新的半乳凝素9 突變體蛋白質(zhì)及其用途
【專利摘要】以大腸桿菌作為宿主生產(chǎn)的重組體半乳凝素9表明通過對腫瘤細胞的直接作用(誘導腫瘤細胞的細胞間粘附與凋亡的活性)和借助于免疫系的作用，具有抑制癌的轉(zhuǎn)移和誘導萎縮，而且對非活化淋巴細胞沒有作用，誘導活化T細胞、特別是成為過剩免疫反應原因的CD4陽性T細胞的凋亡，以及對與風濕病中關節(jié)的變形等有關的滑膜細胞具有很強的誘導凋亡能力，重組體半乳凝素9由于連接兩個CRD的連接區(qū)對蛋白水解酶的敏感性提高，所以非常容易被酶消化，喪失上述活性，為了進一步研究需要更穩(wěn)定型的分子。通過改變連接半乳凝素9的兩個CRD的連接區(qū)，可得到避免對上述活性造成惡影響，而且穩(wěn)定性提高的改變分子。
【專利說明】新的半乳凝素9突變體蛋白質(zhì)及其用途
[0001] 本申請是申請?zhí)?00580010446. 1，申請日2005年3月29日同名申請的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及到新型半乳凝素9突變體（突變體）蛋白質(zhì)及其用途。本發(fā)明特別涉 及到連接區(qū)域被改變的半乳凝素9以及利用該半乳凝素9的生物化學、臨床檢查、醫(yī)療以及 藥物應用技術。

【背景技術】
[0003] 特定的糖鏈和與之結合的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出在哺乳動物的生物體內(nèi)伴隨生理現(xiàn)象以 及進化?成長的現(xiàn)象，以及在各種各樣疾病等中起到多種多樣作用和功能的證據(jù)正在被人 們發(fā)現(xiàn)。人們發(fā)現(xiàn)在生物體中存在著特異識別帶有3 -半乳糖苷結構的糖鏈的動物凝集 素，作為這樣的凝集素類的半乳凝素，目前至少有14種基因被鑒定。半乳凝素家族根據(jù) 其結構分為三個亞類、即原型（prototype)、嵌合型（chimera)、以及串聯(lián)重復型（tandem repeat)、它們在生物體內(nèi)的功能幾乎不清楚。特別是有關具有兩個糖鏈識別結構域的串聯(lián) 重復型半乳凝素，由于研究的歷史短，作為它的靶的生物體內(nèi)糖鏈（受體）還不清楚，所以 其功能沒有闡明?？墒牵鶕?jù)對識別細胞表面的復雜的糖鏈的蛋白質(zhì)進行探索發(fā)現(xiàn)等的經(jīng) 過，預想半乳凝素具有與細胞的粘附、細胞間的信息傳遞、細胞的活化等有關的功能，而引 人注目。另外除了這樣的功能之外，預想還具有其它重要的各種各樣功能的那樣的研究成 果也正在獲得。
[0004] 作為串聯(lián)重復型半乳凝素之一的半乳凝素9在人中，最初是作為霍奇金病患者的 自身抗原（autoantigen)被鑒定的（非專利文獻1和2)，人們想像它是否在免疫細胞間的 相互作用中起著重要的作用。小鼠的半乳凝素9可以通過使用以被認為在半乳凝素類的 糖鏈識別結構域中保守性高的序列為基礎設計的簡并引物的5' -RACE PCR，從小鼠腎臟的 cDNA文庫克?。ǚ菍＠墨I3)。人們發(fā)現(xiàn)用抗原刺激的人T細胞在體內(nèi)和體外產(chǎn)生作為嗜 酸性細胞趨化因子的ecalectin,而且該ecalectin與目前已知的其它嗜酸性細胞趨化因 子類雖然結構上不同，但也可以歸屬于半乳凝素家族，具有對帶有P -半乳糖苷結構的糖 鏈的結合親和性。從來自于人T細胞的白血病細胞株得到的mRNA成功地克隆了 ecalectin， 結果確認ecalectin是半乳凝素9的變異體之一，半乳凝素9與ecalectin是同一物質(zhì)（非 專利文獻4)。
[0005] 作為野生型半乳凝素9,現(xiàn)在已報告了 L型半乳凝素9(galectin_91ong isoform or long type galectin-9:Gal_9L)、M 型半乳凝素 9 (galectin_9medium isoform or medium type galectin-9:Gal_9M)以及 S 型半乳凝素 9(galectin_9short isoform or short type galectin-9:Gal_9S)。無論那一種半乳凝素9都由兩個糖鏈識別部位（糖識 別結構域，carbohydrate recognition domain:CRD)和連接兩個部位的連接肽區(qū)構成，已 知L型半乳凝素9含有最長的連接肽區(qū)，通過該連接肽區(qū)，N端結構域（NCRD)和C端結構域 (CCRD)被連接在一起，而S型半乳凝素9含有最短的連接肽區(qū)，M型半乳凝素9含有介于兩 者之間長度的連接肽區(qū)，發(fā)現(xiàn)通常存在于比前二者更廣的生物體內(nèi)組織或細胞中。另外在 由人細胞或組織克隆的半乳凝素9基因之間也可以看到表示遺傳多態(tài)現(xiàn)象的存在的證據(jù)。
[0006] 野生型半乳凝素9由二個糖識別部位（CRD)和連接兩個部位的連接區(qū)構成，以大 腸桿菌作為宿主生產(chǎn)的重組體半乳凝素9表明通過對腫瘤細胞的直接作用（誘導腫瘤細胞 的細胞間粘附和凋亡的活性）和借助于免疫系統(tǒng)的作用，抑制癌轉(zhuǎn)移和誘導萎縮。另外半 乳凝素9不作用于非活化淋巴細胞，而誘導活化T細胞、特別是誘導成為過度免疫反應原因 的⑶4陽性T細胞的凋亡也已闡明。另外也闡明了對與風濕病中關節(jié)變形等有關的滑膜細 胞具有很強的誘導凋亡能力。
[0007] 【非專利文獻1】3&11；[11，11.6七31.，？1'0。.^1:1.六。3(1.3。;[. USA,92, 11810-11813(1995)
[0008] 【非專利文獻 2 】Tureci, 0? et al.，J. Biol. Chem.，272 (10)，6416-6422 (1997)
[0009] 【非專利文獻 3 】Wada, J. et al.，J. Biol. Chem.，272 (9)，6078-6086 (1997)
[0010] 【非專利文獻 4】Matsumoto，R.et a I . , J . Biol. Chem.，273(27)，16976-16984(1998)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 通過利用這樣的半乳凝素9的多方面的作用，預期可治療癌、難治的自身免疫疾 患（包括風濕?。?、變態(tài)性疾患等。然而重組體半乳凝素9由于連接兩個CRD的連接區(qū)對蛋 白水解酶敏感性高，非常容易被酶消化，喪失上述活性。
[0012] 本
【發(fā)明者】等進行了專心研究，結果通過對一方面保持半乳凝素9具有的糖鏈識別 活性，一方面對蛋白水解酶表現(xiàn)出更穩(wěn)定的分子結構進行探索，改變半乳凝素9的連接兩 個CRD的連接區(qū)，成功地獲得了避免對上述那樣的活性帶來壞影響，穩(wěn)定性提高的改變分 子，完成了本發(fā)明。
[0013] 本發(fā)明提供以下內(nèi)容。
[0014] (1)蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是半乳凝素9或與其具有基本上同等活性的蛋白質(zhì)的 連接肽或其附近的區(qū)域被改變。
[0015] (2)上述⑴所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是：由在半乳凝素9或基本上具有與半 乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì)的連接肽或其附近區(qū)域的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 1 個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成，與半乳凝素9比較，至少對于連接肽的分解敏感 性被改變。
[0016] (3)上述（1)或（2)所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是：基本上具有與半乳凝素9同 等活性的蛋白質(zhì)與半乳凝素9的氨基酸序列至少具有70%以上同源性。
[0017] (4)上述（1)?（3)中任一項所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是：（1)具有半乳凝素 9的N末端側的糖鏈識別區(qū)域（NCRD)或與該區(qū)域具有基本上同等活性的多肽與（2)具有半 乳凝素9的C末端側的糖鏈識別區(qū)域（CCRD)或與該區(qū)域具有基本上同等活性的多肽借助 于⑶在半乳凝素9的連接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1個或1個以上的氨基 酸的氨基酸序列構成的改變連接肽連接。
[0018] (5)上述⑴?⑷任一項所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是：（1)具有序列3所示 的氨基酸序列的多肽或與它具有基本上同等活性，且具有與序列3所示的氨基酸序列至少 70%以上同源性的氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代 或添加1?8個氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽和（2)具有序列4所示的氨基酸序列的多 肽或與它具有基本上同等活性，且具有與序列4所示的氨基酸序列至少70%以上同源性的 氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1?21個氨 基酸殘基的氨基酸序列的多肽借助于（3)在序列7?9中任一個序列表示的氨基酸序列中 缺失（但是，序列7中的1?32以及1?44的缺失、和序列8中1?12的缺失除外）、取 代或添加1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成的改變連接肽連接。
[0019] (6) -種核酸，其特征是具有編碼上述（1)?（5)任一項所述的蛋白質(zhì)的堿基序 列。
[0020] (7)上述（6)所述的核酸，其特征是聚核苷酸。
[0021] (8)上述（6)或（7)所述的核酸，其特征是DNA或RNA。
[0022] (9) 一種重組載體，其特征是含有上述￠)?（8)任一項所述的核酸。
[0023] (10)上述（9)所述的重組載體，其特征是除了含有上述（6)?（8)任一項所述的 核酸外，還含有編碼標記蛋白質(zhì)和/或膚的喊基序列。
[0024] (11) -種轉(zhuǎn)化體,其特征是含有上述（6)?⑶任一項所述的核酸或上述（9)或 (10)所述的重組載體。
[0025] (12)上述（11)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征是：轉(zhuǎn)化體宿主細胞是原核細胞或真核細 胞。
[0026] (13) -種藥物，其特征是：作為有效成分含有從上述（1)?（5)中任一項所述的 蛋白質(zhì)、上述（6)?（8)中任一項所述的核酸、上述（9)或（10)所述的重組載體和上述（11) 或12所述的轉(zhuǎn)化體中選擇的成分。
[0027] (14)上述（13)所述的藥物，其特征是免疫調(diào)節(jié)劑。
[0028] (15)上述（13)所述的藥物，其特征是抗腫瘤藥。
[0029] (16)上述（15)所述的藥物，其特征是抗來自于包含腦腫瘤（多形性惡性膠質(zhì)瘤 等）、脊髓腫瘤、上顎洞癌、胰液腺癌、齒肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉頭 癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、肺癌、胸膜腫瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大腸 癌、膽管癌、膽囊癌、胰臟癌、肝癌、腎臟癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、精巢腫瘤、腎上腺癌、 子宮頸癌、子宮體癌、陰道癌、外陰癌、卵巢癌、纖毛上皮瘤、惡性骨腫瘤、軟部肉瘤、乳癌、皮 膚癌、惡性黑色素瘤、基底細胞瘤、白血病、伴隨骨髓化性的骨髓纖維癥、惡性淋巴瘤、惡性 淋巴肉芽腫病、漿細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等癌和肉瘤的腫瘤的抗腫瘤藥。
[0030] (17)上述（13)所述的藥物，其特征是該藥物是針對下面疾患或疾病、或病的癥狀 的藥物：
[0031] (A)炎癥性疾患，來自于在各臟器中發(fā)生的各種急性和慢性炎癥、變態(tài)性和自身免 疫性炎癥、感染癥等中的疾?。?br> [0032] (B)急性和慢性疾患，來自于包括支氣管炎、支氣管肺炎、間質(zhì)性肺炎、肺炎、細支 氣管炎、急性縱隔炎的肺的疾患、包括心外膜炎、心內(nèi)膜炎、心肌炎、口內(nèi)炎、口角炎、扁桃 炎、咽炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、蟲垂炎、缺血性大腸炎、 藥物性大腸炎、直腸炎在內(nèi)的肺以外的其它臟器的疾患、包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、 重癥肝炎、急性和慢性肝炎以及肝硬變、膽囊炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性和慢性腎 炎、膜性腎炎、絲球體腎炎、IgA腎癥、各種膀胱炎、腦髓炎、乳腺炎、皮炎、表層角膜炎、干性 角結膜炎、中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸、牙肉炎、牙周炎、牙周圍炎在內(nèi)的炎癥等疾??；
[0033] (C)來自于神經(jīng)性炎癥（例如、神經(jīng)性胃炎、神經(jīng)性膀胱炎等）、癌或伴隨炎癥疼痛 的疾??；
[0034] (D)變態(tài)性炎癥疾患，全身性過敏性、支氣管哮喘、過敏性肺炎、花粉癥、變態(tài)性鼻 炎、變態(tài)性結膜炎、免疫復合體引起的變態(tài)性疾患、血管神經(jīng)性浮腫等在內(nèi)的疾病；
