利用廉價(jià)豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)dha的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用廉價(jià)豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的廉價(jià)氮源為豆柏水解液，且其總氮含量等于發(fā)酵時(shí)微生物所需的總氮含量。按照本發(fā)明配置的培養(yǎng)基與常規(guī)培養(yǎng)基發(fā)酵能力相當(dāng)。通過本發(fā)明提供的利用廉價(jià)氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，減少了酵母粉用量，降低了裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的生產(chǎn)成本。
【專利說明】利用廉價(jià)豆粕為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種利用廉價(jià)豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA 的方法。

【背景技術(shù)】：
[0002] 二十二碳六烯酸（22 : 6n_3) (DHA)是一種重要的ω-3系列多不飽和脂肪酸 (c〇-3polyunsaturated fatty acids),具有促進(jìn)嬰幼兒智力和視力發(fā)育、預(yù)防心血管疾 病、抗癌、抗炎、增強(qiáng)免疫力等功效。深海魚油是ω-3多不飽和脂肪酸的傳統(tǒng)主要來源，但 是存在著諸多問題，例如品質(zhì)不穩(wěn)定、外源性污染、氣味不良、純化成本高等，魚油中含有 的EPA和膽固醇也使其不適于添加入孕嬰食品中。相反，微生物油脂（single cell oils, SC0)不但容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)還克服了傳統(tǒng)魚油普遍存在受地域和氣候條件制約的 問題，應(yīng)用前景廣闊。
[0003] 裂殖壺菌（Schizochytrium)屬于破囊壺菌科的一類海洋微藻，是目前工業(yè)化生 產(chǎn)DHA的理想物種之一。裂殖壺菌胞內(nèi)可積累大量脂肪，且70%以甘油三酯形式存在，其中 DHA可以占到總脂肪酸的35?45 %。同時(shí)，裂殖壺菌油脂還含有許多生理活性物質(zhì)，如色素 (β-胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素等）、角鯊烯和甾醇等。Schizochytrium藻油的安全性已得 到美國FDA認(rèn)可，2012年3月我國衛(wèi)生部出臺(tái)了《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB14880-2012， 批準(zhǔn)Schizochytrium藻油DHA可用于嬰幼兒配方食品。
[0004] 裂殖壺菌屬于異養(yǎng)型微生物，酵母浸膏、酵母粉、蛋白胨和豆柏都是裂殖壺菌發(fā)酵 生產(chǎn)DHA的良好氮源，其中酵母浸膏為最適氮源。傳統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)藻油DHA主要應(yīng)用酵母 浸膏，但是生產(chǎn)1噸DHA油脂大約需要消耗0. 127噸酵母浸膏，使得當(dāng)前藻油DHA的生產(chǎn)成 本非常高。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本部分的目的在于概述本發(fā)明的實(shí)施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實(shí)施 例。在本部分以及本申請(qǐng)的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會(huì)做些簡化或省略以避免使本部 分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。
[0006] 鑒于上述和/或現(xiàn)有利用氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法中存在的問題，提出 了本發(fā)明。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)目的是提供一種利用廉價(jià)豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方 法，使得該方法可以以廉價(jià)氮源替代或減少酵母粉等昂貴氮源的用量，以降低DHA的生產(chǎn) 成本。
[0008] 在了解目前氮源使用情況以及成本后，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種利用廉價(jià)豆柏 為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，包括利用廉價(jià)氮源配制發(fā)酵培養(yǎng)基、接入種子液發(fā) 酵培養(yǎng)制備DHA，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的廉價(jià)豆柏為氮源，且其總氮含量等于發(fā) 酵時(shí)微生物所需的總氮含量。
[0009] 作為本發(fā)明所述利用廉價(jià)豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法的一種優(yōu)選 方案，其中：所述種子培養(yǎng)基包括葡萄糖、酵母浸膏、谷氨酸鈉、Na 2S04、KH2P04、MgSO4 · 7H20、 VB1JB6JB12q
[0010] 作為本發(fā)明所述利用廉價(jià)豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法的一種優(yōu)選 方案，其中：所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖、酵母浸膏、谷氨酸鈉、Na 2S04、KH2P04、MgSO4 · 7H20、 VB1JB6JB12q
[0011] 作為本發(fā)明所述利用廉價(jià)豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法的一種優(yōu)選 方案，其中：所述利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺菌種子液的步驟是將裂殖壺菌以5-10%的接 種量接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25-30°C，pH值為6-8,轉(zhuǎn)速為180-220rpm，振蕩培養(yǎng)時(shí) 間為3-5天。
