一種雙酶法生產(chǎn)ε-己內(nèi)酯工藝的制作方法
【專利摘要】一種以環(huán)己醇為起始原料，以一鍋煮方式生產(chǎn)ε-己內(nèi)酯的生產(chǎn)工藝，該工藝同時使用共價共固定化的醇脫氫酶和單加氧酶進行生物氧化反應(yīng)，以空氣為氧化劑，將環(huán)己醇直接氧化為ε-己內(nèi)酯；反應(yīng)溫度為30-40℃，反應(yīng)pH為7.0，反應(yīng)介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液(pH7.0)+乙酸丁酯2相體系。本發(fā)明工藝條件溫和，收率高，無有毒有害溶劑，產(chǎn)品生物相容性好，可以用于生物醫(yī)藥材料。
【專利說明】-種雙酶法生產(chǎn)ε-己內(nèi)酯工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物催化氧化生產(chǎn)ε -己內(nèi)酯的生產(chǎn)工藝，特別是一種以環(huán)己醇 為起始原料，用醇脫氫酶和單加氧酶2種酶為催化劑，用有機溶劑-水2相體系控制底物、 產(chǎn)物濃度，用空氣作為氧化劑，一鍋煮工藝生產(chǎn)ε -己內(nèi)酯的技術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002] ε -己內(nèi)酯是一種無毒的新型聚酯單體，在高分子材料的合成和改性方面具有不 可替代的作用。ε-己內(nèi)酯主要用于合成不同用途的聚己內(nèi)酯（PCL)，PCL具有獨特的生 物相容性、生物降解性以及良好的滲透性，在材料領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。如PCL生物醫(yī)用材 料可用于手術(shù)的縫合線及骨折內(nèi)固定材料（具有形狀記憶的PCL材料）。隨著時間的推 移，聚酯材料會慢慢地降解被吸收，而不會對傷口和人體有傷害，可取代傳統(tǒng)的手術(shù)方 法，大大提高手術(shù)的方便性，同時可減輕患者的痛苦。
[0003] ε -己內(nèi)酯與各種單體共聚或PCL與其他樹脂共混可提高材料的光澤度、透明性、 生物分解性和防黏性等。ε -己內(nèi)酯還是一種優(yōu)良的有機溶劑和重要的有機合成中間體，對 一些難溶性樹脂表現(xiàn)出很好的溶解性，可與多種化合物反應(yīng)制備具有獨特性能的精細化學(xué) 品。此類產(chǎn)品可作為農(nóng)膜、膠粘劑、肥料的控制釋放體及可降解包裝材料。目前年產(chǎn)量已 超過1萬噸。
[0004] 由于合成ε-己內(nèi)酯工藝技術(shù)難度高，迄今為止只有美國、英國、日本等國家的幾 家公司能夠生產(chǎn)ε-己內(nèi)酯，而我國主要依賴進口。
[0005] 目前，己內(nèi)酯的合成方法很多，其起始原料主要為環(huán)己酮，大致可分為以下 幾種。
[0006] 1過氧酸氧化法 過氧酸氧化法就是用過氧酸作氧化劑氧化環(huán)己酮合成ε-己內(nèi)酯，這種方法研究比 較成熟，已廣泛使用，但是其合成前期過氧酸的濃縮以及后續(xù)純化過程所產(chǎn)生的濃度過 高、易爆的過氧化物是該工藝實際應(yīng)用的障礙，即該工藝存在無法避免的操作安全問題； 另外，后期的產(chǎn)品分離和羧酸的回收再利用也存在一定的困難。