[0035] (E)自身免疫性的炎癥（自身免疫疾患），來自于全身性（慢性關節(jié)風濕病、全身 性紅斑狼瘡、結節(jié)性多發(fā)性動脈炎、強皮癥、多發(fā)性肌炎?皮膚肌炎、肖格倫綜合征（Sjogren syndrome)、貝切特病（Behcet' s syndrome)等）、神經(jīng)系（多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力癥、 HAM(HTLV-1脊髓癥）、肌萎縮性側索硬化癥等）、內(nèi)分泌性（巴澤多病、橋本病、1型糖尿病 等）、血液（特發(fā)性血小板減少性紫斑病、自身免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血等）、呼 吸器（結節(jié)病、肺纖維癥等）、消化管（潰瘍性大腸炎、克羅恩病等）、肝臟（自身免疫性肝 炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性硬化性膽管炎、自身免疫性膽管炎等）、腎?尿路系（抗嗜 中性白細胞細胞質(zhì)抗體相關腎炎、血管炎、肺腎綜合征（Goodpasture)、抗絲球體基底膜抗 體病等）等疾?。?br> [0036] (F)感染癥，由于病原體傷害生物體的細胞?組織?臟器產(chǎn)生的疾患、或起因于給 人帶來感染癥的病原體的疾患，病原體來自于1)細菌（包括螺旋體、衣原體、立克次體）、2) 病毒、3)真菌、4)植物（藻類）、5)原蟲、6)寄生蟲（吸蟲、條蟲、線蟲）、7)節(jié)足動物，包括 細菌性感染癥（霍亂、瘟疫、大腸桿菌感染癥等）、螺旋體感染癥（鉤端螺旋體病等）、衣原 體感染癥（鸚鵡病等）、立克次體感染癥（斑疹傷寒、破傷風等）、病毒性感染癥（帶狀皰疹、 病毒性出血熱、狂犬病等）、真菌癥（念珠菌病、隱球菌病、曲霉菌病等）、原蟲性疾患（阿米 巴性痢疾、瘧疾、弓形體病等）、寄生蟲（吸蟲癥、線蟲癥等）、此外還包括支原體感染癥（支 原體肺炎等）、分支桿菌感染癥（結核、非定型抗酸菌癥等）疾?。?br> [0037] (G)皮膚科領域的疾患，i)皮膚感染癥、包括變態(tài)性炎癥和自身免疫性炎癥等在 內(nèi)的皮炎癥，干癬、水皰癥、膿皰癥、角化、角化異常癥等具有特有炎癥的皮膚疾患、ii)來自 于由于美容皮膚科相關的損傷或老化，與a)黑色素代謝調(diào)節(jié)（美白）、b)毛發(fā)成長（生發(fā)） 的調(diào)節(jié)、c)膠原產(chǎn)生調(diào)節(jié)有關的皮膚科領域的疾患（包括老化）；
[0038] (H)生活習慣病，來自于包括高脂血癥、動脈硬化癥、高血壓、糖尿病等在內(nèi)的疾 病；
[0039] (I)有關正常細菌叢的維持的異常；
[0040] (J)來自于包括淀粉樣變性、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松癥、骨折等在內(nèi)的疾病；
[0041] (K)腦、神經(jīng)領域中的炎癥反應，例如伴隨著腦梗塞、心肌梗塞等缺血性病變的進 展出現(xiàn)的炎癥、綜合失調(diào)癥；
[0042] (L)痛風；
[0043] (M)骨質(zhì)疏松癥；或
[0044] (N)間質(zhì)性肺炎。
[0045] (18)分析或檢查試劑，特征是作為有效成分含有選自于上述（1)?（5)中任一項 所述的蛋白質(zhì)、上述（6)?（8)中任一項所述的核酸、上述（9)或（10)所述的重組載體以 及上述（11)或（12)所述的轉(zhuǎn)化體的成分。
[0046] 發(fā)明的效果
[0047] 就半乳凝素 9得到的半乳凝素 9突變體由于與野生型比較對蛋白水解酶穩(wěn)定，可 在半乳凝素9具有的生物體內(nèi)功能的闡明中利用，可在對半乳凝素9在腫瘤化細胞的調(diào)控、 免疫調(diào)節(jié)、以及變態(tài)性和炎癥的控制等各種各樣的生物體反應的調(diào)控?調(diào)節(jié)中起到的功 能?活性進行的研究中使用。另外，該半乳凝素9突變體及其相關物質(zhì)有望用作臨床應用、 分子生物學應用、生物化學應用、醫(yī)學應用中的試藥和活性劑。
[0048] 本發(fā)明的另外的目的、特征、優(yōu)點以及其它觀點通過以下敘述同行人就都明白了。 然而，包括以下的記載以及具體的實施例等記載在內(nèi)的本件說明書的記載是表示本發(fā)明的 理想方式，希望理解為只是為了說明給出的。在本說明書公布的本發(fā)明的意圖以及范圍內(nèi) 進行的各種變化和/或改變（或修飾）通過以下記載以及本說明書的其它部分的知識對于 業(yè)內(nèi)人士容易明白。本說明書中引用的所有專利文獻和參考文獻是為了說明的目的引用， 這些文獻作為本說明書的一部分，其內(nèi)容應當解釋為包括在說明書中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049] 圖1表示半乳凝素9突變體（G9NC(null))表達載體的構建方法。
[0050] 圖2表示半乳凝素9突變體（G9NC(null))表達物以及純化處理物的電泳照片。
[0051] 圖3表示比較野生型半乳凝素9(G9(M))和半乳凝素9突變體（G9NC(null))之間 對蛋白水解酶的耐性的結果。對于純化標準品，存在的大腸桿菌蛋白水解酶的耐性進行了 研究。圖表示電泳照片。
[0052] 圖4表示比較野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體（G9NC(null))之間 對蛋白水解酶的耐性的結果。研究了對基質(zhì)金屬蛋白水解酶-3 (MMP-3)的耐性。圖表示電 泳照片。
[0053] 圖5表示比較野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突變體（G9NC(null))之間 對蛋白水解酶的耐性的結果。研究了對彈性蛋白酶（彈性蛋白酶）的耐性。圖表示電泳照 片。
[0054] 圖6表示在野生型半乳凝素9 (G9 (S))和半乳凝素9突變體（G9NC (null))之間對 生物活性進行比較的結果。研究了對M0LT-4細胞的凋亡誘導活性（DNA梯形成）。圖表示 電泳照片。
[0055] 圖7表示在野生型半乳凝素9 (G9 (S))和半乳凝素9突變體（G9NC (null))之間對 生物活性進行比較的結果。研究了對外周血嗜酸細胞的ECA活性。
[0056] 圖8表示對半乳凝素9EST克隆進行BLAST序列檢索，對來自不同源的各克隆 序列進行比較的結果。通過檢索，各克隆表現(xiàn)出97 - 99%的同源性（同一性）。在 5, 88, 135, 238, 281位置表現(xiàn)出變異。
[0057] 圖9表示酵母多糖誘發(fā)胸膜炎，但就單獨半乳凝素9突變體（h_gal9NC(null))來 說，不誘發(fā)炎癥。
[0058] 圖10表示對半乳凝素9突變體（h_gal9NC(null))在酵母多糖誘導胸膜炎模型中 的效果進行研究的結果。
[0059] 圖11表示對半乳凝素9突變體（Gal-9 = G9NC(null))在PM誘導皮炎（類固醇 敏感性模型）中的效果進行研究的結果。
[0060] 圖12表示對半乳凝素9突變體（Gal-9 = G9NC(null))在花生四烯酸誘導皮炎 (類固醇非敏感性模型）中的效果進行研究的結果。
[0061] 圖13表示對半乳凝素9突變體（Gal-9 = G9NC(null))在辣椒辣素誘導皮炎模型 中的效果進行研究的結果。
[0062] 圖14表示對半乳凝素9突變體（Gal-9 = G9NC(null))在DNFB誘導接觸皮炎模 型中的效果進行研究的結果。
[0063] 圖15表示對半乳凝素9突變體（Gal-9 = G9NC(null))在DNFB誘導接觸皮炎模 型中的效果進行研究的結果。
[0064] 圖16表示對半乳凝素9突變體（Gal-9 = G9NC(null))在FITC誘導特應性皮炎 模型中的效果進行研究的結果。
[0065] 圖17表示對半乳凝素9突變體（Gal-9 = G9NC(null))對于蕁麻疹模型的效果進 行研究的結果。
[0066] 圖18表示對半乳凝素9突變體（Gal-9 = G9NC(null))對于蕁麻疹模型的效果進 行研究的結果。
[0067] 圖19表示對半乳凝素9突變體（h_gal9NC(null))對于關節(jié)炎模型的效果進行研 究的結果。
[0068] 圖20表示半乳凝素 9突變體在皮下移植模型中的抑制腫瘤細胞增殖效果、即表示 抗腫瘤活性（抗癌效果）測定的結果。上段為對照組，下段為半乳凝素9突變體注入組（直 至5周什么樣的腫瘤都沒可見）。
[0069] 圖21是半乳凝素9突變體在皮下移植模型中的抑制腫瘤細胞增殖效果、即表示抗 腫瘤活性（抗癌效果）測定的結果，給出了組織病理解析的組織照片。表示給予LLC+半乳 凝素9突變體（Gal9)(下段）時5周的皮膚。肉眼看為白色調(diào)。
[0070] 圖22表示半乳凝素9突變體（穩(wěn)定化半乳凝素9)在培養(yǎng)腫瘤細胞（Meth A細 胞，24h)中誘導凋亡（細胞損傷活性）的結果。
[0071] 圖23表示半乳凝素9突變體（穩(wěn)定化半乳凝素9)在培養(yǎng)腫瘤細胞（B16/F10細 胞，24h)中誘導凋亡（細胞損傷活性）的結果。
[0072] 圖24是動物的存活曲線，表示在由Meth A細胞引起的癌性腹膜炎模型中，半乳凝 素9突變體具有抗腫瘤效果。
[0073] 圖25表示在由Meth A細胞引起的癌性腹膜炎模型中，未給予半乳凝素9突變體 (Gal9)組（上段）給予組（下段）中小鼠的狀態(tài)的照片。
[0074] 圖26為動物的生存曲線，表示在由B16/F10細胞引起的癌性腹膜炎模型中半乳凝 素9突變體具有抗腫瘤效果。
[0075] 圖27對比半乳凝素9突變體（Gal-9)給予組i非給予組中由B16/F10細胞（黑 素瘤）引起的癌性腹膜炎模型小鼠的狀態(tài)，內(nèi)臟組織（第14天）的照片。
[0076] 圖28表示研究半乳凝素9突變體（穩(wěn)定化半乳凝素9)影響免疫細胞的結果。是 B16/F10腹腔內(nèi)浸潤細胞（24h)的解析結果。
[0077] 圖29表示使用半乳凝素9突變體（穩(wěn)定化半乳凝素9)進行的抑制粘附實驗的結 果。是B16/F10細胞（Ih)的解析結果。圖中、Collagen type I表示I型膠原、Collagen type IV表示IV型膠原、Laminin表示層粘連蛋白、Fibronectin表示纖連蛋白、Vitronectin表 示玻連蛋白。
[0078] 圖30表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在壁虱抗原誘發(fā)哮喘 模型中的作用效果進行測定的結果。
[0079] 圖31表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在壁虱抗原誘發(fā)哮喘 模型中的作用效果進行測定的結果。給出了存在于BALF中的各細胞數(shù)。
[0080] 圖32表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)在壁虱抗原誘發(fā)哮喘模型中的作用效果 進行測定的結果（支氣管周圍組織的照片）。
[0081] 圖33表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在OVA誘發(fā)哮喘模型 (小鼠）中的作用效果進行測定的結果。
[0082] 圖34表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在OVA誘發(fā)哮喘模型 (小鼠）中的作用效果進行測定的結果。給出了存在于BALF中的各細胞數(shù)。
[0083] 圖35表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)影響OVA誘發(fā)哮喘模型（豚鼠）中的即 時型哮喘（IAR) ?延遲型哮喘（LAR)的作用。
[0084] 圖36表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)在OVA誘發(fā)哮喘模型（豚鼠）中的作用 效果進行測定的結果。給出了存在于BALF中的各細胞數(shù)。。
[0085] 圖37表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)在自身免疫性溶血性貧血模型（小鼠） 中的作用效果進行測定的結果（血細胞比容（％ ))。
[0086] 圖38表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在阿蒂斯（Arthus) 反應（血管炎）模型（小鼠）中的作用效果進行測定的結果。
[0087] 圖39表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在ARDS模型（小鼠） 中的作用效果進行測定的結果。
[0088] 圖40表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在ARDS模型（小鼠） 中的作用效果進行測定的結果。給出了存在于BALF中的各細胞數(shù)。
[0089] 圖41表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)在辣椒辣素誘導炎癥模型中的作用效果 進行測定的結果。
[0090] 圖42表示對半乳凝素9突變體（Gal-9)影響破骨細胞形成的效果進行試驗的結 果。表明有抑制效果。
[0091] 圖43表示對通過半乳凝素9突變體（gal-9)刺激產(chǎn)生的單細胞的凋亡誘導 (M-CSF存在下）進行試驗的結果。
[0092] 圖44表示對通過半乳凝素9突變體（gal-9)刺激對人成骨細胞增殖影響的效果 進行試驗的結果。
[0093] 圖45表示對通過半乳凝素9突變體（Galectin-9)刺激（8hr)影響人成骨細胞分 化標志的表達的效果進行試驗的結果。
[0094] 圖46表示存活率，對半乳凝素9突變體對間質(zhì)性肺炎模型的作用進行試驗的結 果。
[0095] 圖47表示對半乳凝素9突變體對間質(zhì)性肺炎模型的作用進行試驗的結果。給出 了存活14天例的肺組織（HE染色、照片）。
