多點(diǎn)突變單管快速檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了多點(diǎn)突變單管快速檢測方法及試劑盒。多點(diǎn)突變單管快速檢測方法，包括：1）設(shè)計ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針；2）將ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針與熱啟動快速Taq酶系統(tǒng)混合，擴(kuò)增；3）檢測反應(yīng)體系的熒光變化，確定是否存在點(diǎn)突變。本發(fā)明的發(fā)明，操作簡單，可以定性檢測出多點(diǎn)突變的存在。本發(fā)明的檢測方法中使用的引物設(shè)計難度低，大幅降低了引物合成的成本；克服了現(xiàn)有ARMS技術(shù)的局限性，大大提高了其檢測通量；實(shí)現(xiàn)了1管反應(yīng)取代了之前的多管檢測，節(jié)省人力物力。
【專利說明】多點(diǎn)突變單管快速檢測方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種突變檢測試劑盒，特別涉及一種EGFR多點(diǎn)突變單管快速檢測試 劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 點(diǎn)突變與許多腫瘤有著密切的關(guān)系，已有研究表明，某些基團(tuán)位點(diǎn)的點(diǎn)突變會使 腫瘤的發(fā)生率大幅提高。以表皮生長因子受體（EGFR)為例，EGFR是一種人細(xì)胞膜表面的 糖蛋白受體，該基因位于人類7號染色體，由28個外顯子組成。EGFR具有酪氨酸激酶活性， 是原癌基因 c-erbBl的表達(dá)產(chǎn)物，其酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18-24編碼。EGFR主要通 過RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信號通路和PI3K-PDK信號通路將胞外信號轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號，從 而對細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡產(chǎn)生作用。
[0003] 肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌的80%，而我國NSCLC患者中50 %以上存在EGFR基因 體細(xì)胞突變?，F(xiàn)有研究表明EGFR基因突變存在多種形式，部分突變與EGFR酪氨酸激酶抑 制劑如吉非替尼和厄洛替尼的有效相關(guān)，部分突變與EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐藥相關(guān)。 因此，在使用酪氨酸激酶抑制劑進(jìn)行靶向治療前，2011年NCCN《非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指 南（中國版）》推薦進(jìn)行EGFR基因突變檢測，從而基于患者腫瘤DNA中EGFR基因的突變狀 態(tài)來指導(dǎo)臨床制定合適的治療方案。
[0004] 由于EGFR基因藥物敏感的突變點(diǎn)眾多，常見的如下表所示：

【權(quán)利要求】
1. 多點(diǎn)突變單管快速檢測方法，包括如下步驟： 1) 設(shè)計針對不同點(diǎn)突變的ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針 及其淬滅探針；其中，中介連接引物由通用序列部分和特異序列部分構(gòu)成，通用序列部分與 通用熒光探針部分序列互補(bǔ)，特異序列部分與點(diǎn)突變下游的部分序列互補(bǔ)； 2) 將ARMS引物及對應(yīng)的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針與熱啟 動快速Taq酶系統(tǒng)混合，擴(kuò)增； 檢測反應(yīng)體系的熒光變化，確定是否存在點(diǎn)突變。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多點(diǎn)突變單管快速檢測方法，其特征在于：通用熒光探針上 連接熒光基團(tuán)的核苷酸和淬滅探針上連接淬滅基團(tuán)的核苷酸在互補(bǔ)配對后的間距不超過4 個核苷酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多點(diǎn)突變單管快速檢測方法，其特征在于：中介連接引 物中與突變位點(diǎn)下游的部分序列互補(bǔ)的核酸數(shù)量不少于5 bp。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多點(diǎn)突變單管快速檢測方法，其特征在于：中介連接引物中 與突變位點(diǎn)下游的部分序列互補(bǔ)的核酸數(shù)量為15?30bp。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或4所述的多點(diǎn)突變單管快速檢測方法，其特征在于：中介連接 引物中與通用熒光探針部分核酸互補(bǔ)配對的核酸數(shù)量不少于5 bp。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多點(diǎn)突變單管快速檢測方法，其特征在于：中介連接引物中 與通用熒光探針部分核酸互補(bǔ)配對的核酸數(shù)量為15?45bp。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或6所述的多點(diǎn)突變單管快速檢測方法，其特征在于：通用熒 光探針的一端連接有保護(hù)核酸序列。