[0007] 2 Η202 氧化法 該法用Η202將有機酸氧化成過氧酸，再用過氧酸氧化環(huán)己酮生成ε-己內(nèi)酯。為了 縮短反應(yīng)時間，需加入催化劑，包括有無機酸、有機酸和一些VI I I族金屬以及鈦硅沸 石和磺化樹脂等。所用氧化劑為Η202，比較清潔，它避免了過氧酸的濃縮，從而解決了 過氧酸氧化法中無法解決的脫水問題。但是其反應(yīng)過程中過渡態(tài)中間產(chǎn)物過氧酸在酸性和 較高溫度下，特別是有一些金屬離子及其化合物存在下很不穩(wěn)定。另外，ε-己內(nèi)酯 在酸性環(huán)境中易發(fā)生聚合、水解，反應(yīng)時間長，收率低，一般〈90%。
[0008] 中國專利申請01814586. 8公開了采用有機酸生產(chǎn)ε-己內(nèi)酯的工藝，最高收率 91. 2%，其反應(yīng)溫度高達250-325°C，耗能大；操作壓力為0. 01-0. 7atm，，增加了設(shè)備投資。
[0009] 中國發(fā)明專利申請201110313026. 8公開了一種由環(huán)己酮催化氧化制備己內(nèi)酯 的方法，產(chǎn)品收率為61. 3-89. 7%，由于使用苯甲腈、甲醇等有機溶劑，不可避免產(chǎn)生殘留， 由于苯甲腈、甲醇的毒性，嚴重影響產(chǎn)品的生物相容性，限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。 [0010] 中國發(fā)明專利申請201010227171. X公開了一種制備己內(nèi)酯和己二酸的方法，其 特征在于以可溶性鋅鹽改性的鈦硅分子篩為催化劑，在溫度為40?150°C和壓力為0. 1? 3MPa的條件下，將環(huán)己酮、氧化齊IJ、溶劑和催化劑進行反應(yīng)，產(chǎn)物分離后即同時得到己內(nèi)酯 和己二酸。反應(yīng)在較高溫度、一定壓力小進行，增加了設(shè)備投資、操作難度，能耗較大。而且， 由于使用了鋅鹽，產(chǎn)品中將有殘留，影響了產(chǎn)品的生物相容性，限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的 應(yīng)用。此外，該工藝同時生產(chǎn)2種產(chǎn)品，己內(nèi)酯需要另外增加分離步驟，增加了設(shè)備投資和 操作成本。
[0011] 3 02/空氣氧化法該法與Η202間接氧化法類似，只是用氧氣代替Η 202作為氧化 齊IJ。其優(yōu)點在于這種方法比較清潔，缺點在于分子氧的活性較低，反應(yīng)條件苛刻且產(chǎn)率 較低，至今該方法的效果欠佳。
[0012] 中國專利申請201110370189. X公開了一種由分子氧氧化環(huán)己酮制備ε-己內(nèi)酯 的方法，使用氧氣為氧化劑，其收率不高，最高收率僅85. 1%。由于使用了過氧化苯甲酰、偶 氮二異丁腈作為引發(fā)劑，不可避免將在產(chǎn)品中有殘留，較嚴重影響其生物相容性，限制了其 在生物醫(yī)學(xué)材料的應(yīng)用。
[0013] 4生物酶氧化法 采用生物酶氧化環(huán)己酮合成ε-己內(nèi)酯，其主要困難之一，是用酶催化反應(yīng)時，需要昂 貴的輔酶循環(huán)系統(tǒng)，制約了該法的工業(yè)發(fā)展。相對來說，此類方法目前研究得還比較少。
