一種鼠李糖苷酶的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及鼠李糖苷酶領(lǐng)域，特別是涉及一種鼠李糖苷酶的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鼠李糖苷酶是一種水解酶。鼠李糖苷酶的來(lái)源比較廣，廣泛分布于自然界的細(xì)菌和真菌中。國(guó)內(nèi)關(guān)于鼠李糖苷酶研究，主要集中在代謝產(chǎn)生的鼠李糖苷酶，國(guó)外研究相對(duì)較多，主要有黑曲霉、白曲霉、棘孢曲霉、青霉菌、擬桿菌屬和熱微菌門(mén)等。鼠李糖苷酶在實(shí)際工藝中具有很多潛在的應(yīng)用價(jià)值，如工業(yè)上用于去除柑桔汁中柚皮苷的苦味，將橘皮苷水解為鼠李糖和橘皮素糖苷等。其中橘皮素糖苷是工業(yè)生產(chǎn)甜味劑的重要前體物。另外，鼠李糖苷酶可以作用于萜烯基糖苷，在改善葡萄汁和飲料的香氣成分方面有很重要的應(yīng)用。它在食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。其工業(yè)化生產(chǎn)是利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，但該方法存在發(fā)酵活力低、產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等限制性因素，故為了克服上述問(wèn)題，技術(shù)人員在應(yīng)用各種遺傳學(xué)手段提高微生物的生產(chǎn)性能方面，做了大量工作，而對(duì)通過(guò)培養(yǎng)方法的改進(jìn)來(lái)提高發(fā)酵性能方面所做的工作還有所欠缺。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡(jiǎn)單、發(fā)酵活力高的鼠李糖苷酶的生產(chǎn)方法。
[0004]—種鼠李糖苷酶的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0005](I)取細(xì)麗毛殼菌種按5?20%的接種量接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在25?38°C培養(yǎng)10?30h，控制溶氧在60%以上，培養(yǎng)即得一級(jí)種子液；
[0006](2)將所述一級(jí)種子液按5?20%的接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中，在25?38°C培養(yǎng)10?30h，控制溶氧在60 %以上，培養(yǎng)即得二級(jí)種子液；
[0007](3)將所述二級(jí)種子液按5?20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25?38°C培養(yǎng)40?55h，控制溶氧在60%以上，得到混合培養(yǎng)基，后按每升混合培養(yǎng)基添加5?1g蔗糖的比例添加蔗糖，并開(kāi)始按每升混合培養(yǎng)基流加橘皮苷0.5?5g/小時(shí)的比例添加橘皮苷，同時(shí)控制pH為4.5?5.5，培養(yǎng)70?96h后即得酶活達(dá)到500U/mL以上的鼠李糖苷酶發(fā)酵液，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化鈉3?5g/L、磷酸二氫銨2?3g/L、硫酸鎂0.5?lg/L、氯化鋅0.2?0.5g/L、丙酸鈣20?30g/L;
[0008](4)將所述鼠李糖苷酶發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾，除去菌體及其他微小顆粒，后對(duì)濾液超濾濃縮，直至得到酶活達(dá)到1250U/mL以上的鼠李糖苷酶酶液；
[0009](5)將所述鼠李糖苷酶酶液以淀粉為載體，進(jìn)行噴霧干燥，即可得到酶活達(dá)到3500U/mL以上的固體鼠李糖苷酶；
[0010]其中，步驟(I)中的所述一級(jí)種子培養(yǎng)基和步驟(2)中的所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的成分都為:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化鈉3?5g/L、磷酸二氫錢(qián)2?3g/L、硫酸鎂0.5?lg/L、氯化鋅0.2?0.5g/L、丙酸鈣20?30g/L。
[0011 ]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述一級(jí)種子培養(yǎng)基、所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的成分都為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化鈉3g/L、磷酸二氫錢(qián)3g/L、硫酸鎂lg/L、氯化鋅0.2g/L、丙酸鈣20g/L。