[0096] 圖48是動物的生存曲線，表示在LLC細胞（凋亡（+))導致的癌性腹膜炎模型中， 半乳凝素9突變體具有抗腫瘤效果。
[0097] 圖49表示使用B16/F10細胞，研究半乳凝素9突變體對癌轉(zhuǎn)移模型的作用的結果 (模型動物的肺外觀）。
[0098] 圖50表示使用B16/F10細胞，研究半乳凝素9突變體（G9NC(null))對癌轉(zhuǎn)移模 型的作用的結果（對肺的結節(jié)數(shù)進行計數(shù)的結果）。
[0099] 圖51表示對半乳凝素9突變體（gal-9)(靜脈內(nèi)（i. V.)注射）在角叉菜膠誘發(fā) 炎癥模型中的作用效果進行測定的結果。
[0100] 圖52為了比較給出了對作為陽性對照的地塞米松（Dex.)在角叉菜膠誘發(fā)炎癥模 型中的作用效果進行測定的結果。
[0101] 圖53表示使用免疫組織染色對半乳凝素在風濕?。≧A)關節(jié)滑膜中的表達進行研 究的結果。
[0102] 圖54表示對半乳凝素對風濕?。≧A)滑膜細胞凋亡的誘導活性進行研究的光學顯 微鏡觀察的結果。
[0103] 圖55表示用PI法對半乳凝素對風濕?。≧A)滑膜細胞凋亡的誘導活性進行研究 的結果。
[0104] 圖56表示對半乳凝素對風濕?。≧A)滑膜細胞凋亡的誘導活性進行研究的結果。
[0105] 圖57表示對半乳凝素對風濕?。≧A)滑膜細胞增殖的抑制活性進行研究的結果。
[0106] 圖58表示對半乳凝素-9突變體在佐劑性關節(jié)炎模型中的作用（抑制由于機械刺 激引起的疼痛）進行研究的結果。
[0107] 圖59為了比較給出了在佐劑性關節(jié)炎模型中的作用（抑制由于機械刺激引起的 疼痛）進行研究的結果（作為陽性對照的吲哚美辛的作用）。
[0108] 圖60表示對半乳凝素 -9突變體在角叉菜膠誘發(fā)急性炎癥模型中的作用（抑制機 械刺激產(chǎn)生的疼痛）進行研究的結果。
[0109] 圖61為了比較給出了在角叉菜膠誘發(fā)急性炎癥模型中的作用（抑制由于機械刺 激引起的疼痛）進行研究的結果（作為陽性對照的地塞米松的作用）。
[0110] 圖62表示對半乳凝素-9突變體在人關節(jié)液中的穩(wěn)定性進行研究的結果 (SDS-PAGE)。
[0111] 圖63表示對半乳凝素-9突變體（穩(wěn)定化半乳凝素-9)在關節(jié)炎模型（抗體混合 物引起的模型）中的作用進行研究的結果（i.v.注入）。
[0112] 圖64表示半乳凝素-9突變體（穩(wěn)定化半乳凝素-9)在關節(jié)炎模型（膠原關節(jié)炎 模型）中的作用進行研究的結果（i.P.注入）。
[0113] 圖65表示半乳凝素-9突變體（穩(wěn)定化半乳凝素-9)在關節(jié)炎模型（膠原關節(jié)炎 模型）中的作用進行研究的結果（i.v.注入）。
[0114] 圖66表示半乳凝素-9突變體（穩(wěn)定化半乳凝素-9)在關節(jié)炎模型中的作用進行 研究的結果（i.v.注入）。
[0115] 圖67為了比較給出了對在佐劑性關節(jié)炎模型中的作用進行研究的結果（陽性對 照的吲哚美辛的作用）。
[0116] 圖68表示對半乳凝素-9突變體在大鼠CIA(膠原致敏）模型中的作用進行研究 的結果（i.v.注入）。

【具體實施方式】
[0117] 參考到目前為止公開發(fā)表的研究和相關的專利申請，其內(nèi)容都包括在本說明書的 內(nèi)容中。
[0118] 所謂「半乳凝素9突變體」指的是提供對半乳凝素9的糖鏈識別部位含有的特定 糖鏈特異結合的活性或與此類似的活性（本活性中包括定性的活性和/或定量的活性）的 物質(zhì)。半乳凝素9對特定細胞具有凋亡誘導活性，而本半乳凝素9突變體可以是具有野生 型半乳凝素9具有的凋亡誘導活性或具有與它類似的活性的突變體，也可以是半乳凝素9 具有的生物活性被改變或修飾的突變體，對于某些場合更理想。所謂本發(fā)明中特別理想的 半乳凝素9突變體指的是作為具有生物活性的試藥，在臨床檢查領域、分析領域、或醫(yī)學或 藥物等領域中，表現(xiàn)出比野生型半乳凝素9更好的性質(zhì)。
[0119] 半乳凝素9突變體，例如可以是半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性 的蛋白質(zhì)的連接肽或其附近區(qū)域被改變的蛋白質(zhì)或其鹽、由在半乳凝素9或基本上具有與 半乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì)的連接肽或其附近區(qū)域的氨基酸序列中缺失、取代或添加1 個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成，與半乳凝素9比較，實施了至少對于連接肽的分 解敏感性被改變的改變的蛋白質(zhì)或其鹽、可以是基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白 質(zhì)，而且與半乳凝素9的氨基酸序列具有至少70%以上的同源性、或至少75%以上的同源 性、或至少80%以上的同源性、或至少85%以上的同源性、或至少90%以上的同源性、或至 少95%以上的同源性的蛋白質(zhì)或其鹽、也可以是（1)半乳凝素9的N末端側的糖鏈識別領 域（NCRD)或與其具有基本上同等活性的多肽與（2)具有半乳凝素9的C末端側的糖鏈識 別區(qū)域（CCRD)或與該區(qū)域具有基本上同等活性的多肽借助于（3)半在乳凝集素9的連接 肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成的改變 連接肽連接的蛋白質(zhì)或其鹽等。
[0120] 可是，半乳凝素 9 是在 J. Biol. Chem.，272(10) :pp. 6416-6422(1997)報告中在由 惡性淋巴肉芽腫病患者的脾臟制備的cDNA中發(fā)現(xiàn)了新的半乳凝素，將該半乳凝素取名為 半乳凝素9,同時為了避開惡性淋巴肉芽腫病腫瘤中的序列變異，通過正常人的外周血調(diào) 制的cDNA進行了序列的再確認，最終決定了半乳凝素9的序列，該序列表示在該文獻的第 6418 頁的 FIG. 1。另外關于半乳凝素 9 進一步在 J. Biol. Chem.，273 (27) : pp. 16976-16984 (1998)中報道了從由生產(chǎn)嗜酸性細胞趨化因子的T細胞株、ST0-2制備的cDNA分離了趨化 因子Ecalectin(ecalectin)，該因子雖然與先前報告的上述半乳凝素9的同源性高，可是 在氨基酸序列位置中看到第5, 88, 135, 238, 281位的氨基酸不同，ecalectin序列記載在該 文獻的第16983頁的Fig. 8,而且進一步推測ecalectin為半乳凝素9的變異體。
[0121] 另外在 J. Biol. Chem.，275(12) :pp. 8355-8360(2000)中報道 了從由 Jurkat T-cell制備的cDNA分離半乳凝素9,制作重組（重組）蛋白質(zhì)，由于該半乳凝素9重組蛋 白質(zhì)表現(xiàn)出嗜酸性細胞趨化活性，所以平島等人決定將帶有來自于Jurkat T-cell的序列 的半乳凝素9在今后研究中使用，其中在氨基酸序列位置中的第5, 88, 135,238,281位的 氨基酸分別適用 Gly, Lys, Ser, Pro, Glu,上述的松本等人（J. Biol. Chem.，273 (27) :pp. 16 976-16984(1998))報告的ecalectin雖然第5位的氨基酸在Ser和Gly這一點上不同， 但在嗜酸性細胞趨化活性上沒有差異，另外，即使對17個登錄在EST數(shù)據(jù)庫的半乳凝素 9的序列（包括部分序列）進行查詢，認為對于第5, 88, 135, 238, 281位的氨基酸分別適 用Gly, Lys, Ser, Pro, Glu妥當，半乳凝素9的變異被記載在該文獻的第8359頁的Table 11(參照圖8)。圖8中，617(6)，1^8〇()，561'(5)，？1' 〇(?)，6111?)。
[0122] 在 J. Biol. Chem.，272(9) :pp. 6078-6086(1997)(非專利文獻 3)中根據(jù)氨基酸序 列的類似性決定了 2個糖識別部位（CRD)和連接它們的連接區(qū)的26個氨基酸（對于半乳凝 素9M型）（參照同文獻的Fig. 1)。即從序列5所示的氨基酸序列看，確定C端側的糖鏈識別 域（CCRD)從Met175開始。然后基于此結果，人半乳凝素9的CRD和連接區(qū)被登錄在NCBI數(shù) 據(jù)庫的Accession Number NP_033665。另外在 J. Biol. Chem.，273(5) :pp. 2954-2960(1998) 中給出了半乳凝素4和6的報告，其中與CRD的連接區(qū)的設定根據(jù)氨基酸序列、基因序列決 定，這些序列如同文獻的第2956頁的Fig. 2所示，但在將該設定反映在半乳凝素9中時，所 謂前者（J. Biol. Chem.，272(9) :pp. 6079-6086(1997))的設定在連接區(qū)和C端側的CRD中 是不同的。即從序列5所示的氨基酸序列看，CCRD應當從Phe 195開始。
[0123] 本
【發(fā)明者】等研究組根據(jù)非專利文獻3中的設定在將由外顯子形成的剪接邊界存 在于象處于Gln 148-Pro149間、Ile16tl-Thr161間、Ser 177-Thr178間那樣的3個氨基酸區(qū)間C端側 考慮在內(nèi)的同時，將有關C端側CRD的結合糖能力的研究，即在序列5所不的氣基酸序列看 至IJ，使從Thr 178開始的全長CCRD表達時有結合乳糖能力，即使再削除6個氨基酸（從序列 Met184開始的CCRD片段）、削除12氨基酸（從Ala 19tl開始的CCRD片段），仍有結合乳糖能 力，如果消除22氨基酸（從Leu2tltl開始的CCRD片段），由于不能在大腸桿菌中表達，從序列 5所示的氨基酸序列看，能夠考察到CCRD從Phe 195開始的設定更嚴謹也一并考慮在內(nèi)，作 為C端側的CRD定為序列5所示的氨基酸序列Thr178?Thr 323的序列。有關半乳凝素9的 N端側CRD (NCRD)，在序列5所示的氨基酸序列看到，使直至Gln148的全長NCRD表達時有結 合乳糖能力，如果消除9個氨基酸（序列Met 1?Ser139的NCRD片段），雖然蛋白質(zhì)能表達， 但由于結合乳糖能力消失，所以作為N端側的CRD定為序列5所示氨基酸序列中的Met 1? Gln148 序列。
[0124] 在理想的方式中，半乳凝素9突變體是例如（1)具有在作為半乳凝素9的NCRD如 序列2所示的氨基酸序列或其序列中缺失、取代或添加1個或1個以上的氨基酸的序列、或 對序列2所示的氨基酸序列具有至少70%以上的同源性、或至少75%以上的同源性、或至 少80%以上的同源性、或至少85%以上的同源性、或至少90%以上的同源性、或至少95% 以上的同源性的氨基酸序列，而且具有結合乳糖能力的突變體、（2)具有作為半乳凝素9的 CCRD入序列3所示的氨基酸序列或在序列中缺失、取代或添加1個或1個以上氨基酸的突 變體、或?qū)π蛄?所示的氨基酸序列具有至少70%以上的同源性、或至少75%以上的同源 性、或至少80%以上的同源性、或至少85%以上的同源性、或至少90%以上的同源性、或至 少95%以上的同源性的氨基酸序列，且具有結合乳糖能力的突變體、（3)具有作為結合上 述（1)和（2)的連接區(qū)如序列9所示的氨基酸序列或在該序列中缺失、取代或添加1個或1 個以上氨基酸的突變體、優(yōu)選對于基質(zhì)金屬蛋白水解酶等蛋白質(zhì)分解酶比天然的半乳凝素 9穩(wěn)定的突變體。作為該連接區(qū)（3)，包括序列9所示的氨基酸序列中的氨基酸殘基缺失1 個以上（例如、1?2個、優(yōu)選3?4個、更優(yōu)選5?6個、更優(yōu)選7?8個、特別優(yōu)選1? 9個等）的缺失類似體、該氨基酸殘基的1個以上（例如、1?9個、優(yōu)選1?8個、更優(yōu)選 1?6個、更優(yōu)選1?4個、特別優(yōu)選1?2個等）被其它殘基置換的置換類似體、附加1個 以上（例如、1?60個、優(yōu)選1?40個、更優(yōu)選1?20個、更優(yōu)選1?10個、特別優(yōu)選1? 5個等）的氨基酸殘基（但是，序列7和8所示的氨基酸序列中除去了序列9所示氨基酸 序列后的部分表示的序列除外）的付加類似體。作為代表性的該連接區(qū)（3)，如序列9所 示的氨基酸序列被HM，RIP，或任意的2氨基酸序列置換的連接區(qū)等。氨基酸的置換、缺失、 或插入可以是不使多肽的生理特性或化學特性發(fā)生大變化的改變，有時可以給出理想的變 化。作為該氨基酸序列中的氨基酸的置換體，可以從該氨基酸所屬的類中的其它氨基酸類 選擇。例如、作為非極性（疏水性）氨基酸，如丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨 酸、脯氨酸、色氨酸、蛋氨酸等、作為極性（中性）氨基酸，如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨 酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等，作為帶有正電荷的氨基酸（堿性氨基酸），如精氨酸、賴 氨酸、組氨酸等，作為帶有負電荷的氨基酸（酸性氨基酸），如天冬氨酸、谷氨酸等。
[0125] 而作為該連接區(qū)（3)，如對序列7或8所示的氨基酸序列除去序列9所示的氨基 酸序列部分，用HM，RIP，或任意的2氨基酸序列置換的序列，在序列7或8所示的氨基酸 序列中除去序列9所示氨基酸序列部分，剩下其中的6氨基酸，將其它的殘基削除后的序列 等。另外作為該連接區(qū)（3)，也包括序列7或8所示的氨基酸序列中的氨基酸殘基（但是， 除去例如序列9所示的氨基酸序列部分，或序列7的場合可以除去序列8所示的氨基酸序 列部分）缺失1個以上（例如1?5個、優(yōu)選3?10個、更優(yōu)選5?15個、更優(yōu)選7?20 個、特別優(yōu)選1?32個等）的缺失類似體、1個以上的該氨基酸殘基（例如1?9個、優(yōu)選 1?8個、更優(yōu)選1?6個、更優(yōu)選1?4個、特別優(yōu)選1?2個等）被其它殘基置換的置換 類似體、附加1個以上（例如1?60個、優(yōu)選1?40個、更優(yōu)選1?20個、更優(yōu)選1?10 個、特別優(yōu)選1?5個等）的氨基酸殘基（但是，序列7和8所示的氨基酸序列中除去了序 列9所示氨基酸序列后的部分表示的序列除外）的付加類似體。