[0014] 如果用微生物細胞為催化劑則可能存在以下不足：（1)、細胞內(nèi)酶系復(fù)雜，可能使 產(chǎn)物降解；（2)、底物、產(chǎn)物擴散限制嚴重，底物要通過細胞壁，進入胞內(nèi)反應(yīng)，產(chǎn)物要通過 細胞壁，離開細胞，大大降低了細胞催化反應(yīng)速度，一般而言，與游離狀態(tài)時相比，酶在細胞 內(nèi)的反應(yīng)速度至少降低5倍。（3)、氧傳遞限制，細胞要用氧，反應(yīng)也要用氧，氧負荷顯著增 力口，加劇了氧傳遞限制；（4)、底物濃度低，因為細胞較酶更敏感，底物、產(chǎn)物可能對細胞抑 制，這就要求反應(yīng)液中底物、產(chǎn)物濃度必須較低(例如底物、產(chǎn)物濃度小于lg/L)，而且與離 體酶相比，細胞催化時無菌條件要求高，使成本顯著增加。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明將采用生物氧化生產(chǎn)ε-己內(nèi)酯，工藝條件溫和，收率高，無有毒有害溶 齊IJ，產(chǎn)品生物相容性好，可以用于生物醫(yī)藥材料。 現(xiàn)有的生物酶氧化工藝采用的起始原料是環(huán)己酮，除了提供氧分子外，還要求有機共 底物，用于原位輔酶循環(huán)，由于昂貴的輔酶循環(huán)，使得該工藝失去競爭性。 我們改變了出發(fā)原料，從環(huán)己醇出發(fā)，通過2步酶催化氧化，得到ε-己內(nèi)酯。整個工 藝只需提供氧分子(空氣）作為氧化劑，以一鍋煮方式將環(huán)己醇直接氧化成為ε -己內(nèi)酯。 在反應(yīng)中，輔酶循環(huán)是自己閉環(huán)的，所以，不需要另外提供輔酶循環(huán)。換句話說，本工藝不需 要另外提供昂貴的輔酶循環(huán)，從而大幅度降低了生產(chǎn)成本。具體工藝過程如1圖所示。 第一步氧化反應(yīng)，環(huán)己醇作為底物被醇脫氫酶（PDH)氧化為環(huán)己酮，同時，將氧化型的 輔酶NAD(P)+還原成還原型輔酶NAD(P)H。環(huán)己酮是一個關(guān)鍵的中間體，它在第2個氧化 反應(yīng)中被拜爾-維利格單加氧酶(具體是環(huán)己醇單加氧酶，CHM0,亦簡稱單加氧酶）原位催 化直接立體選擇性的氧化成ε -己內(nèi)酯，同時將還原型輔酶NAD(P)H氧化為氧化型的輔酶 NAD (P)+。此反應(yīng)中，催化劑為CHMO,氧分子為共同底物，要求還原型輔酶NAD (P)H。于是，在 一個反應(yīng)器偶合這2個氧化反應(yīng)，就可以將環(huán)己醇直接氧化為ε -己內(nèi)酯，無需另外提供輔 酶循環(huán)系統(tǒng)(如果2個反應(yīng)單獨進行，則需要另外提供輔酶循環(huán)系統(tǒng))。本工藝除了環(huán)己醇， 只需提供空氣，而環(huán)己醇是易得的化工產(chǎn)品?？梢?，將2步生物催化氧化反應(yīng)結(jié)合起來，在 一個反應(yīng)器中進行，即一鍋煮反應(yīng)，使輔酶循環(huán)互補、閉環(huán)，不再需要提供額外的輔酶循環(huán) 系統(tǒng)，從而大幅度降低生產(chǎn)成本；而且，反應(yīng)起始原料是環(huán)己醇，較環(huán)己酮廉價易得；此外， 用空氣作為氧化劑，進一步降低了生產(chǎn)成本。發(fā)明人經(jīng)過大量實驗，才得到這種巧妙結(jié)合的 工藝。催化反應(yīng)可以使用游離酶或固定化酶。 在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，底物環(huán)己醇、中間產(chǎn)物環(huán)己酮、產(chǎn)物ε -己內(nèi)酯對2種酶均有一 定的抑制，并可導(dǎo)致酶的失活，其中，對CHMO的抑制和失活較嚴重，而對TOH的抑制和失活 作用很輕。所以，在反應(yīng)中必須考慮酶的抑制和失活。為了增加酶的穩(wěn)定性，采用固定化 酶。