8. -種EGFR多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，包括DNA提取液，熱啟動快速Taq酶系統(tǒng) 和EGFR突變檢測引物，其特征在于：所述EGFR突變檢測引物由多組ARMS引物及對應(yīng)的下 游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針組成；其中： 中介連接引物的一端序列與待EGFR突變位點(diǎn)下游的部分序列互補(bǔ)，另一端序列與通 用熒光探針部分核酸互補(bǔ)配對。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的EGFR多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，其特征在于：ARMS引物 的序列如下： ARMS 引物 1 :TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA ARMS 引物 2 :TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT ARMS 引物 3 :CAAAAAGATCAAAGTGCTGGC ARMS 引物 4 :TTCCCGTCGCTATCAAAACATC ARMS 引物 5 :TTCCCGTCGCTATCAAAACATC ARMS 引物 6 :TTCCCGTCGCTATCAAAACATC ARMS 引物 7 :TCCCGTCGCTATCAAGTCT ARMS 引物 8 :CCGTCGCTATCAAGGTACA ARMS 引物 9 :CGTCGCTATCAAGGCATCTC ARMS 引物 10 :TCCCGTCGCTATCAAGTCT ARMS 引物 11 :CCGTCGCTATCAAGGAGC ARMS 引物 12 :CCGTCGCTATCAAGGAGC ARMS 引物 13 :CCGTCGCTATCAAGGATCC ARMS 引物 14 :CCGTCGCTATCAAGGAAGC ARMS 引物 15 :CCGTCGCTATCAAGGAACC ARMS 引物 16 :CCGTCGCTATCAAGGAACC ARMS 引物 17 :CGTCGCTATCAAGGAATCTC ARMS 引物 18 :CCGTCGCTATCAAGGAACC ARMS 引物 19 :CCGTCGCTATCAAGGAACAG ARMS 引物 20 :GTCGCTATCAAGGAATCATC ARMS 引物 21 :CGTCGCTATCAAGGAATCTC ARMS 引物 22 :GTCGCTATCAAGGAATTCGA ARMS 引物 23 :AGCCTACGTGATGGCCAT ARMS 引物 24 :CCAGCGTGGCCAGCGT ARMS 引物 25 :CCAGCGTGGACGGTAAC ARMS 引物 26 :GACAATTCCCACCACGTGT ARMS 引物 27 :CACCGTGCAGCTCATCAT ARMS 引物 28 :AGATCACAGACTTTGGGCG ARMS 引物 29 :GTTGGGCTGGCCAAACA ; ARMS引物1和2對應(yīng)的下游引物為Y1 :AGACCATGAGAGGCCCTG ; ARMS 引物 3 對應(yīng)的下游引物為 Y2 :AGATGATGGAAATATACAGCTTGC ; ARMS引物4?19對應(yīng)的下游引物為Y3 :TGTGGAGATGAGCAGGGT ; ARMS引物20?27對應(yīng)的下游引物為Y4 :TTGTCTTTGTGTTCCCGGA ; ARMS引物28和9對應(yīng)的下游引物為Y5 :GGCTGACCTAAAGCCACC ; ARMS 引物 1 ?3 對應(yīng)的中介引物為 Z1 :ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCGGTGCGTTCGGCACGGT GTATA ； ARMS 引物 4 ?22 對應(yīng)的中介引物為 Z2 :ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCATGGCTCTGAACCTCA ; ARMS 引物 23 ?27 對應(yīng)的中介引物為 Z3 :ACCTCGTTCTGGGCTCTACCTGCCTCCTGGACTATG ; ARMS 引物 28 和 9 對應(yīng)的中介引物為 Z4 :ACCTCGTTCTGGGCTCTACCCATGCAGAAGGAGGCAA。 10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的EGFR多點(diǎn)突變單管快速檢測試劑盒，其特征在于：通 用熒光探針的序列為：TC (dT- FAM) GCGGTGTTGGTGTAGAGCCCAGAACGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTT T，對應(yīng)的淬滅序列為：5' -BHQ-CCGCAGA-3'。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293913SQ201410429506
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】陳華云, 陳嘉昌, 肖湘文, 丁渭, 劉淑園, 湯鏈, 張?zhí)旌? 申請人:廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司