規(guī)用于大腸桿菌電轉(zhuǎn)化的電壓會引起某些弧菌死亡；（4)電轉(zhuǎn)化后，在常規(guī)的 LB培養(yǎng)基中，弧菌細胞恢復(fù)生長緩慢，甚至不能恢復(fù)生長；（5)野生細菌中特別是弧菌中廣 泛存在限制性-修飾系統(tǒng)以及胞外核酸酶，直接破壞了外源遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致電轉(zhuǎn)化失敗。
[0005] 國內(nèi)外有極少數(shù)研究者進行了某些弧菌電轉(zhuǎn)化的探索（如鰻弧菌、副溶血弧菌）， 但是實際應(yīng)用時發(fā)現(xiàn)操作并不穩(wěn)定、得到理想結(jié)果的概率低、并且缺乏通用性，已經(jīng)報道的 方法產(chǎn)生這些缺點的原因則是不能很好地同時解決上述5個問題。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明的第一個目的是針對上述問題，提供一種能夠成功得到弧菌電感受態(tài)細胞 的通用弧菌電感受態(tài)細胞制備方法。
[0007] 本發(fā)明的通用弧菌電感受態(tài)細胞制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0008] 將弧菌接種至腦心浸液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取菌液，離心收集菌體，菌 體用洗滌緩沖液洗滌，離心收集菌體，如此用洗滌緩沖液洗滌若干次，收集的菌體重懸于洗 滌緩沖液中，由此得到弧菌電感受態(tài)細胞；
[0009] 所述的洗滌緩沖液含有：133-266mM蔗糖、l-5mM 4-羥乙基哌嗪乙磺，溶劑為水。
[0010] 優(yōu)選，所述的通用弧菌電感受態(tài)細胞制備方法，具體步驟為：先將弧菌接種至腦 心浸液培養(yǎng)基中，30-37°C振蕩培養(yǎng)12-16hr，獲得種子液，再將種子液以2?8% v/v的接 種量接種到新鮮的腦心浸液培養(yǎng)基中，30-37°C振蕩培養(yǎng)至0D6(l(lmi = 0. 6-0. 8(此時弧菌細 胞處于對數(shù)生長期，電擊耐受能力強，轉(zhuǎn)化率高），得到培養(yǎng)液，將此培養(yǎng)液置于冰上10? 15min，離心去上清，收集菌體，再加入洗滌緩沖液洗滌，離心去上清，收集菌體，再用洗滌緩 沖液洗滌，離心去上清，收集菌體，將此菌體重懸于洗滌緩沖液中，由此得到弧菌電感受態(tài) 細胞。
[0011] 弧菌培養(yǎng)基為腦心浸液培養(yǎng)基（BHI，購自美國BD公司）。BHI具有非常豐富的營 養(yǎng)，幾乎所有難以培養(yǎng)生長緩慢的弧菌在BHI中都可以高密度快速生長，豐富的營養(yǎng)條件 下生長的弧菌具有更強的承受電擊脅迫環(huán)境的能力，并且更容易形成感受態(tài)。
[0012] 洗滌緩沖液以滅菌去離子水配制，并用0. 22 μ Μ濾膜過濾除菌。蔗糖提供了一種 非離子的高滲環(huán)境，以維持細胞的形態(tài)完整，也不至于電擊時形成電弧。HEPES是一種非離 子pH穩(wěn)定劑，可以在低濃度下穩(wěn)定pH。維持類似于海水的偏堿性滲透對于弧菌電轉(zhuǎn)化效率 至關(guān)重要。
[0013] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種通用的弧菌電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下 步驟：
[0014] 在上述獲得的弧菌電感受態(tài)細胞中加入質(zhì)粒DNA，然后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷電擊杯中，將電 擊杯置于電穿孔儀電擊槽中，電擊條件：1. 2?1. 8KV，電容25uF，電擊時間5ms，電擊后加入 到42°C預(yù)熱的BHI培養(yǎng)基中，置于30-37°C振蕩培養(yǎng)1. 5-3hr進行恢復(fù)生長，恢復(fù)生長的菌 液接種于BHI培養(yǎng)基瓊脂平板中，再按照常規(guī)方法進行篩選，獲取轉(zhuǎn)化子。
[0015] 恢復(fù)生長的時間不能小于1. 5hr，弧菌細胞相比于大腸桿菌對電擊敏感，因此恢復(fù) 生長的時間要長，如果恢復(fù)時間小于1. 5hr，電擊轉(zhuǎn)化效率大大降低。
[0016] 利用本發(fā)明的方法能夠成功的獲得弧菌電感受態(tài)細胞，獲得的感受態(tài)細胞按照本 發(fā)明的電轉(zhuǎn)化方法能夠成功地將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入弧菌細胞中，從而實現(xiàn)了將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入弧菌細 胞中，為弧菌致病機理的探索提供了成熟、便捷的遺傳操作技術(shù)。

【具體實施方式】：
[0017] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0018] 實施例1 :重組質(zhì)粒pLP4轉(zhuǎn)化擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus) VB542