為了減少底物環(huán)己醇、中間產(chǎn)物環(huán)己酮、產(chǎn)物ε-己內(nèi)酯對2種酶的抑制，可以采用非 水介質(zhì)酶催化體系，例如有機溶劑-水不溶的2相體系，底物環(huán)己醇、中間產(chǎn)物環(huán)己酮、產(chǎn)物 ε -己內(nèi)酯在有機溶劑的溶解度遠遠高于水，所以，它們主要存在于有機相，而酶在水相，從 而大幅度減少它們對酶的抑制和失活作用。 采用非水體系進行催化反應(yīng)，具體采用乙酸丁酯-水2相體系。此外，環(huán)己醇、環(huán)己酮 在乙酸丁酯中溶解度小于ε-己內(nèi)酯，于是，ε-己內(nèi)酯幾乎全部進人乙酸丁酯，對酶的抑 制和失活大幅度減少，而環(huán)己醇、環(huán)己酮在水中還一部分，與乙酸丁酯形成平衡，當反應(yīng)消 耗了水中的環(huán)己醇、環(huán)己酮時，乙酸丁酯中的環(huán)己醇、環(huán)己酮會向水中轉(zhuǎn)移，繼續(xù)反應(yīng)。GB 2760 - 96規(guī)定乙酸丁酯為允許使用的食用香料。作為香料，大量用于配制香蕉、梨、菠蘿、 杏、桃及草莓、漿果等型香精。亦可用作天然膠和合成樹脂等的溶劑。所以使用乙酸丁酯作 為溶劑是安全的。 反應(yīng)需要2種酶：PDH，CHMO。這2種酶可以購買，也可以自己重組發(fā)酵生產(chǎn)。 將H)H、CHMO基因分別在大腸桿菌中表達，然后，培養(yǎng)大腸桿菌，破碎細胞，分離純化， 分別得到所需純度的Η)Η、(?ΜΟ。然后，可以進行共價固定化。 固定化載體，可以采用帶環(huán)氧基、氨基等基團的載體，例如，氨基型SEPABEADS EC-HA(EA)和環(huán)氧型SEPABEADS EC-EP(HFA)系列聚甲基丙烯酸球狀基質(zhì)（Resindion S.r.l·，Mitsubishi Chem. Corp·，Japan);平均孔徑為60_80nm這種經(jīng)過篩分的孔徑標 準使得SEPABEADS?，聚甲基丙烯酸縮水甘油酯，環(huán)氧基載體在溫和的條件下與酶分子的氨 基結(jié)合。最適合的載體有多活性基團，實現(xiàn)多點共價連接提高酶的剛性。商業(yè)化的環(huán)氧基 載體，大孔(平均粒徑1701m)且載體表面帶有環(huán)氧基團。N，N-亞甲基-雙-丙烯酰胺-甲 基丙烯酸縮水甘油酯、烯丙基縮水甘油醚、甲基丙烯酰胺共聚合，用于酶的共價固定化。國 外已開發(fā)出工業(yè)化應(yīng)用的含活性環(huán)氧基的固定化酶載體，如SEPABEADS EC、Eupergit C， Sepabeads EC，DilbeadsTM等，國內(nèi)也有用于酶固定化的載體，例如魯抗樹脂-酶固定化載 體，可以用于酶固定化。多種酶經(jīng)Eupergit C固定化保留酶的活力15-100%。 PDH基因可以從多種動物、植物、微生物克隆，例如：紫狼尾草Pennisetum purpureum, 紫蘇peri 1 la,水稻，西紅柿，醋酸桿菌，乳桿菌、大腸桿菌，芽孢桿菌，假單胞菌，white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium , Pseudomonas sp , Saccharomyces cerevisiae, 大鼠肝，果妮 Bactrocera oleae，乳桿菌（Lactobacillus kefir)。 CHMO有多種基因來源，例如：子囊菌屬的Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011， 不動菌屬 Acinetobacter sp. NCIMB 9871，霉菌 Exophiala jeanselmei,玫瑰色紅球菌 Rhodococcus rhodochrous，節(jié)桿菌（Arthrobacter BP2 等。 