[0126] 如果能維持作為天然的人半乳凝素9蛋白質(zhì)的特征的結構域結構或糖結合能力， 上述那樣的變異體都包含在本發(fā)明中。另外認為本發(fā)明的肽或多肽也可以包含具有與天然 人半乳凝素9蛋白質(zhì)基本上同等的一級結構構象或其一部分肽或多肽，而且還可以包含具 有與天然的基本上同等生物學活性的肽或多肽。還可以是天然產(chǎn)生的一種變異體。本發(fā)明 的來自人的蛋白質(zhì)（或肽或多肽）例如與選自WO 02/37114 Al的序列表中SEQ ID NO: 1? 3的氨基酸序列有60%、由于場合不同，可以具有70%更高的同源性蛋白質(zhì)，更優(yōu)選具有 80 %或90 %以上的相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)。所謂本發(fā)明的來自人的蛋白質(zhì)的一部分是來 自該人的蛋白質(zhì)的一部分的肽（即該蛋白質(zhì)的部分肽），只要是與本發(fā)明的半乳凝素9蛋 白質(zhì)具有基本上同等活性的蛋白質(zhì)，可以為任一種蛋白質(zhì)。例如、該本發(fā)明的蛋白質(zhì)的部 分肽具有該人半乳凝素9的構成氨基酸序列中至少5個以上、優(yōu)選20個以上、更優(yōu)選50個 以上、更優(yōu)選70個以上、最好優(yōu)選100個以上、有時200個以上氨基酸殘基的氨基酸序列的 肽，最好是這些肽是對應于連續(xù)的氨基酸殘基的肽，或例如就相對于該WO 02/37114 Al 的序列表SEQ ID N0:1?3中任一項表示的氨基酸序列中對應的區(qū)域的同源性來說，具有 與上述同樣的同源性的肽。
[0127] 在本說明書中所謂「基本上同等」指的是蛋白質(zhì)的活性、例如、所定的傷害細胞活 性、誘發(fā)凋亡活性、抗炎癥活性、抗變態(tài)性活性、免疫調(diào)節(jié)活性、糖鏈結合活性、生理活性、生 物學活性基本上相同。另外該用語的意思中可以包括具有基本上同質(zhì)的活性的場合，作為 基本上同質(zhì)的活性，如結合活性、傷害細胞活性、誘發(fā)凋亡活性等。所謂基本上同質(zhì)的活 性表示它們的活性從性質(zhì)上講是同質(zhì)，例如在生理上、藥理學上、或生物學上同質(zhì)。例如、 結合活性、傷害細胞活性、誘發(fā)凋亡活性等活性雖然最好是同等（例如、約0. OOl?約1000 倍、優(yōu)選約0. 01?約100倍、更優(yōu)選約0. 1?約20倍、更優(yōu)選約0. 5?約2倍），但這些活 性的程度、蛋白質(zhì)的分子量等量的要素也可以不同。
[0128] 所謂「半乳凝素9突變體多肽」包括野生型半乳凝素9的天然序列的突變體、其 衍生物、類似體（類似物）、片段、嵌合體、以及變異體。該多肽包括意圖能夠在宿主細胞表 達，且通過設計成能夠編碼特定的半乳凝素9突變體多肽的重組產(chǎn)生的聚核苷酸序列編碼 的多肽。
[0129] 所謂「半乳凝素9突變體治療劑」指的是來自編碼半乳凝素9突變體的聚核苷酸 (半乳凝素9突變體聚核苷酸）或半乳凝素9突變體多肽序列的分子、包含這樣的半乳凝素 9突變體的聚核苷酸或多肽的突變體、變異體、類似體、嵌合體、片段等中的至少一個。所謂 作為聚核苷酸的半乳凝素9突變體治療劑，一般來說是編碼半乳凝素9突變體多肽的序列， 而且包括在宿主細胞中通過重組技術可表達的。另外，半乳凝素9突變體治療劑可以是半 乳凝素9活性的激動劑。其它的半乳凝素9突變體治療劑，可以包括供給半乳凝素9突變 體的治療劑，具有半乳凝素9突變體有的活性，而且產(chǎn)生對與半乳凝素9活性缺乏或不足有 關的疾患?疾病?異常癥狀有予防和/或治療效果的半乳凝素9活性的調(diào)節(jié)劑。作為半乳 凝素9活性的調(diào)節(jié)劑，例如聚核苷酸、多肽、或低分子。
[0130] 本說明書中使用的用語「診斷劑」指的是在本發(fā)明的診斷使用一種或一種以上的 對該診斷行為有用的那樣的任意藥劑。這些藥劑在診斷中的使用可以包括用于決定半乳凝 素9產(chǎn)生細胞的存在的方法或用于決定提示半乳凝素9結合性物質(zhì)的細胞的存在的方法的 使用。作為診斷劑，例如含有選自編碼半乳凝素9突變體突變蛋白質(zhì)的DNA、穩(wěn)定化半乳凝 素9突變體突變蛋白質(zhì)、以及含有該穩(wěn)定化半乳凝素9突變體突變蛋白質(zhì)的細胞或細胞勻 漿液中的成分。
[0131] 本說明書中使用的用語「治療劑」可以是在本發(fā)明的治療中使用的一種或一種以 上的達到或?qū)_到其治療行為有用的任意藥劑。例如、治療劑是被設計為能夠表達半乳凝 素9突變體多肽的聚核苷酸，該藥劑是在給予哺乳動物后，然后能夠在細胞中表達的聚核 苷酸。此時藥劑的活性形式是被表達的多肽。
[0132] 半乳凝素9突變體治療劑是具有半乳凝素9突變體生物活性的治療劑、或比天然 的半乳凝素9突變體更長，對特定糖鏈具有結合的活性的多肽、編碼對基質(zhì)金屬蛋白水解 酶等蛋白質(zhì)分解酶比天然的半乳凝素9更穩(wěn)定的半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸那樣的 來自半乳凝素9突變體的治療劑。該治療劑單獨、或與其它藥劑（例如、與半乳凝素9突變 體的給予一起使用的，且對特定的腫瘤或自身免疫等的在其它眾所周知的治療法中使用的 那樣藥物、或在哺乳動物中容易進行半乳凝素9突變體的表達那樣的基因遞送載體等）配 合達到其治療目的。例如、該治療劑可以是包括為其它目的開發(fā)的半乳凝素9突變體治療 齊U，以及半乳凝素9的激動劑、對半乳凝素9活性進行修飾或調(diào)節(jié)的藥物，例如有機低分子 化合物或物質(zhì)、肽、肽樣化合物或物質(zhì)、編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸、半乳凝素9 突變體多肽、表達對蛋白水解酶比天然的半乳凝素9更穩(wěn)定的半乳凝素9突變體的嵌合體 或變異體等，且被轉(zhuǎn)化的細胞。
[0133] 本說明書中所謂的「配合治療劑」指的是一起給予時，產(chǎn)生它們各自效果的含有幾 個成分或幾個藥劑的治療組成物，配合治療劑也指為了治療疾患等一起給予時產(chǎn)生相乗效 果那樣的制劑。最好是通過配合治療劑中的幾個成分或幾個藥劑的各自作用得到的其它 各種作用效果，為了能夠獲得更大的治療效果、例如腫瘤的消失或正?；淖陨砻庖呒不?回復和獲得長期生存，可以使這些成分組合。作為給予配合治療劑后得到的效果的例子，如 在短期的癥狀回復和長期給予后得到的癥狀的回復的組合，或使對患者中的特定型的各個 細胞的自身免疫應答減少那樣的效果的組合。作為本發(fā)明的配合治療劑的例子，如用于給 予含有編碼半乳凝素9突變體的聚核苷酸與編碼IFN類，IL-2等細胞因子類中的至少一個 的聚核苷酸的基因遞送載體的配合治療劑等。其它的例子也可以使用2個基因遞送載體， 例如、一個表達半乳凝素9突變體，另一個用于表達細胞因子類中至少一個。另外，為了預 測給予半乳凝素9突變體在靶細胞中誘導凋亡，進行正調(diào)節(jié)，也可以給予表達IFN類，IL-2 等、或IFN-y等的基因遞送載體。各種治療劑也可以同時供給，例如、為了提1?治療效率， 根據(jù)需要，可以重復給予各個藥劑中的1個或全部，也可以加入到同一藥學上容許的載體 中給予。
[0134] 「基因遞送載體」指的是能夠使用于多肽在細胞中表達的編碼序列遞送給細胞變 得容易進行那樣的成分。該細胞為了能夠適于體內(nèi)基因治療也可以存在于哺乳動物的體 內(nèi)，為了能夠適于體外基因治療進行轉(zhuǎn)染處理，也可以暫時從哺乳動物中取出，使得多肽表 達后再返回到哺乳動物?；蜻f送載體可以是能夠完成向細胞遞送基因那樣的任意成分或 載體，例如、可以是脂質(zhì)體、粒子、載體等。作為基因遞送載體，重組載體（例如、重組病毒載 體）、核酸載體（例如、質(zhì)粒）、裸核酸分子（例如、基因）、和作為中和核酸分子上的負電荷， 且將核酸分子折疊的分子能夠凝集那樣的多陽離子分子復合體化的核酸分子、與脂質(zhì)體結 合的核酸（美國專利第5, 166, 320號說明書；第5, 547, 932號說明書；Wang et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，84:7851，1987)等。該基因遞送載體可以包括象生產(chǎn)細胞那樣的特定 的真核生物細胞，這些載體是能夠向宿主細胞遞送具有生物學的1個以上所期望的特性的 核酸分子的載體。所期望的特性就像以下議論的那樣，例如、可以包括表達蛋白質(zhì)、酶、或抗 體等那樣的所期望物質(zhì)的能力和/或提供生物學活性的能力。即、通過基因遞送載體轉(zhuǎn)運 的核酸分子不需要表達所期望的物質(zhì)，其本身就是活性的藥劑。這樣的生物學活性的一個 例子是可在基因治療中看到的例子。就基因治療來說，是對某種基因進行鈍化，阻斷該基因 指示的產(chǎn)物的生產(chǎn)，整合到被遞送的核酸分子能夠特異表達的基因中?；蜻f送載體指的 是為了使得1個或多個目的序列或基因表達能夠進行指示的集合體（組件）。
[0135] 基因遞送載體一般來說包含啟動子成份，而且可以包含指示多聚腺苷化的信號。 另外，基因遞送載體還可以與在轉(zhuǎn)錄時能夠運作那樣與1個或多個目的序列或基因連接， 含有作為翻譯起始序列起作用的序列。另外基因遞送載體還可以含有Neo、SV 2Neo、TK、潮 霉素、博萊霉素（腐草霉素）、螺旋霉素、組氨醇、DHFR等那樣可選擇標志、1個以上的制限 酶部位和翻譯終止序列。在本發(fā)明中能夠使用的場合，基因遞送載體可以包括病毒載體 (Jolly, Cancer Gen. Therapy, 1:51-64, 1994)、核酸載體、裸DNA、脂質(zhì)體DNA、粘粒、細菌、特 定的真核生物細胞（包含生產(chǎn)細胞；參照美國專利第6, 333, 195號說明書）那樣的重組載 體。
[0136] 所謂「生物學的活性」在表示保持特異活性的分子場合下使用。例如、具有生物活 性的半乳凝素9突變體多肽對含有半乳凝素9的糖鏈識別部位的特定糖鏈特異結合的活性 或與它具有基本上同等性質(zhì)的活性，且對基質(zhì)金屬蛋白水解酶等蛋白質(zhì)分解酶比天然的半 乳凝素9定性和/或定量保持穩(wěn)定的能力，例如表現(xiàn)出對導致半乳凝素9含有的抗腫瘤活 性或凋亡的凋亡途徑進行活化的活性。
[0137] 本說明書中使用的用語「核酸分子」或「聚核苷酸」指的是編碼特定氨基酸序列或 編碼其互補鏈的RNA或DNA、以及DNA = RNA雜交體等分子。本說明書中使用的「編碼序列」 指的是編碼特定氨基酸序列或編碼其互補鏈的RNA或DNA、以及DNA: RNA雜交體等中的任一 種。聚核苷酸例如可以包括反義寡核苷酸、或核酶，另外也可以包括基因的3'或5'非翻譯 區(qū)那樣的序列、基因的內(nèi)含子、不構成基因的編碼區(qū)域的基因的其它區(qū)域。DNA或RNA可以 是單鏈或雙鏈。在合成核酸或合成聚核苷酸中，也包括含有化學合成核酸序列的序列，以及 為了賦予分子對變性的抵抗性預先從化學上進行的部分改變。聚核苷酸可以通過例如聚合 酶鏈式反應（PCR)擴增、使用互補的DNA或RNA的重組表達等制造，或通過化學合成生成。
[0138] 本說明書中用語「表達調(diào)控序列」或「調(diào)節(jié)序列」指的是包括影響編碼多肽的基因 的表達，包括影響用于轉(zhuǎn)錄和翻譯的信號表達的那樣一個或一個以上的成分，且在該領域 可使用的序列。適于本發(fā)明的多肽表達的表達調(diào)控序列因可表達多肽的宿主系不同而有所 不同。
[0139] 作為本發(fā)明的「多肽」，只要是包含半乳凝素9突變體多肽，可以是任何多肽，如 含有成熟蛋白質(zhì)的半乳凝素9突變體蛋白質(zhì)的任意部分，以及其縮短型、突變體、對立基因 體、類似物、衍生物等。作為突變體，可以是由與關聯(lián)蛋白質(zhì)同一基因表達的剪接后突變體 衍生的。另外只要沒有特別指示，這樣的多肽例如可以是具有對特定糖鏈具有特異結合的 親和結合性或?qū)μ禺悓ο蟮慕Y合活性等該半乳凝素9蛋白質(zhì)具有的生物活性中的一個或 一個以上生物活性的多肽。本「多肽」用語并不限定于特定長度的基因產(chǎn)物。不管是來自 人的或來自人以外的供給源的，至于半乳凝素9的N末端側糖鏈識別部位（NCRD)以及C末 端側糖鏈識別部位（CCRD)與靶蛋白質(zhì)或成熟蛋白質(zhì)同一的，或至少具有60%、優(yōu)選70%、 更優(yōu)選80%、和最好優(yōu)選90%、進一步優(yōu)選95%的同源性的多肽都包括在本多肽的這個定 義內(nèi)。因此可以包括基于對立基因的突變體、以及包括氨基酸的置換、缺失、或插入在內(nèi)的 基因產(chǎn)物的突變體。氨基酸的置換可以是氨基酸的保守性置換、或?qū)μ腔课?、磷酸化?位、乙?；课坏冗M行改變那樣的氨基酸置換、對功能不需要的半胱氨酸殘基的位置進行 改變后，改變了折疊形式的置換、以及除去非必需氨基酸殘基那樣的置換。作為氨基酸的保 守性置換一般來說是保存電荷、疏水性/親水性、和/或被置換的氨基酸的立體尺寸（大 ?。┠菢拥闹脫Q，例如、Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/GIn、Ser/Cys/Thr、 和Phe/Trp/Tyr等組的成員之間的置換是保守性的置換。
[0140] 所謂類似物是具有靶蛋白質(zhì)樣活性的物質(zhì)，作為肽樣物質(zhì)如含有一個或一個以上 被廣泛了解的肽模仿物質(zhì)的肽等。在本定義中，包括例如含有一個或一個以上氨基酸的類 似物（例如、含有非天然型氨基酸等）的多肽、含有被置換的連結部的多肽、天然存在的那 樣的變異和天然不存在的那樣變異的該【技術領域】中眾所周知的那樣的其它改變?修飾。
[0141] 本說明書中用語「多肽」是多肽表達后被改變的多肽，例如進行了糖基化、乙?；?、 磷酸化、肉豆蘧?；取?br> [0142] 本說明書中用語「裸DNA」指的是為了在哺乳動物中表達給予哺乳動物的聚核苷 酸DNA。作為聚核苷酸，例如可以是編碼序列，聚核苷酸DNA -旦DNA進入細胞內(nèi)，為了使 編碼序列容易表達可以直接或間接地與表達調(diào)控序列的序列結合。所謂間接結合目的是使 DNA在哺乳動物細胞中容易表達，為了使調(diào)節(jié)領域和編碼序列進行結合，或使整合其它序列 容易，借助于接頭或間隔片段將兩個聚核苷酸領域結合在一起。