[0012]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物10g/L、氯化鈉5g/L、磷酸二氫銨3g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鋅0.5g/L、丙酸鈣30g/L。
[0013]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(3)中，通過(guò)添加氨水的方式控制pH為5.0?5.5。
[0014]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(1)、(2)、(3)中控制溶氧的方法都為:在培養(yǎng)過(guò)程中，調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速或通入無(wú)菌空氣控制溶氧在60%以上。
[0015]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(4)中，將鼠李糖苷酶發(fā)酵液通過(guò)板框過(guò)濾方法，除去菌體及其他微小顆粒。
[0016]上述鼠李糖苷酶的生產(chǎn)方法，通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中控制鼠李糖的加入量，從而控制菌體生長(zhǎng)速度，防止發(fā)酵培養(yǎng)后期菌體生長(zhǎng)后勁不足；另外，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入蔗糖，可以限制鼠李糖苷酶對(duì)橘皮苷的作用，減少鼠李糖的產(chǎn)生，有利于促進(jìn)鼠李糖苷酶的合成。
[0017]上述鼠李糖苷酶的生產(chǎn)方法，工藝簡(jiǎn)單、操作容易、生產(chǎn)效率高，且生產(chǎn)的鼠李糖苷酶活力高，穩(wěn)定性好，易于儲(chǔ)存。
【具體實(shí)施方式】
[0018]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說(shuō)明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來(lái)實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類(lèi)似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開(kāi)的具體實(shí)施的限制。
[0019]—實(shí)施方式的鼠李糖苷酶的生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
[0020]取細(xì)麗毛殼菌種按5?20%的接種量接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在25?38°C培養(yǎng)10?30h，控制溶氧在60 %以上，培養(yǎng)即得一級(jí)種子液。
[0021 ]其中，一級(jí)種子培養(yǎng)基的成分為:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化鈉3?5g/L、磷酸二氫銨2?3g/L、硫酸鎂0.5?lg/L、氯化鋅0.2?0.5g/L、丙酸鈣20?30g/L0
[0022]將所述一級(jí)種子液按5?20%的接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中，在25?38°C培養(yǎng)10?30h，控制溶氧在60%以上，培養(yǎng)即得二級(jí)種子液。
[0023]其中，二級(jí)種子培養(yǎng)基的成分為:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化鈉3?5g/L、磷酸二氫銨2?3g/L、硫酸鎂0.5?lg/L、氯化鋅0.2?0.5g/L、丙酸鈣20?30g/L0
[0024]將所述二級(jí)種子液按5?20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25?38°C培養(yǎng)40?55h，控制溶氧在60%以上，得到混合培養(yǎng)基，后按每升混合培養(yǎng)基添加5?1g蔗糖的比例添加蔗糖，并開(kāi)始按每升混合培養(yǎng)基流加橘皮苷0.5?5g/小時(shí)的比例添加橘皮苷，同時(shí)控制pH為4.5?5.5，培養(yǎng)70?96h后即得酶活達(dá)到500U/mL以上的鼠李糖苷酶發(fā)酵液。
[0025]其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:橘皮苷60?80g/L、酵母抽提物10?15g/L、氯化鈉3?5g/L、磷酸二氫銨2?3g/L、硫酸鎂0.5?lg/L、氯化鋅0.2?0.5g/L、丙酸鈣20?30g/L0
[0026]優(yōu)選的，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化鈉3g/L、磷酸二氫銨3g/L、硫酸鎂I g/L、氯化鋅0.2g/L、丙酸鈣20g/L。