將它們的基因表達在各種宿主，例如大腸桿菌，酵母等，具體菌株如E. coli BL21 (DE3)、C41 (DE3)，SHuffle (DE3)，TGI (pBV03)等，從而得到相應(yīng)的酶。 微生物的培養(yǎng)包括種子培養(yǎng)，發(fā)酵罐批量培養(yǎng)，可以采用間歇操作、流加操作。 大腸桿菌在葡萄糖過量或缺氧的情況下出現(xiàn)葡萄糖效應(yīng)產(chǎn)生乙酸，影響菌產(chǎn)量和蛋 白表達，因此，采用流加操作使葡萄糖保持在一定的水平可降低葡萄糖效應(yīng)。常用的流加 方式有三種：恒速流加；變速流加；指數(shù)流加。以便控制葡萄糖濃度在較低的水平，減 少乙酸生成，應(yīng)用較廣。 用甘油作為碳源比用葡萄糖做碳源產(chǎn)生的乙酸少，但是，僅以甘油為碳源時，大腸桿菌 生長速度較慢。所以可以采用葡萄糖與甘油作復(fù)合碳源，同時，采用流加操作。 培養(yǎng)過程中所用的各種培養(yǎng)基如下： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂）：蛋白胨l〇g ;牛肉膏3g ;氯化鈉5g ;瓊脂15?20g ; 蒸饋水lOOOmL。 LB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0. 5%，NaCl 1%; LA平板培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母0. 5%，NaCl 1%，瓊脂1. 5%。 種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉〇. 5%，NaCl 1%。 發(fā)酵罐培養(yǎng)基：蛋白胨 1. 5%，酵母膏 0. 7%，NaCl l%，Na2HP04 0. 35%，KH2P04 0 . 4%，MgS04 7H20 0· 05%，葡萄糖 5%，甘油 L 5 %。 流加培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖200,甘油100,酵母粉5,胰蛋白胨10，MgS047H20 20，TES 3 mL. 根據(jù)轉(zhuǎn)基因載體的抗性，選擇相應(yīng)的抗生素，如氨芐青霉素，卡那霉素等，添加到各培 養(yǎng)基中，濃度為50-200 mg/L氨芐青霉素或其他抗生素。 在發(fā)酵培養(yǎng)液中，要加入微量元素營養(yǎng)液（TES)，pH7.0.組成為：TES(g/L，N-三 (羥甲基）甲基-2-氨基乙磺酸）：CaCl20.5, ZnS047H20 0.18, MnS04H20 0.1, Na2-EDTA 10.05，F(xiàn)eCl38. 35，CuS045H20 0.16, C〇C126H20 0.18。 采用由熒光假單胞菌得到CHMO基因，在大腸桿菌中表達，用IPTG誘導(dǎo)CHMO表達，經(jīng) 斜面、搖瓶、2級種子培養(yǎng)、30m3大罐培養(yǎng)，0. ImM的IPTG用于誘導(dǎo)CHM0表達，培養(yǎng)溫度 20-30° C，0D_為0. 5-0. 8,培養(yǎng)時間24-36h，得到含CHMO的菌體發(fā)酵液。大罐培養(yǎng)采用 流加操作。用3足過濾式離心機過濾發(fā)酵液，得到含CHMO的菌體，用酶解+超聲波破碎方 法破碎細胞，用PEG4000/磷酸鹽體系的雙水相分離酶與細胞碎片，用雙水相再分離純化一 次，得到初步純化的CHMO酶液，待用，用于固定化，1單位酶活相應(yīng)于轉(zhuǎn)化1 μΜ CH0/分鐘。 