[0143] 本說明書中的「載體」指的是可以指示1或多個目的序列或基因表達的集合體（組 件）。載體必須任意含有轉(zhuǎn)錄啟動子/增強子、規(guī)定1或多個基因座的成份、以及控制對可 變剪接、核RNA輸送、信使翻譯后進行的修飾、或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后進行的修飾等過程進行指 示或調(diào)控的其它基因表達的其它成份。
[0144] 另外載體必須在被轉(zhuǎn)錄時，含有與一個或一個以上的目的序列或基因可操作連 接、而且作為翻譯起始序列起作用的那樣序列。根據(jù)需要，載體可以含有指示多聚腺苷化的 信號、Neo、TK、潮霉素、博萊霉素（腐草霉素）、組氨醇、DHFR等那樣的選擇標志、一個或一 個以上的限制性部位和翻譯終止序列。另外當載體配置在逆病毒中時，載體必須含有包裝 信號、長末端反復序列（LTR)、而如果沒有這些序列，必須含有適合使用的逆病毒的正鏈和 負鏈的引物結合部位。
[0145] 所謂「組織特異的啟動子」指的是在被限定的一些組織型或細胞型中具有優(yōu)先活 性那樣的啟動子，規(guī)定轉(zhuǎn)錄啟動子/增強子或基因座的成份、或象上述那樣控制基因表達 的其它成份。作為這樣的組織特異的啟動子的代表例，例如PEPCK啟動子、HER2/neu啟動 子、酪蛋白啟動子、IgG啟動子、絨毛性胚抗原啟動子、彈性蛋白酶啟動子、膽色素原脫氨基 酶啟動子、胰島素啟動子、成長激素因子啟動子、酪氨酸羥化酶啟動子、白蛋白啟動子、a胎 球蛋白啟動子、乙酰膽堿受體啟動子、醇脫氫酶啟動子、a或0珠蛋白啟動子、T細胞受體 啟動子、骨鈣素啟動子等。
[0146] 所謂「事件特異的啟動子」指的是是規(guī)定轉(zhuǎn)錄啟動子/增強子或基因座的成份、或 象上述那樣控制基因表達的其它成份，而且它們的轉(zhuǎn)錄活性指的是當對細胞性刺激應答時 進行變化那樣的活性。作為這樣的事象特異的啟動子的代表例，如胸腺嘧啶脫氧核苷激酶 或胸苷酸合成酶啟動子、a或3干擾素啟動子、以及對于激素（天然激素、合成激素、或來 自其它非宿主生物的任一種激素，例如昆蟲激素等）的存在進行應答的啟動子等。
[0147] 用語「融合蛋白質(zhì)」或「融合多肽」指的是使用能夠發(fā)生一個以上的蛋白質(zhì)或含有 一個以上的蛋白質(zhì)部分的1個多肽表達那樣的載體表達產(chǎn)生的，而且使載體或連續(xù)的結合 中的一個以上的異種編碼序列重組表達后得到的蛋白質(zhì)或多肽。融合蛋白質(zhì)最好是帶有保 持來自構建它使用的蛋白質(zhì)或多肽具有的至少一個生物學活性的多肽單位，最好是包括通 過使不同蛋白質(zhì)的部分組合，形成信號多肽，使相乗改良的生物學活性產(chǎn)生的融合蛋白或 融合多肽。作為生成的融合蛋白質(zhì)，如有表達時具有功能的多肽，有表達時沒有功能的肽。 作為表達時沒有功能的肽，最好是如為了表達具有活性的多肽時起作用的肽。作為本發(fā)明 中有用的融合蛋白質(zhì)的例子，如從用于治療或用于檢測或測定，以及用于進一步分析或分 離和純化的利用觀點考慮具有幾個優(yōu)點的經(jīng)基因操作的任意半乳凝素9突變體融合多肽。
[0148] 用語「嵌合」或「嵌合蛋白質(zhì)」可以認為含有與融合蛋白質(zhì)或融合多肽等價的意 思?！盖逗戏肿印箍梢允侨诤隙嚯摹⒒蚓幋a融合多肽的聚核苷酸融合分子。嵌合由可連結的 DNA編碼序列構建，然后通過細胞系表達，或通過載體給予，在動物中可以進行體內(nèi)表達。 例如、含有半乳凝素9突變體的嵌合或融合蛋白質(zhì)可以在體內(nèi)或體外通過基因治療程序給 予。
[0149] 本說明書中所謂「患者」指的是在活的生物中可進行任意治療或予防治療的個體， 包括真核生物或原核生物，并不限定于這些。例如、作為患者的真核生物可以是脊椎動物或 無脊椎動物。因此，例如、患者可以是魚、鳥、蠕蟲、昆蟲、哺乳動物、爬蟲類、兩棲類、菌類、植 物，優(yōu)選哺乳動物。作為哺乳動物，例如人。
[0150] 以下對本發(fā)明的半乳凝素9突變體治療劑和/或診斷劑的一般的制造和使用法進 行說明。在1種方式中，本發(fā)明提供對起因于半乳凝素9含有的生理活性或生物活性不足 或欠缺的疾患?疾病?異常狀態(tài)進行治療的技術。作為該治療技術，例如提供半乳凝素9 突變體治療劑的工程和/或給予有該疾患等的哺乳動物有效量的半乳凝素9突變體治療劑 的工程等。半乳凝素9突變體由于能夠發(fā)揮對惡性腫瘤細胞的傷害細胞活性、對惡性腫瘤 細胞的凋亡誘導活性、對惡性腫瘤細胞的抗腫瘤活性（抗癌活性）、活化T細胞的凋亡誘導 活性、特別是CD4陽性T細胞的凋亡誘導活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抗炎癥作用、抗變態(tài)性作用， 所以預期可以作為抗腫瘤劑（抗癌劑）、抗變態(tài)性劑、免疫調(diào)節(jié)劑、自身免疫疾患用劑、抗炎 癥劑和腎上腺皮質(zhì)類固醇激素替代用劑。該治療技術包括對活化T細胞顯著的自身免疫疾 患進行治療的方法。所謂「自身免疫疾患」和「自身免疫」都指的是哺乳動物中的由于自身 免疫導致的特征性的損傷（這是對自身成分的免疫系的應答）。自身免疫應答是進展到表 現(xiàn)出臨床征兆的癥狀的現(xiàn)象。嚴格來說，移植排斥并不是自身免疫反應，而是患者有時接受 對有癥狀的細胞、組織、或器官進行置換或移植的外科手術時，接受同種移植的生物體對外 來移植發(fā)生免疫學反應的現(xiàn)象。在由來自種的一個成員向其它種的細胞、組織、或器官的同 種移植中，在受體（recipient)中當為了排斥被移植的細胞、組織、或器官發(fā)生充分的免疫 應答時，發(fā)生「移植排斥」。
[0151] 作為通過本發(fā)明的方法和治療劑能夠治療的「腫瘤」的例子，包括惡性腫瘤，例如 進行轉(zhuǎn)移的腫瘤為惡性腫瘤，一般將惡性腫瘤分為上皮性和非上皮性的腫瘤，有時也區(qū)分 為癌、肉瘤、白血病等來考慮，單稱為「癌」時，一般人大多指惡性腫瘤。在本說明書中所謂 「癌」可以按照廣泛意思解釋，并不單解釋為上皮性的惡性腫瘤。在本說明書中所謂「癌」可 以包含上皮性惡性腫瘤和非上皮性惡性腫瘤（既包含腫瘤形成性的腫瘤，也包含非形成性 的腫瘤），如皮膚癌（也包含黑素瘤）、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸惡性腫瘤、前列腺癌、膀 胱癌、腎癌、甲狀腺癌、咽?喉頭癌、舌癌、上顎癌、食道癌、胃癌、大腸?直腸癌、肺?支氣管 癌、肝癌（包括肝細胞癌、肝內(nèi)膽管癌）、肝外膽管?膽囊癌、胰贓癌、白血病、惡性淋巴瘤、 漿細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、惡性血管瘤、 惡性血管內(nèi)皮瘤、腦腫瘤（包括腦膜瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤等）等，并不限定于這些， 應當理解為通過使用本發(fā)明的半乳凝素9突變體獲得理想結果的腫瘤，還包括該半乳凝素 9突變體參與后可獲得某種生理或生物學上應答的腫瘤。
[0152] 作為通過本發(fā)明的方法和治療劑能夠治療的「自身免疫疾患」的例子，如多發(fā)性硬 化癥、橋本甲狀腺炎、全身性紅斑狼瘡（SLE)、肺腎綜合征（Goodpasture)、天皰瘡、受體自 身免疫、自身免疫溶血性貧血、自身免疫血小板減少性紫斑病、變形性關節(jié)癥、慢性關節(jié)炎 風濕病、抗膠原抗體和強皮癥（schleroderma)、復合化結合組織病、多發(fā)性肌炎、惡性貧血、 特發(fā)性艾迪生病、自發(fā)性不孕癥、絲球體腎炎、水皰性類天庖瘡、腎上腺素作用性藥物耐性、 慢性活性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、自身免疫基底的內(nèi)分泌腺不全、白斑、脈管炎、心肌梗 塞后遺癥（post-myocardial infarction)、心臟穿孔癥候群、蕁麻疫、特應性皮炎、自身免 疫基底的哮喘、自身免疫基底的炎癥性反應、肉芽腫癥損傷、強直性（alkylizing)脊椎炎、 鏈球菌感染后（poststreptococcal)的絲球體腎炎、自身免疫溶血性貧血、腦炎、對淋巴瘤 的二次自身免疫反應、變性損傷、萎縮性損傷等。作為表示受體自身免疫的自身免疫疾患， 例如格雷夫斯病、重癥肌無力癥、胰島素耐性癥等。作為腎上腺素性藥物耐性的自身免疫疾 患，例如哮喘和囊胞性纖維癥等。
[0153] 作為本發(fā)明中的其它自身免疫疾患，例如動物模型存在的疾患，例如肖格倫綜合 征（自身免疫淚腺炎（dacryodentis)或免疫媒介唾液腺炎）、自身免疫心肌炎、原發(fā)性膽汁 性肝硬變（PBC)、炎癥性心臟病、水銀誘導性腎自身免疫、胰島素依賴性糖尿?。↖型糖尿病 或IDD)、胸腺切除術后自身免疫、中樞神經(jīng)系（CNS)脫髓鞘障礙、CNS狼瘡、睡眠發(fā)作、免疫 媒介PNS障礙、變形性關節(jié)癥、慢性關節(jié)炎風濕病、葡萄膜炎、髓質(zhì)囊胞性纖維癥、自身免疫 溶血性疾患、自身免疫脈管炎、卵巢自身免疫疾患、強皮癥（scheroderma)等。作為由于中 樞神經(jīng)系（CNS)脫髓障害導致特征性自身免疫疾患，例如多發(fā)性硬化癥（MS)等。末梢神經(jīng) 系（PNS)自身免疫疾患例如格林-巴利綜合征（GBS)。
[0154] 作為半乳凝素9突變體治療劑，如多肽、聚核苷酸、低分子有機化合物、肽、或肽樣 化合物或物質(zhì)等。而半乳凝素9突變體治療劑也包括編碼半乳凝素9突變體多肽、半乳凝 素9突變體多肽的聚核苷酸、含有該半乳凝素9突變體多肽一部分的融合多肽、編碼含有該 半乳凝素9突變體多肽一部分的融合多肽的聚核苷酸、半乳凝素9突變體多肽的生物活性 肽衍生物、來自于半乳凝素9突變體多肽的生物活性肽樣化合物或物質(zhì)、或具有半乳凝素9 突變體活性，且模仿半乳凝素9突變體結構的低分子有機化合物（例如、激動劑）等。半乳 凝素9突變體多肽可以是半乳凝素9突變體多肽突變體、半乳凝素9突變體多肽衍生物、變 異的半乳凝素9突變體多肽、或縮短型半乳凝素9突變體多肽那樣的生物活性的半乳凝素 9突變體多肽。編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸也可以是編碼帶有半乳凝素9N端 偵U CRD全長以及C端側CRD全長的突變體多肽的聚核苷酸序列、編碼半乳凝素9突變體多 肽的生物活性部分的序列、編碼來自于半乳凝素9突變體多肽的生物活性肽的序列、編碼 可溶性半乳凝素9突變體多肽的序列等。本發(fā)明另外實施方式是含有可以表達編碼半乳凝 素9突變體多肽的聚核苷酸序列的基因遞送載體的組成物。
[0155] 本發(fā)明中利用「基因重組技術」，構建和獲得所定核酸（聚核苷酸）或所定肽（多 肽），另外可進行分離?序列決定，制作重組體。作為本說明書中可使用的基因重組技術 (包括重組DNA技術），如該領域已知的技術，例如可以通過J. Sambrook, E. F. Fritsch&T. Maniatis,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd edition)〃，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York(1989) ；D. M. Glover et al. ed.，〃DNA Cloning"，2nd ed. , Vol. Ito 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995);日本生化學會編、「續(xù)生化學實驗講座1、基因 研究法II」、東京化學同人（1986);日本生化學會編、「新生化學實驗講座2、核酸III (重 組 DNA 技術）」、東京化學同人（1992) ;M.J. Gait(Ed), Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (1984) ；B.D.Hames and S. J. Higgins(Ed), Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press Ltd. , Oxford, UK(1985) ；B. D.Hames and S. J. Higgins(Ed), Transcription and Translation:A Practical Approach(Practical Approach Series), IRL Press Ltd., Oxford, UK(1984) ；B.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(2nd Edition), John ffiley&Sons, New York (1988)； J. H. Miller and M. P. Calos (Ed), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1987) ；R. J. Mayer and J. H. Walker(Ed), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, (1987) ；R. K. Scopes et al. (Ed), Protein Purification:Principles and Practice (2nd Edition, 1987&3rd Edition,1993), Springer-Verlag^ N. Y. ；D. M. Weir and C.C.Blackwell(Ed), Handbook of Experimental Immunology, Vol. I,2,3and 4, Blackwell Scientific Publications，Oxford， （1986) ；L.A.Herzenberg et al. (Ed)，Weir's Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, 2, 3and 4, Blackwell Science Ltd. (1997) ；R. W. Ellis(Ed), Vaccines new approaches to immunological problems, Butterworth-Heinemannj London (1992) ；R. Wu ed.