[0019] ⑴擬態(tài)弧菌接種于4ml腦心浸液培養(yǎng)基（BHI培養(yǎng)基，購自美國BD公司）中，37°C 振蕩培養(yǎng)16hr。
[0020] (2)培養(yǎng)結(jié)束后，以2% (V/V)比例添加到新鮮的BHI培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至 = 0. 6,得到培養(yǎng)物。此時弧菌細胞處于對數(shù)生長期，電擊耐受能力強，轉(zhuǎn)化率高。
[0021] (3)取出步驟（2)的培養(yǎng)物1ml置于冰中l(wèi)Omin，然后4°C，8000rpm離心2min。
[0022] (4)吸盡上清，加入洗滌緩沖液1ml。洗滌緩沖液配方：266mM蔗糖、ImM HEPES (pH7. 5)，溶劑為水，其是將266mmol的蔗糖，lmmol的HEPES，溶于1L的滅菌去離子水 中，調(diào)pH值至7. 5,用0. 22 μ Μ濾膜過濾除菌備用。
[0023] (5)4°C，8000rpm離心3min，吸除上清，再加入預(yù)冷的洗滌緩沖液1ml，重懸菌液， 4°C，8000rpm離心3min，吸除上清，收集菌體，共采用洗滌緩沖液洗滌2次。最后將收集的 弧菌細胞重懸于40 μ L洗滌緩沖液中，由此獲得擬態(tài)弧菌電感受態(tài)細胞，然后置于冰上，力口 入2 μ L純化的質(zhì)粒pLP4 (50ng/ μ L)。冰上以移液槍頭輕輕混勻。
[0024] (6)將弧菌細胞及混合的質(zhì)粒pLP4轉(zhuǎn)移到預(yù)冷電擊杯中（間隙1mm)，迅速以吸水 紙擦干電擊杯外表，將電擊杯置于電穿孔儀電擊槽中。電擊條件：1. 8KV,電容25uF，電擊時 間 5ms。
[0025] (7)電擊后迅速加入42°C預(yù)熱的BHI培養(yǎng)基1ml，置于37°C振蕩培養(yǎng)1. 5hr，得到 恢復(fù)生長的培養(yǎng)物。
[0026] (8)取恢復(fù)生長后培養(yǎng)物100 μ 1，涂布細胞懸液于含氯霉素（20 μ g/ml)的BHI瓊 脂平板上，超凈臺風(fēng)干l〇min，37°C培養(yǎng)12hr。
[0027] (9)挑取平板上生長的菌落，進行轉(zhuǎn)化子的鑒定，得到許多轉(zhuǎn)入有重組質(zhì)粒pLP4 的擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus)VB542。
[0028] 實施例2 :表達質(zhì)粒pACYC184 Λ cat轉(zhuǎn)化哈氏弧菌（Vibrio harveyi)E385
[0029] (1)哈氏弧菌接種于4ml BHI培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)16hr。
[0030] ⑵培養(yǎng)結(jié)束后，以8% (V/V)比例添加到新鮮的BHI培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至 (?__ = 0.8,得到培養(yǎng)物。
[0031] (3)取出步驟（2)的培養(yǎng)物1ml置于冰中15min，然后4°C，8000rpm離心2min。
[0032] (4)吸盡上清，加入預(yù)冷的洗滌緩沖液lml。洗滌緩沖液配方：200mM蔗糖、5mM HEPES (pH7. 5)，溶劑為水，其是將200mmol的蔗糖，5mmol的HEPES，溶于1L的滅菌去離子水 中，調(diào)pH值至7. 5,用0. 22 μ Μ濾膜過濾除菌備用。
[0033] (5)4°C，8000rpm離心1. 5min，吸除上清，再加入洗滌緩沖液1ml，重懸菌液，4°C， 8000rpm離心1. 5min，吸除上清，收集菌體，共采用洗滌緩沖液洗滌2次。將收集的弧菌細 胞重懸于40 μ L洗滌緩沖液中，由此得到哈氏弧菌電感受態(tài)細胞，置于冰上，加入1 μ L純化 的質(zhì)粒PACYC184 Λ cat (65ng/ μ L)。冰上以移液槍頭輕輕混勻。
[0034] (6)將弧菌細胞及混合的質(zhì)粒pACYC184 Λ cat轉(zhuǎn)移到預(yù)冷電擊杯中（間隙1mm)， 迅速以吸水紙擦干電擊杯外表，將電擊杯置于電穿孔儀電擊槽中。電擊條件：1. 2KV,電容 25uF，電擊時間5ms。
[0035] (7)電擊后迅速加入42°C預(yù)熱的BHI培養(yǎng)基1ml，置于30°C振蕩培養(yǎng)3hr，得到恢 復(fù)生長后的培養(yǎng)物。
[0036] (8)取恢復(fù)生長后的培養(yǎng)物ΙΟΟμΙ，涂布細胞懸液于含四環(huán)素（12yg/ml)的BHI 瓊脂平板上，超凈臺風(fēng)干l〇min，30°C培養(yǎng)16hr。
[0037] (9)挑取平板上生長的菌落，進行轉(zhuǎn)化子的鑒定，得到許多轉(zhuǎn)有表達質(zhì)粒 pACYC184 Λ cat 的哈氏弧菌（Vibrio harveyi)E385。