采用由假單胞菌得到PDH基因，在大腸桿菌中表達，用自動誘導(dǎo)介質(zhì)ΖΥΡ-5052誘導(dǎo) PDH表達，用分子伴侶載體以增加表達量，經(jīng)斜面、搖瓶、2級種子培養(yǎng)、30m3大罐培養(yǎng)，細胞 在30 -35° C培養(yǎng)24-36h ;得到含PDH的菌體發(fā)酵液。大罐培養(yǎng)采用流加操作。用3足過濾 式離心機過濾發(fā)酵液，得到含TOH的菌體，用酶解+超聲波破碎方法破碎細胞，用PEG4000/ 磷酸鹽體系的雙水相分離酶與細胞碎片，用雙水相再分離純化一次，得到初步純化的Η)Η 酶液，待用，用于固定化。1單位酶活相應(yīng)于轉(zhuǎn)化1 UMCHL/分鐘。 然后，將得到的2種酶液直接進行雙酶共價共固定化，即將2種酶同時共價固定化在同 一載體上，亦稱共價共固定化酶。載體為環(huán)氧型SEPABEADS EC-EP (HFA)，經(jīng)過大量實驗，結(jié) 果表明，CHMO酶液/PDH酶液=4. 5,得到的固定化酶比活最高，比活為900mU/g干載體。本 發(fā)明用此方法生產(chǎn)得到的固定化酶，簡稱固定化酶1。固定化酶1為共價共固定化的醇脫氫 酶和單加氧酶。實驗表明，固定化酶1可以重復(fù)使用10次，剩余活性為50%。使用溫度： 30-40° C，pH7-7. 6。1單位酶活相應(yīng)于以環(huán)己醇為底物，產(chǎn)生1 μΜ ε-己內(nèi)酯/分鐘。 生物催化氧化反應(yīng)過程為：反應(yīng)介質(zhì)：70-80%磷酸鹽緩沖液（pH 7. 0)+20-30%乙酸 丁酯，鼓泡塔反應(yīng)器，，裝料量為55-65%，在攪拌罐里加入反應(yīng)介質(zhì)和環(huán)己醇，使液體溫度 在30-40° C，劇烈攪拌使其乳化后，加入鼓泡塔反應(yīng)器；在鼓泡塔中加入固定化酶1，此固 定化酶可以從市場上購買，也可自己生產(chǎn)。本發(fā)明中所用固定化酶均為自己生產(chǎn)，生產(chǎn)過程 如前述內(nèi)容中所述，這里不做贅述。即，所用固定化酶為前述的固定化酶1。加入等量NADPH 和NADP+，濃度為0. Ι-lg/L，反應(yīng)開始進行，在鼓泡塔底部噴入空氣，通氣量為1-3ν/ (ν·分 鐘）（通氣量/(反應(yīng)液體積分鐘）），反應(yīng)16-20小時，結(jié)束反應(yīng)。濾出固定化酶，反應(yīng)液離 心破乳，分出水相和有機相，蒸出有機相中溶劑，得到產(chǎn)物ε -己內(nèi)酯。水相、固定化酶、有 機相均可重復(fù)使用。環(huán)己醇轉(zhuǎn)化率90-95%，ε-己內(nèi)酯收率90-95%。ε-己內(nèi)酯的選擇 性為100%。由于反應(yīng)時間長，且有機溶劑對酶活有影響，固定化酶重復(fù)使用10次后，酶活 還剩50%。 實施例1
[0016] 生物催化氧化反應(yīng)，反應(yīng)介質(zhì)：80%磷酸鹽緩沖液（pH 7. 0)+20%乙酸丁酯，100L 鼓泡塔反應(yīng)器，使液體溫度在30-40° C，在攪拌罐中加入55L反應(yīng)介質(zhì)、3005g環(huán)己醇，劇 烈攪拌使其乳化后，加入鼓泡塔反應(yīng)器；在鼓泡塔中加入固定化酶1 100U。固定化酶可以 從市場上購買，也可自己生產(chǎn)。本發(fā)明中所用固定化酶均為自己生產(chǎn)，為固定化酶1，生產(chǎn) 過程如
【發(fā)明內(nèi)容】