，''Methods in Enzymology"，Vol. 68(Recombinant DNA)，Academic Press，New York(1980) ;R. Wu et al. ed.，"Methods in Enzymology^jVol. 100(Recombinant DNAjPart B)&101(Recombinant DNA，Part C)，Academic Press，New York(1983) ;R. Wu et al.ed.，"Methods in Enzymology^j Vol. 153 (Recombinant DNAj Part D)，154 (Recombinant DNAj Part E)&155 (Recombinant DNAjPart F),Academic PressjNew York(1987) ；J.H. Miller ed. , ^Methods in Enzymology^jVol. 204, Academic PressjNew York(1991) ；R. Wu et al.ed.，"Methods in Enzymology^j Vol. 218, Academic Press,New York(1993)； 5. Weissman (ed.)，"Methods in Enzymology"，Vol. 303, Academic Press，New York (1999); J. C. Glorioso et al. (ed.)，"Methods in Enzymology^j Vol. 306, Academic Press, New York(1999)等所述的方法或其中引用的文獻所述的方法或與它們基本上同樣的方法或改 變法進行（這些方法中的記載由于參照也包括在本說明書的內(nèi)容中）〔以下、將這些方法都 稱之為「基因重組技術」）。
[0156] 本說明書中，所謂「同源性」意味著在多肽序列（或氨基酸序列）或聚核苷酸 序列（或堿基序列）中的2條鏈之間，構成該鏈的各個氨基酸殘基之間或各堿基之間的 相互適合關系中能夠決定是同一那樣的氨基酸或堿基的量（數(shù)），指的是兩個聚核苷酸 或多肽序列之間的序列相關性的程度。同源性可以容易算出。測定兩個聚核苷酸或多 肽序列之間的同源性的方法已知有很多種，「同源性」（也稱為「同一性」）的用語對于 同行眾所周知（例如、Lesk，A. M. (ed. )，Computational Molecular Biologly，Oxford University Press,New York, (1988) ；Smith,D.W. (ed. ), Biocomputing:Informatic s and Genome Projects, Academic Press, New York (1993) ；rifin, M. &Grifin, H. G. ed.) omputer Analysis of Sequence Data:Part Ii, Human Press, New Jersey, (1994)； von Heinje，G.，Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987) ；Gribskov, M. &Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press，New York，（1991)等）。測定兩個序列的同源性使用的一般方法如Martin，J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers,Academic Press,San Diego, (1994)； Carillo, H. &Lipman，D.，SIAM J. Applied Math.，48:1073(1988)等公布的方法，但并不限 定于這些方法。作為用于測定同源性的理想方法，如為了獲得進行試驗的兩個序列間的 最大的適合關系部分而設計的方法。這樣的方法如作為計算機程序建立的方法。作為測 定兩個序列間同源性的理想的計算機程序法如GCG程序包（Devereux，J. et al.，Nucleic AcidsResearch, 12(1):387 (1984)O/BLASTP/BLASTN(Atschul, S. F. et al.,J.Mol. Biol，215:403(1990))等，但并不限定于這些方法，可以使用該領域中眾所周知的方法。
[0157] 在本說明書中，所謂「聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction)」或「PCR」 一般指的是美國專利第4, 683, 195號說明書等所述的那樣方法，例如指用于在體外通過酶 對所期望的核苷酸序列進行擴增的方法。一般來說，PCR法是包括使用能夠優(yōu)先與模板核 酸進行雜交的2個寡核苷酸引物，反復進行引物延伸合成那樣的循環(huán)的方法。對于典型的 PCR法中使用的引物可以使用對于模板內(nèi)部應當可擴增的核苷酸序列互補的引物，例如， 優(yōu)選使用在與應當擴增的核苷酸序列的兩端互補、或與應當被擴增的核苷酸序列鄰接的引 物。作為5'端的引物要按照至少含有起始密碼子、或包含該起始密碼子、可擴增那樣選擇， 而作為3'端側的引物最好是能夠至少含有終止密碼子、或含有該終止密碼子能夠擴增那樣 地進行選擇。引物優(yōu)選由5個以上的堿基，更優(yōu)選10個以上堿基構成的寡核苷酸、更優(yōu)選 由18?25個堿基構成的寡核苷酸。
[0158] PCR反應可以按照該領域眾所周知的方法或與這些方法基本上同樣的方法 或改變法進行，例如可以根據(jù) R. Saiki, et al.，Science, 230:1350, 1985 ;R. Saiki, et al.，Science, 39:487, 988;. A. Erilich ed.，PCR Technology, Stockton Press, 989;. M. Glover et al.ed.，"DNA Clonig"，2nd ed.，Vol.l，(The Practical Approach Series)，RL Press, Oxford University Press (1995) ;M. A. Innis et al.ed.，"PCR Protocol s : a guide to methods and app locat ions，'，Academi c Prss, New AYork 1990) ；M. J. McPherson, . Quirk and G. R. Tayloy (Ed. , ), CR: a pract9ical approach, RL Press, Oxford (1991) ；M. A. Frohman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002(1988)等所述的方法或?qū)@些方法進行修飾、改變的方法進行。另外， PCR法也可以使用適用的市售的試劑盒進行，根據(jù)試劑盒制造者或試劑盒銷售者指明的程 序?qū)嵤?br> [0159] PCR反應對于代表性的實驗是將例如模板（例如，以mRNA為模板合成的DNA ;lst strand DNA)和根據(jù)該基因設計的引物與IOX反應緩沖液（Taq DNA聚合酶附帶的）、 dNTP (脫氧核苷三磷酸dATP，dGTP，dCTP dTTP的混合物）、Taq DNA聚合酶以及去離子蒸餾 水混合。對于該混合物使用例如GeneAmp 2400PCR system, erkin-Elmer/Cetus公司等自動 熱循環(huán)儀在一般的PCR循環(huán)條件下反復該循環(huán)25?60次，用于擴增的循環(huán)數(shù)可以根據(jù)相 應目的設為合適的次數(shù)。作為PCR循環(huán)的條件，例如變性90?95°C 5?100秒、退火40? 60°C 5?150秒、延伸65?75°C 30?300秒的循環(huán)，優(yōu)選變性94°C 15秒、退火58°C 15秒、 延伸72°C 45秒的循環(huán)，退火的反應溫度以及時間可以根據(jù)相應實驗選擇適當?shù)闹?，變性?應和延伸反應的時間也可以根據(jù)預想的PCR產(chǎn)物的鏈長選擇適當?shù)闹?。退火的反應溫度?好是根據(jù)通常引物與模板DNA的雜交的Tm值改變。延伸反應的時間通常大約每IOOObp的 鏈長1分鐘程度那樣的尺度，根據(jù)場合不同也可以選擇更短的時間。
[0160] 在本說明書中，所謂「寡核苷酸」可以是比較短的單鏈或雙鏈的聚核苷酸，優(yōu)選聚 脫氧核苷酸，可以通過Angew. Cem. nt. Ed. Engl.，Vol. 28, p. 716-734 (1989)所述的那樣已 知方法、磷酸三酯法、磷酸二酯法、磷酸法、磷酸酰胺法、磷酸法等方法化學合成。已知通常 合成可以很便利地在被修飾的固體支持體上合成，該儀器有銷售。該核苷酸可以含有一個 或一個以上的修飾堿基，例如可以含有次黃苷等天然而不是普通的堿基或三甲基化的堿基 等，根據(jù)場合不同也可以含有帶有標記的堿基。
[0161] 為了對所定核酸進行鑒定，可以利用雜交技術。該雜交可以根據(jù)上述公布的「基因 重組技術」的文獻所述的方法或基本上與它同樣的方法或改變法進行。例如，雜交可以使含 有DNA等核酸的樣品轉(zhuǎn)移到含有尼龍膜等膜載體上，根據(jù)需要實施變性處理、固定化處理、 清洗處理等后，使轉(zhuǎn)移到上述載體（例如膜等）的核酸根據(jù)需要，使變性的標記探針DNA片 段在雜交用緩沖液中進行反應。
[0162] 雜交處理通常于約35?約80°C進行、于約50?約65°C下更合適，進行約15分 鐘?約36小時，約1?約24小時更合適，可以選擇最適條件進行。例如，雜交處理在約55°C 下進行約18小時。作為雜交用緩沖液，可以使用選自該領域中通常使用的緩沖液，例如可 以使用Rapid hybridization buffer (Amersham公司）等。作為轉(zhuǎn)移的載體（例如，膜等） 的變性處理，通常通過于約40?約100°C、于約70?約90°C下更合適，進行約15分鐘?約 24小時焙烤，進行約1?約4小時焙烤更合適，可以選擇最適合條件進行。例如，對膜等載 體通過于80°C下進行約2小時焙烤進行固定化。作為轉(zhuǎn)移的載體（例如膜等）的清洗處 理，可以通過用在該領域中通常使用的清洗液、例如含有IMNaCUlmMEDTA和0. 1%十二烷 基硫酸鈉（SDS)的50mM Tris - HCl緩沖液，pH8. 0等進行清洗。作為含有尼龍等膜的載 體，可以使用從該領域通常使用的載體中選擇的載體。
[0163] 作為上述堿性變性液、中和液、緩沖液，可以使用從該領域中通常使用的緩沖 液中選出來的緩沖液，作為堿性變性液，例如可以使用含有〇. 5MNaCl和1. 5MNaCl的 0. 5M Tris - HCl 緩沖液，pH8. 0 等，作為緩沖液例如 2XSSPE(0. 36MNaCl、20mMNaH2P04 和2mMEDTA)等。另外在雜交處理之前，為了防止非特異性雜交反應，根據(jù)需要，進行了 轉(zhuǎn)移的載體（例如膜等）最好是進行預雜交處理。該預雜交處理可以通過例如浸入到 預雜交溶液[50% formamide、5XDenhardt 溶液（0.2%牛血清白蛋白、0.2% polyvinyl pyrrolidone)、5XSSPE、0. 1% SDSUOOii g/ml 熱變性鮭精子 DNA]等中，于約 35 ?約 50°C， 優(yōu)選42°C下進行約4?約24小時，優(yōu)選約6?約8小時反應，該條件同行可以通過反復進 行適當實驗，確定更理想的條件。在雜交中使用的標記探針DNA片段的變性可以于約70? 約KKTC下、優(yōu)選約KKTC下，進行約1?約60分鐘、優(yōu)選約50分鐘加熱等進行。而雜交可 以利用其眾所周知的方法或根據(jù)這些方法的方法進行，在本說明書中，所謂嚴格的條件指 的是例如，關于鈉濃度，約15?約50mM、優(yōu)選約19?約40mM、更優(yōu)選約19?約20mM，關于 溫度約35?約85°C、優(yōu)選約50?約70°C、更優(yōu)選約60?約65°C的條件。
[0164] 雜交完了后，對膜等載體進行充分清洗處理，在將進行特異雜交反應的標記探針 DNA片段以外的標記探針等除去后，可以進行檢測處理。膜等載體的清洗處理可以使用從 該領域通常使用的方法選出的方法進行，例如可以通過用含有〇. 1% SDS0. 5 XSSC (0. 15M NaCl、15mM檸檬酸）溶液等進行清洗。
[0165] 進行雜交的核酸可以通過代表性的自動放射自顯影進行檢測，在檢測中也可以適 當選用該領域中使用的方法。將進行檢測的相當于信號的核酸帶懸浮于適當?shù)木彌_液、例 如 SM 溶液（含有 IOOmM NaCl 和 IOmM MgSO4 的 50mM Tris - HCl 緩沖液，pH7. 5)等，然后 對該懸浮液進行適度稀釋，對所定核酸進行分離?純化，然后再進行擴增處理。在本說明書 中，所謂「高同源性」是因該對象序列的長度不同而不同，例如可以是50%以上、甚至60% 以上、優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選80%以上，而對于特定場合也可以為95%以上，97%以上特別 好。所謂「同效的堿基序列」例如在嚴格條件下與含有問題序列的核酸可進行雜交的堿基 序列，例如與該堿基序列中連續(xù)的5個以上的堿基序列、優(yōu)選IO個以上的堿基序列、更優(yōu)選 15個以上的堿基序列、更優(yōu)選20個以上的堿基序列進行雜交，編碼與該多肽基本上同等的 氨基酸序列的堿基序列。核酸也可以通過化學合成獲得。這種情況下，化學合成片段，然后 通過酶將合成的片段結合起來。