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)即在于選擇了廉價(jià)的氮源來代替現(xiàn)有技術(shù)的DHA發(fā)酵常規(guī)培 養(yǎng)基中的氮源。而常規(guī)的氮源通常是酵母浸膏、酵母粉、蛋白胨等價(jià)格昂貴的氮源。而本發(fā) 明通過對(duì)豆柏進(jìn)行預(yù)處理、水解得到其水解液，并考察廉價(jià)氮源對(duì)發(fā)酵的影響，廉價(jià)氮源與 酵母浸膏的聯(lián)用對(duì)發(fā)酵的影響。根據(jù)廉價(jià)氮源的特性進(jìn)行預(yù)處理和水解，然后根據(jù)微生物 生長所需的總氮含量加入與之總氮含量相等的氮源或者氮源水解液，或者加入氮源與酵母 浸膏的混合物，替代了傳統(tǒng)的高價(jià)氮源，實(shí)現(xiàn)了同樣產(chǎn)率的DHA的發(fā)酵生產(chǎn)。
[0013] 利用本發(fā)明的方法，碳源及其他無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分與常規(guī)培養(yǎng)基完全相同，并且 在相同的發(fā)酵條件下進(jìn)行微生物發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明按照本發(fā)明配制的培養(yǎng)基與常規(guī)培養(yǎng) 基發(fā)酵能力相當(dāng)。通過本發(fā)明提供的利用廉價(jià)豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法， 減少了酵母浸膏的用量，降低了 DHA生產(chǎn)成本。
[0014] 其中，本發(fā)明所述的豆柏水解液的制備方法為：
[0015] (1)磷酸預(yù)處理；
[0016] (2)酶水解處理后，離心得到的上清液。
[0017] 其中所述的磷酸預(yù)處理方法是指：將豆柏粉按固液質(zhì)量比1 : 10制成豆柏粉水溶 液，在豆柏粉水溶液中按33. 3 μ L/g干物料加入85%的磷酸于90°C下預(yù)處理lOmin。
[0018] 所述的酶水解處理是指：用2mol/LNaOH溶液將磷酸預(yù)處理之后的豆柏粉溶液的 pH調(diào)至8. 0,按4. 17mg/g干物料加入堿性蛋白酶（諾維信公司生產(chǎn)），于55°C下水解24h。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)有益效果在于豆柏是油脂加工行業(yè)主要的副產(chǎn)物，含有豐富的蛋 白、氨基酸以及B族維生素等微生物生長所需的營養(yǎng)成分，可以減少酵母浸膏、酵母粉、蛋 白胨等昂貴氮源的用量，并且價(jià)格低廉，來源廣泛，能有效地降低DHA的生產(chǎn)成本。

【具體實(shí)施方式】：
[0020] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說明。
[0021] 在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以 采用其他不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的 情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施例的限制。
[0022] 其次，此處所稱的" 一個(gè)實(shí)施例"或"實(shí)施例"是指可包含于本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)現(xiàn) 方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的"在一個(gè)實(shí)施例中"并非均 指同一個(gè)實(shí)施例，也不是單獨(dú)的或選擇性的與其他實(shí)施例互相排斥的實(shí)施例
[0023] 實(shí)施例1 ::利用酵母浸膏單一氮源發(fā)酵生產(chǎn)DHA
[0024] 裂殖壺菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖50g/L、酵母浸膏3g/L、谷氨酸鈉5g/L、Na2S0 415g/L、 KH2P043g/L、MgSO4 · 7H20 3g/L、VB1O. 005g/L、VB6O. 002g/L、VB12O. 005g/L。
[0025] 裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖l〇〇g/L、酵母浸膏5g/L、谷氨酸鈉15g/L、Na2S0 415g/ L、KH2P043g/L、MgSO4 · 7H20 3g/L、VB1O. 008g/L、VB6O. 002g/L、VB12O. 008g/L。
[0026] 種子培養(yǎng)兩代，每代在裝液量50mL/250mL三角瓶中進(jìn)行，接種量8% (V/V)，25°C、 200rpm下?lián)u床培養(yǎng)48h。第二代種子按8% (V/V)的接種量接入裝液量50mL/250mL三角瓶 中，發(fā)酵條件為25°C、200rpm。
[0027] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示：
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 一種利用廉價(jià)豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，包括利用廉價(jià)氮源配制發(fā) 酵培養(yǎng)基、接入種子液發(fā)酵培養(yǎng)制備DHA，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中的廉價(jià)豆柏為氮 源，且其總氮含量等于發(fā)酵時(shí)微生物所需的總氮含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用廉價(jià)豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，其特征 在于所述的豆柏水解液的制備方法為： (1) 磷酸預(yù)處理； (2) 酶水解處理后，離心得到的上清液。
3. 據(jù)權(quán)利要求2所述的利用廉價(jià)豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，其特征在 于所述的步驟（1)的磷酸預(yù)處理方法是指：將豆柏粉按固液質(zhì)量比1 : 10制成豆柏粉水溶 液，在豆柏粉水溶液中按33. 3 μ L/g干物料加入85%的磷酸于90°C下預(yù)處理lOmin。
4. 據(jù)權(quán)利要求2所述的利用豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于所 述的步驟（2)的酶水解處理方法是：用2mol/LNaOH溶液將磷酸預(yù)處理之后的豆柏粉溶液的 pH調(diào)至8. 0,按4. 17mg/g干物料加入堿性蛋白酶，于55°C下水解24h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用豆柏為氮源發(fā)酵裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于 所述的廉價(jià)氮源是豆柏水解液或豆柏水解液與酵母浸膏聯(lián)用的混合物。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104212846SQ201410427324
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】朱蓓薇, 寧超美, 龔韌, 陳振宇, 常明, 劉冬英 申請(qǐng)人:青島海智源生命科技有限公司