中所述，這里不做贅述。即，所用固定化酶為前述的固定化酶1。加入等量 NADPH和NADP+，各25g，反應(yīng)開始進行，在鼓泡塔底部噴入空氣，通氣量為l-2v/(v ·分鐘)， 反應(yīng)16-20小時，結(jié)束反應(yīng)。濾出固定化酶，反應(yīng)液離心破乳，分出水相和有機相，蒸出有 機相中溶劑，得到產(chǎn)物ε-己內(nèi)酯。水相、固定化酶、有機相均可重復(fù)使用。環(huán)己醇轉(zhuǎn)化率 90-95%，ε-己內(nèi)酯收率90-95%，ε-己內(nèi)酯的選擇性為1〇〇%。 實施例2
[0017] 生物催化氧化反應(yīng)，反應(yīng)介質(zhì)：70%磷酸鹽緩沖液（pH 7. 0)+30%乙酸丁酯， 1000L鼓泡塔反應(yīng)器，攪拌罐中反應(yīng)器中加入600L反應(yīng)介質(zhì)、40. lkg環(huán)己醇，劇烈攪拌使其 乳化后，加入鼓泡塔反應(yīng)器；在鼓泡塔中加入固定化酶1 600U。加入等量NADPH和NADP+， 各lkg，反應(yīng)開始進行，在鼓泡塔底部噴入空氣，通氣量為1.5-3ν/ (ν·分鐘)，使液體溫度 在30-40° C，反應(yīng)16-20小時，結(jié)束反應(yīng)。濾出固定化酶，反應(yīng)液離心破乳，分出水相和有 機相，蒸出有機相中溶劑，得到產(chǎn)物ε-己內(nèi)酯。水相、固定化酶、有機相均可重復(fù)使用。環(huán) 己醇轉(zhuǎn)化率90-95%，ε-己內(nèi)酯收率90-95%，ε-己內(nèi)酯的選擇性為1〇〇%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為反應(yīng)路線簡圖。
【權(quán)利要求】
1. 一種以環(huán)己醇為起始原料生產(chǎn)ε-己內(nèi)酯的生產(chǎn)工藝，其特征在于使用共價共固定 化的醇脫氫酶和單加氧酶進行生物氧化反應(yīng)，以空氣為氧化劑，以一鍋煮方式，將環(huán)己醇直 接氧化為ε-己內(nèi)酯；反應(yīng)溫度為30-40°，反應(yīng)pH為7.0,反應(yīng)介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液（pH 7.0)+乙酸丁酯2相體系。
2. 權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于反應(yīng)過程如下：反應(yīng)介質(zhì)：70-80%磷酸鹽 緩沖液（pH 7. 0)+20-30%乙酸丁酯，鼓泡塔反應(yīng)器，裝料量為55-65% ;在攪拌罐里加入反 應(yīng)介質(zhì)和環(huán)己醇，使液體溫度在30-40° C，劇烈攪拌使其乳化后，加入鼓泡塔反應(yīng)器；在鼓 泡塔中加入固定化酶，此固定化酶是將醇脫氫酶和單加氧酶同時共價共固定化而得到；力口 入等量NADPH和NADP+，濃度為0. Ι-lg/L，反應(yīng)開始進行，在鼓泡塔底部噴入空氣，通氣量為 1-3ν/ (ν·分鐘）（通氣量/ (反應(yīng)液體積?分鐘）），反應(yīng)16-20小時，結(jié)束反應(yīng)；濾出固定化 酶，反應(yīng)液離心破乳，分出水相和有機相，蒸出有機相中溶劑，得到產(chǎn)物ε -己內(nèi)酯；水相、 固定化酶、有機相均可重復(fù)使用。
【文檔編號】C12P17/08GK104195194SQ201410404425
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】劉均洪, 張媛媛, 丁麗 申請人:青島科技大學(xué)