[0166] 通過雜交處理對從含有基因文庫或cDNA文庫等的核酸樣品中進行篩選目的核酸 的處理可以反復進行。可以使用被克隆的來自人的cDNA文庫、例如各種來自人的組織或 培養(yǎng)細胞（特別是人的腎臟、腦、松果體、下垂體后葉、神經(jīng)細胞、網(wǎng)膜、網(wǎng)膜血管細胞、網(wǎng)膜 神經(jīng)細胞、胸腺、血管、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、血液細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、精巢、卵 巢、子宮、腸、心臟、肝臟、小腸、大腸、齒肉關連細胞、皮膚關連細胞、線球體細胞、尿細管細 胞、結合組織細胞等組織?細胞、以及各種腫瘤組織、癌細胞等）cDNA文庫。另外用作模板等 的cDNA文庫也可以直接使用市售的來自各種組織的cDNA文庫，例如可以使用由Stratagen 公司、Invitrogen公司、Clontech公司等銷售的cDNA文庫。作為典型的例子，可以使用 由人組織?細胞制備的基因文庫、例如人Pl artificial chromosome基因組文庫（Human Genome Mapping Resource Center)、人組織cDNA文庫（例如，可從Clontech公司等獲得）。 使用探針可以對由各種人組織或培養(yǎng)細胞等構建的人基因組DNA文庫或來自人的cDNA文 庫進行篩選。為了用放射性同位素等對探針等進行標記，可以使用市售的標記試劑盒、例 如隨機引物DNA標記試劑盒（Boehringer Mannheim公司）等進行。例如使用隨機引發(fā) (random-priming)試劑盒（Pharmacia LKB 公司，Uppsala)等，用[a-32P]dCTP(Amersham 公司）等對探針用DNA進行標記，可以獲得帶有放射活性的探針。
[0167] 含有所定核酸的噬菌體粒子、重組質(zhì)粒、重組載體等可以通過該領域中通常使 用的方法對所定核酸進行純化分離，例如可以通過甘油梯度超離心分離法（Molecular Cloning,a Laboratory Manual, ed. T. Maniatis, Cold Spring Harobor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989)、電泳法等進行純化。使用在該領域中通常使用的方法可以從噬菌體粒子等純 化分離DNA，例如，將得到的噬菌體等懸浮于TM溶液（含有IOOmM MgSO4的50mM Tris - HCl緩沖液，pH7. 8)等，用DNase I和RNase A等處理后，加20mM EDTA、50ii g/ml蛋白酶K 以及0. 5% SDS混合液等，于約65°C，保溫約1小時后，對該溶液進行酚提取、二乙基乙醚提 取后，通過乙醇沉淀使DNA沉淀，然后將得到的DNA用70 %乙醇洗凈后干燥，溶解于TE溶液 (含有IOmM EDTA的IOmM Tris - HCl緩沖液，pH8. 0)等后得到。另外作為目的DNA通過 亞克隆等大量獲得也是可能的，例如亞克隆作為宿主可以使用大腸桿菌，用質(zhì)粒載體等進 行。通過這樣亞克隆得到的DNA也與上述同樣，通過離心分離、酚提取、乙醇沉淀等方法純 化分離。
[0168] 在本說明書中，得到的PCR產(chǎn)物等核酸（包括DNA)通常進行1?2%瓊脂糖凝 膠電泳，作為特異的帶從凝膠中切出，例如，使用gene clean kit(Bio 101)等市場銷售 的提取試劑盒進行提取。提取的DNA用適當?shù)南拗泼盖?，根?jù)需要進行純化處理，或根據(jù) 需要，對5'末端用T4聚核苷酸激酶等進行磷酸化后，與pUC18等pUC系載體等適當?shù)馁|(zhì) 粒載體連接，轉(zhuǎn)化適當?shù)母惺軕B(tài)細胞。被克隆的PCR產(chǎn)物可以解析其堿基序列。對于PCR 產(chǎn)物的克隆，可以使用例如 P-Direct (Clontech)，pCR-Script?SK(+) (Stratagene 公司）、 pGEM-T(Promega公司），pAmp?(Gibc〇-BRL公司）等市場銷售的質(zhì)粒載體。為了進行宿 主細胞的轉(zhuǎn)化，例如可以使用噬菌體載體，使用鈣法、銣/鈣法、鈣/錳法、TFB高效率法、 FSB冷凍感受態(tài)細胞法、迅速克隆法、電穿孔等該領域已知的方法或基本上與該方法同樣 的方法進行（D.hanahan，J. Mol. Biol.，166:557, 1983等）。為了分離目的DNA，可以運用 逆轉(zhuǎn)錄 PCR(polymerase chain reaction coupled reverse transcription ;RT_PCR)、 RACE(rapid amplification of cDNA ends) qRACE可以根據(jù)例如M. A. Innis et al.ed.，"PCR Protocols，'（M. A. Frohman, "a guide to methods and applications，'），pp. 28-38, Acade mic Press, New York(1990)等所述的方法進行。
[0169] DNA，可以根據(jù)需要克隆，例如可以利用質(zhì)粒、入噬菌體、粘粒、Pl噬菌體、F因子、 YAC等。最好是來自入噬菌體的載體，例如可以利用Charon 4A、Charon 21A、AgtlO、 入 gtll、XDASHII、XFIXII、XEMBL3、XZAPII?(Stratagene 公司）等。另外可以將得到 的DNA整合到下面詳細說明那樣的適當載體、例如質(zhì)粒pEX、pMAMneo、pKG5等載體，用下面 詳細說明那樣的適當?shù)乃拗骷毎⒗绱竽c桿菌、酵母、CHO細胞、COS細胞等表達。另外該 DNA片段直接或作為附加了適當調(diào)控序列的DNA片段整合到適當?shù)妮d體、然后導入動物后， 可以做成表達所定基因的轉(zhuǎn)基因動物。作為動物如哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、土撥鼠、 牛等。最好是將該DNA片段導入小鼠等動物的受精卵，可以做成轉(zhuǎn)基因動物。對于所定的 基因產(chǎn)物的確認可以使用轉(zhuǎn)化該外源基因的293T細胞、COS - 1細胞等適于該基因的動物 細胞等進行。
[0170] 作為將外源基因?qū)氩溉閯游锏葎游锛毎姆椒?，可以通過該領域已知 的方法或基本上與該方法同樣的方法進行，例如磷酸鈣法（例如，F(xiàn).L. Graham et al.，Virology, 52:456, 1973 等）、DEAE -葡聚糖法（例如，0.?^『(166七已1.，]\6611. Virol.，3:371，1968 等）、電穿孔法（例如，E. Neumann et al.，EMBO J 1. :841，1982 等）、 微注射法、脂質(zhì)體法、病毒感染法、噬菌體粒子法等。這樣一來，轉(zhuǎn)染了所定的基因的動物細 胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物也可以進行基因解析。
[0171] 作為整合所定基因等（本發(fā)明中得到的DNA等）的質(zhì)粒，只要是在基因工程中常 用的宿主細胞（例如，大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞宿主、酵母、293T細胞、CHO細胞、COS 細胞等真核細胞宿主、Sf21等昆蟲細胞宿主）中能夠表達的質(zhì)粒，什么樣的質(zhì)粒都可以。 當然也可以選用市售的試劑盒或試劑附帶的質(zhì)粒。在這樣的序列內(nèi)，也可以含有例如為了 在選擇的宿主中表達而進行適當修飾的密碼子，或設計限制酶部位，也可以含有為了使目 的基因表達容易的調(diào)控序列、促進序列等、在結合目的基因中起作用的接頭、適配器等、以 及調(diào)控抗生素抗性等、調(diào)控代謝、對篩選有用的序列（也可以含有編碼雜化蛋白或融合蛋 白質(zhì)的序列）等。最好是使用適當?shù)膯幼印⒗缭谝源竽c桿菌作為宿主的質(zhì)粒中，如使用 色氨酸啟動子（trp)、乳糖啟動子（Iac)、色氨酸?乳糖啟動子（Iac)、脂蛋白啟動子（Ipp)、 入噬菌體1\啟動子等，在以動物細胞作為宿主的質(zhì)粒中，可以使用SV40晚期啟動子、MMTV LTR啟動子、RSV LTR啟動子、CMV啟動子、SRa啟動子等，在以酵母作為宿主的質(zhì)粒中可以 使用 GAL1、GALlO 啟動子等。另外也可以使用 CYC1、HIS3、ADH1、PGK、PH05、GAPDH、ADC1、 TRP、URA3LEU2、EN0、TP1、A0X1 等調(diào)控系。
[0172] 為了促進編碼所期望多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄，可以在載體中插入增強子，作為這樣的 增強子，如作用于啟動子、具有促進轉(zhuǎn)錄的作用，通常約10?IOObp的具有Cis作用的序列 (元件）。很多增強子是從珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、a -轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等哺乳動物 基因了解到的。作為代表性的，使用從真核細胞感染性病毒得到的增強子合適，例如位于復 制起點的晚期區(qū)的SV40增強子（100 - 270bp)、巨細胞病毒的初期啟動子的增強子、位于多 糖類的復制起點的晚期區(qū)的增強子、腺病毒的增強子等。另外根據(jù)需要，也可以附加宿主中 存在的信號序列，這些可以使用同行都非常了解的。
[0173] 作為以大腸桿菌作為宿主的質(zhì)粒，例如pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、 pSP64、pSP65、pTZ - 18R/-18U、pTZ - 19R/-19U、pGEM - 4、pGEM - 3Z、pGEM - 4Z、 pGEM - 5Zf ( - )、pBluescr ipt KS? (Stratagene公司）等。作為適于在大腸桿菌中 表達的質(zhì)粒載體，如 pAS、pKK223(Pharmacia 公司）、pMC1403、pMC931、pKC30、pRSET - Bdnvitrogen公司）等。作為以動物細胞為宿主的質(zhì)粒，例如SV40載體、多糖類?病 毒載體、牛痘病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，具體來說，如pcD、pcD-SRa、CDM8、pCEV4、 pME18S、pBC12Bl、pSG5(Stratagene公司）等。作為以酵母為宿主的質(zhì)粒，如Yip型載 體、Yep型載體、YCp型載體等，例如pGPD-2等。作為宿主細胞，當宿主細胞為大腸桿菌 時，如來自大腸桿菌K12株的，例如作為來自NM533、XLlBlue、C600、DH1、DH5、DH11S、 DH5 a、DH10B、HB101、MC1061、JM109、STBL2、B834 株的，如 BL21 (DE3)pLysS 等。宿主細 胞為酵母時，例如 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces prombe, Pichia pastoris，Kluveromyces 株，Candida Trichoderma reesia，以及其他酵母株等。作為在 酵母中的表達系，例如可以參照 Hinnen et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:1929 ; Ito et al. , J. Bacteriol. (1983) 153:163 ；Kurtz et al. , Mol. Cell. Biol. (1986)6:142 ； Kunze et al. , J. Basic Microbiol. (1985)25:141 ；Gleeson et al. , J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459 ；Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet(1986)202:302 ；Das et al. , J. Bacteriol. (1984) 158:1165 ；De Louvencourt et al. , J. Bacteriol. (1983) 154:737； Van den Berg et al. , Bio/Technology(1990) 8:135 ；Kunze et al. , J. Basic Micr Biol. (1985)25:141 ;Cregg et al., Mol. Cell.Biol. (1985)5:3376 ;美國專利第 4,837, 148 號說明書，同第 4,929,555 號說明書；Beach and Nurse, Nature (1981) 300:706 ; Davidow et al.,Curr.Genet. (1985) 10:380 ；Gaillardin et al.,Curr.Genet. (1985) 10:49 ；Ballance et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284 - 289； Tilburn et al., Gene (1983) 26:205 - 221 ；Yalton et al. , Proc.Natl. Acad. Sci. USA(1984)81:1470 - 1474 ；Kelly and Hynes1EMBO J., (1985)4:475479 ；EP 244, 234 ；W0 91/00357等所述的表達系。