[0027]控制pH值步驟為:通過(guò)添加氨水的方式控制pH為5.0?5.5。
[0028]上述中控制溶氧的方法都為:在培養(yǎng)過(guò)程中，調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速或通入無(wú)菌空氣控制溶氧在60%以上。
[0029]將鼠李糖苷酶發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾，除去菌體及其他微小顆粒，后對(duì)濾液超濾濃縮，直至得到酶活達(dá)到1250U/mL以上的鼠李糖苷酶酶液。
[0030]優(yōu)選的，將鼠李糖苷酶發(fā)酵液通過(guò)板框過(guò)濾方法，除去菌體及其他微小顆粒。
[0031]將鼠李糖苷酶酶液以淀粉為載體，進(jìn)行噴霧干燥，即可得到酶活達(dá)到3500U/mL以上的固體鼠李糖苷酶。
[0032]噴霧干燥方法的優(yōu)點(diǎn)為:生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)能力大，且產(chǎn)品質(zhì)量高。淀粉作為載體可以充當(dāng)鼠李糖苷酶的保護(hù)劑，減少儲(chǔ)存過(guò)程中的損失。
[0033]在鼠李糖苷酶發(fā)酵生產(chǎn)中，蔗糖作為菌體利用的碳源，可以使發(fā)酵緩慢持續(xù)進(jìn)行，橘皮苷作為鼠李糖苷酶生產(chǎn)的誘導(dǎo)物，其代謝產(chǎn)物鼠李糖會(huì)阻礙鼠李糖苷酶的合成。為此，本發(fā)明在發(fā)酵初期，在發(fā)酵培養(yǎng)基中降低蔗糖和橘皮苷的加量，控制菌體生長(zhǎng)速度，防止發(fā)酵后期菌體生長(zhǎng)后勁不足，及防止鼠李糖的大量累積，阻礙鼠李糖苷酶的合成；同時(shí)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加丙酸鈣既可以作為孢子附著的載體，有利于細(xì)麗毛殼菌的生長(zhǎng)，又可以抑制雜菌的產(chǎn)生，有效緩解PH下降過(guò)快，減輕鼠李糖的阻礙作用。到發(fā)酵中期，發(fā)酵液中蔗糖和橘皮苷的濃度下降，此時(shí)流加蔗糖和橘皮苷既可以維持菌體的生長(zhǎng)，又可以持續(xù)誘導(dǎo)鼠李糖苷酶的合成。
[0034]本發(fā)明的鼠李糖苷酶的生產(chǎn)方法工藝簡(jiǎn)單、操作容易、生產(chǎn)效率高，且生產(chǎn)的鼠李糖苷酶活力高，穩(wěn)定性好，易于儲(chǔ)存。
[0035]下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
[0036]實(shí)施例1
[0037]—種鼠李糖苷酶的生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
[0038](I)取細(xì)麗毛殼菌種按5%的接種量接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在38°C培養(yǎng)30h，控制溶氧在60 %以上，培養(yǎng)即得一級(jí)種子液。
[0039]其中，一級(jí)種子培養(yǎng)基的成分為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化鈉3g/L、磷酸二氫銨3g/L、硫酸鎂I g/L、氯化鋅0.2g/L、丙酸鈣20g/L。
[0040](2)將所述一級(jí)種子液按5的接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中，在38°C培養(yǎng)30h，控制溶氧在60 %以上，培養(yǎng)即得二級(jí)種子液。
[0041 ]其中，二級(jí)種子培養(yǎng)基的成分為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物15g/L、氯化鈉3g/L、磷酸二氫銨3g/L、硫酸鎂I g/L、氯化鋅0.2g/L、丙酸鈣20g/L。
[0042](3)將所述二級(jí)種子液按20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25°C培養(yǎng)40h，控制溶氧在60%以上，得到混合培養(yǎng)基，后按每升混合培養(yǎng)基添加5g蔗糖的比例添加蔗糖，并開(kāi)始按每升混合培養(yǎng)基流加橘皮苷5g/小時(shí)的比例添加橘皮苷，同時(shí)控制pH為4.5，培養(yǎng)96h后即得酶活達(dá)到500U/mL以上的鼠李糖苷酶發(fā)酵液。
[0043]其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:橘皮苷60g/L、酵母抽提物10g/L、氯化鈉5g/L、磷酸二氫銨3g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鋅0.5g/L、丙酸鈣30g/L。
[0044](4)將鼠李糖