[0038] 實施例 3 :表達質(zhì)粒 pBAD18cm 轉(zhuǎn)化溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus) A056
[0039] (1)溶藻弧菌接種于1ml BHI培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12hr。
[0040] ⑵培養(yǎng)結(jié)束后，以5% (V/V)比例添加到新鮮的BHI中，37°C振蕩培養(yǎng)至 =0.8,得到培養(yǎng)物。
[0041] (3)取出步驟⑵的培養(yǎng)物1ml置于冰中10min，然后4°C，8000rpm離心2min。
[0042] (4)吸盡上清，加入洗滌緩沖液1ml。洗滌緩沖液配方：133mM蔗糖、2mM HEPES (pH7. 5)，溶劑為水，其是將133mmol的蔗糖，2mmol的HEPES，溶于1L的滅菌去離子水 中，調(diào)pH值至7. 5,用0. 22 μ Μ濾膜過濾除菌備用。
[0043] (5)4°C，8000rpm離心2min，吸除上清，再加入預(yù)冷的洗滌緩沖液1ml，重懸菌液， 4°C，8000rpm離心2min，吸除上清，收集菌體，共采用洗滌緩沖液洗滌2次。將收集的弧菌 細胞重懸于40yL洗漆緩沖液中，由此得到溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)A056電感受 態(tài)細胞，置于冰上，加入2 μ L純化的質(zhì)粒pBAD18cm (40ng/μ L)。冰上以移液槍頭輕輕混勻。
[0044] (6)將弧菌細胞及混合的pBAD18cm轉(zhuǎn)移到預(yù)冷電擊杯中（間隙1mm)，迅速以吸水 紙擦干電擊杯外表，將電擊杯置于電穿孔儀電擊槽中。電擊條件：1. 5KV,電容25uF，電擊時 間 5ms。
[0045] (7)電擊后迅速加入42°C預(yù)熱的BHI培養(yǎng)基1ml，置于37°C振蕩培養(yǎng)2hr，得到恢 復(fù)生長后的培養(yǎng)物。
[0046] (8)取恢復(fù)生長后的培養(yǎng)物1000 μ 1，離心后重懸于100 μ 1BHI中，涂布細胞懸液 于含氯霉素（20μ g/ml)的ΒΗΙ瓊脂平板上，超凈臺風(fēng)干10min，37°C培養(yǎng)12hr。
[0047] (9)挑取平板上生長的菌落，進行陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定，得到許多轉(zhuǎn)有表達質(zhì)粒 pBAD18cm 的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)A056。
【權(quán)利要求】
1. 一種通用弧菌電感受態(tài)細胞制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 將弧菌接種至腦心浸液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取菌液，離心收集菌體，菌體用 洗滌緩沖液洗滌，離心收集菌體，如此用洗滌緩沖液洗滌若干次，收集的菌體重懸于洗滌緩 沖液中，由此得到弧菌電感受態(tài)細胞； 所述的洗滌緩沖液含有：133-266mM蔗糖、l-5mM 4-羥乙基哌嗪乙磺，溶劑為水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的通用弧菌電感受態(tài)細胞制備 方法，具體步驟為：先將弧菌接種至腦心浸液培養(yǎng)基中，30-37°C振蕩培養(yǎng)12-16hr，獲得種 子液，再將種子液以2?8% v/v的接種量接種到新鮮的腦心浸液培養(yǎng)基中，30-37°C振蕩培 養(yǎng)至〇〇_" = 〇. 6-0. 8,得到培養(yǎng)液，將此培養(yǎng)液置于冰上10?15min，離心去上清，收集菌 體，再加入洗滌緩沖液洗滌，離心去上清，收集菌體，再用洗滌緩沖液洗滌，離心去上清，收 集菌體，將此菌體重懸于洗滌緩沖液中，由此得到弧菌電感受態(tài)細胞。
3. -種通用的弧菌電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟： 在權(quán)利要求1所述的弧菌電感受態(tài)細胞中加入質(zhì)粒DNA，然后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷電擊杯中，將 電擊杯置于電穿孔儀電擊槽中，電擊條件：1. 2?1. 8KV，電容25uF，電擊時間5ms，電擊后加 入到42°C預(yù)熱的BHI培養(yǎng)基中，置于30-37°C振蕩培養(yǎng)1. 5-3hr進行恢復(fù)生長，恢復(fù)生長的 菌液接種于BHI培養(yǎng)基瓊脂平板中，再按照常規(guī)方法進行篩選，獲取轉(zhuǎn)化子。
【文檔編號】C12N15/74GK104195073SQ201410390978
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】羅鵬, 王艷紅, 胡超群, 夏建軍 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所