[0174] 宿主細胞為動物細胞時，如來自非洲中部猴成纖維細胞的COS - 7細胞、COS - 1細胞、CV - 1細胞、來自人腎細胞的293細胞、來自人表皮細胞的A431xb、來自人大腸 的205細胞、來自小鼠成纖維細胞的COP細胞、MOP細胞、WOP細胞、來自中國倉鼠細胞 的CHO細胞、CHO DHFR _細胞、人HeLa細胞、來自小鼠細胞的C127細胞、來自小鼠細胞 的NIH 3T3細胞、小鼠L細胞、9BHK、HL60、U937、HaK、Jurkat細胞、其他被轉(zhuǎn)化后得到 的細胞系、通常的二倍體、由體外一次培養(yǎng)組織誘導的細胞株等。哺乳動物表達，例如可 以參照Dijkema et al.，EMB0 J. (1985)4:761 ;Gorman et al.，Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1982b)79:6777;Boshart et al.，Cell (1985)41:521;美國專利第 4, 399, 216 號說 明書；Ham and Wallace, Methods in Enzymology (1979) 58:44 ；Barnes and Sato, Anal. Biochem. (1980) 102:255 ;美國專利第4, 767, 704號說明書；同第4, 657, 866號說明書； 同第4,927,762號說明書；同第4,560,655號說明書；TO90/103430 ;TO 87/00195 ;美國 專利第RE 30, 985號說明書等記載的細胞。作為昆蟲細胞，以蠶核多角體病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus)、來自該病毒的病毒或其他合適的病毒作為載體， 可以使用 Spodoptera frugiperda(caterpillar), Aedes aegypti(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melangaster (fruitfly),香幼蟲或香培養(yǎng)細胞、例 如 BM - N 細胞等（例如，Luckow et al. , Bio/Technology, 6, 47-5 (1988) ;Setlow, J. K. et al. (end,), Genetic Engineering, Vol. 8, pp. 277-279, Plenum Publishing, 1986 ；Maeda et al.，Nature, 315, pp. 592-594 (1985))。有關異種基因在昆蟲中的表達例如可以參照美國 專利第 4, 745, 051 號說明書；Friesen et al. (1986) ,"The Regulation of Baculovirus Gene Expression"，The Molecular Biology of Baculoviruses (ff.Doerfler(Ed))； EP 127, 839；EP 155, 476 ；Vlak et al. , J. Gen. Virol. , (1988) 69: 765 - 776 ；Miller et al. , Ann. Rev. Microbiol. (1988)42:177 ；CarbonelI et al. , Gene(1988)73:409 ； Maeda et al. , Nature, (1985) 315:592-594 ；Lebacq-Verheyden et al., Mol.Cell. Biol. (1988)8:3129 ；Smith et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985)82:8404 ； Miyajima et al. ,Gene (1987) 58:273 ;Martin et al. ,DNA (1988) 7:99 等報道。另 外關于多數(shù)的桿狀病毒株和突變體以及來自宿主的對應的容許昆蟲宿主細胞，例如 可以參照 Luckow et al.，Bio/Technology(1988)6:47_55;Miller et al. ,Generic Engeneering(Serlow, J. K. et al. (Ed))Vol. 8(Plenum Publishing, 1986)pp. 277-279 ； Maeda et al.，Nature (1985) 315:592 - 594 等報道。
[0175] 利用Agrobacterium tumefaciens等，可以將植物細胞作為宿主細胞使用，與適合 它的載體一起，這些在該領域都是廣泛了解的。在本發(fā)明的基因工程手法中，可以使用在該 領域已知或廣泛運用的限制酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、作為用于對適于將DNA片段克隆化的結構進行 修飾或進行變換的酶的DNA修飾?分解酶、DNA聚合酶、末端核苷酸基轉(zhuǎn)移酶、DNA連接酶等。 作為限制酶，例如 R.J. Roberts, Nucleic Acids Res.，13:rl65, 1985 ;S. Linn et al.ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, New York,1982 ； R. J. Roberts, D. Macelis, Nucleic Acids Res. , 19:Suppl. 2077, 1991 等報道的酶。
[0176] 根據(jù)本發(fā)明，用含有編碼多肽（或蛋白質(zhì)）的核酸的表達載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體根據(jù) 需要使用適當?shù)倪x擇標志，通過反復克隆，可以很多具有穩(wěn)定高表達能力的細胞株。例如， 在作為宿主細胞使用動物細胞的轉(zhuǎn)化體中，作為選擇標志利用dhfr基因時，通過慢慢提高 MTX濃度進行培養(yǎng)，選擇抗性株，使編碼本發(fā)明的多肽的DNA擴增，可以獲得能更高表達的 細胞株。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以在可表達編碼本發(fā)明的多肽的核酸的條件下進行培養(yǎng)，使目 的物生成、蓄積。該轉(zhuǎn)化體可以在該領域中廣泛使用的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。例如大腸桿菌、 枯草桿菌等原核細胞宿主、酵母等作為宿主的轉(zhuǎn)化體最好使用液體培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中可 以含有生育需要的碳源、氮源、無機物等。作為碳源，如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖 等、作為氮源，如銨鹽類、硝酸鹽類、玉米漿、胨、酪蛋白、肉提取物、麥芽提取物、大豆柏、馬 鈴薯提取液等無機或有機物質(zhì)、作為無機物，例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂、碳酸鈣等。 另外也可以添加酵母、維生素類、酪蛋白水解物、生長促進因子等。另外根據(jù)需要為了更有 效地使啟動子起作用，可以添加例如30 -吲哚丙烯酸那樣的藥劑。培養(yǎng)基的pH希望約 5?約8。
[0177] 培養(yǎng)例如對于大腸桿菌通常于約15?約45°C下進行約3?約75小時，根據(jù)需要， 也可以加通氣或攪拌。對宿主為動物細胞的轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)時，作為培養(yǎng)基可以使用例如 含有約5?約20%的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基、PRM1604培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基等。pH優(yōu)選約 6?8。培養(yǎng)通常于約30?約40°C下進行約15?約72小時，根據(jù)需要，也可以加通氣或 攪拌。表達所定基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體可以直接利用，也可以做成該細胞勻漿液利用，也可以將 所定基因的產(chǎn)物分離后使用。當從上述培養(yǎng)細胞提取時，培養(yǎng)后可以適當運用用眾所周知 的方法收集菌體或細胞，將它們懸浮于適當?shù)木彌_液中，通過超聲波、溶菌酶和/或凍融等 破壞菌體或細胞后，通過離心分離或過濾獲得粗提取液的方法等。在緩沖液中也可以加尿 素或鹽酸胍等蛋白質(zhì)變性劑、TritonX - 100 (商品名）、吐溫一 20 (商品名）等表面活性 齊U。對于目的生成物向培養(yǎng)液中分泌的場合，培養(yǎng)結束后，通過這方面眾所周知的方法將菌 體或細胞與上清分離開，收集上清。
[0178] 上述那樣得到的培養(yǎng)上清、或提取液中含有的目的生成物可以將以往眾所周知的 分離純化法適當組合對其進行純化，例如通過硫酸銨沉淀法等鹽析、通過交聯(lián)葡聚糖等凝 膠過濾法、使用帶有例如二乙基氨乙基或羧甲基等的載體的離子交換層析法、例如，使用帶 有丁基、辛基、苯基等疏水性基團的載體等的疏水性層析法、色素凝膠層析法、電泳法、透 析、超濾、親和層析法、高效液相層析法等進行純化獲得。理想的是可以通過聚丙烯凝膠電 泳、固定了配體等的親和層析等進行純化分離處理。例如作為配位體，如包括進行特異識別 的單克隆抗體的抗體或其片段、凝集素、糖、結合對的一方等。例如免疫親和層析、明膠一瓊 脂糖親和層析、肝素一瓊脂糖層析等。
[0179] 得到的本發(fā)明的多肽（或蛋白質(zhì)）可以再通過化學的手法對其含有的氨基酸殘基 進行修飾，或使用肽酶，例如胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶、肽 鏈外切酶等酶進行修飾，或進行部分分解后做成其衍生物等。本發(fā)明的多肽，C末端可以是 羧基（COOH)或羧化物（C00_)，也可以是酰胺（一 CONH2)或酯（COOR)。其中作為酯中的 R，除了可以使用甲基、乙基、n-丙基、異丙基或n- 丁基等C3 _8烷基、例如環(huán)戊基、環(huán)己基等 Cp6環(huán)烷基、例如苯、a-萘等C6_12芳香基、例如芐基、苯乙基等苯一 Cp2烷基或a-萘 甲基等a _萘一 C1 _ 2烷基等C7 _ 14芳烷基之外，還可以使用作為口服用酯廣泛使用的三甲 基乙酰氧甲基等。當本發(fā)明的蛋白質(zhì)C末端以外含有羧基（或羧化物）時，羧基被酰胺化 或酯化后的產(chǎn)物也包括在本發(fā)明的多肽中。作為此時的酯，例如可以使用上述的C末端的 醋等。
[0180] 另外，對于本發(fā)明的多肽（或蛋白質(zhì)），也包括在上述的多肽中，N末端的蛋氨酸殘 基的氨基被保護基（例如，甲酰基、乙?；菴 1 _ 5烷一羰基等C1 _ 6酰基等）保護的產(chǎn)物， N端側在生物體內(nèi)被切斷生成的谷?；M行焦谷氨?；漠a(chǎn)物、分子內(nèi)氨基酸的側鏈上的 取代基（例如，一 0H、一 C00H、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等）用適當?shù)谋Ｗo基（例如，甲酰 基、乙酰基等C1 _6?；龋┍Ｗo的產(chǎn)物、或結合了糖鏈的所謂糖蛋白等復合蛋白質(zhì)等。
[0181] 另外，通過使用以本發(fā)明涉及到的基因的堿基序列作為基礎的基因工程常用的 方法，例如在所定的多肽的氨基酸序列中適當?shù)刂脫Q、缺失、插入、轉(zhuǎn)移或附加1個或多個 以上氨基酸，可以制造導入了變異的適合的多肽。作為這樣的變異?變換?修飾法，例如 日本生化學會編、「續(xù)生化學實驗講座1、基因研究法II」、pl〇5(廣瀨進）、東京化學同人 (1986);日本生化學會編、「新生化學實驗講座2、核酸III (重組DNA技術）」、p233(廣瀨 進）、東京化學同人（1992) ;R.Wu，L Grossman，ed.，"Methods in Enzymology"，Vol. 154， p. 350&p. 367, Academic Press，New York(1987) ;R.Wu，L Grossman，ed.，"Methods in Enzymology,?, Vol. 100, p. 457&p. 468, Academic PressjNew York (1983) ；J. A. Wells et al.，Gene，34:315,1985 ;T.Grundstroem et al.，Nucleic Acids Res.，13:3305,1985 ; J. Taylor et al.，Nucleic Acids Res.，13:8765, 1985 ;R. Wu ed.，"Methods in E nzymology"，Vol. 155,p. 568,Academic Press, New York (1987) ；A. R. Oliphant et al.，Gene，44:177, 1986等所述的方法。例如，利用合成寡核苷酸等的指定位置導入 法（部位特異的突變導入法）（Zoller et al.，Nucleic Acids Res.，10:6487, 1987; Carter et al.，Nucleic Acids Res.， 13:4331， 1986)、盒（序列）突變導入法 (cassette mutagenesis:WelIs et al.，Gene，34:315, 1985)，限制部位選擇突變導入法 (restriction selection mutagenesis:Wells et al., Philos.Trans. R. Soc. London Ser A，317:415, 1986)，丙氨酸?掃描法（Cunningham&Wells，Science，244:1081-1085, 1989)， PCR突變導入法，Kunkel法，dNTP[ a S]法（Eckstein)，使用亞硫酸或亞硝酸等的指導區(qū)域 突變導入法等方法。
[0182] 另外，當用基因重組法進行制造時，以融合多肽（融合蛋白質(zhì)）使其表達，在生物 體內(nèi)或生物體外，也可以變換?加工為基本上與所期望的多肽具有同等生物學活性的多肽。 可以使用基因工程常用的融合產(chǎn)生法，這樣融合的多肽利用其融合部，通過親和層析等也 可以進行純化。作為這樣融合多肽，如可以與組氨酸盒融合的融合多肽，或與半乳糖 苷酶（e-gal)、麥芽糖結合蛋白質(zhì)（MBP)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)、硫氧還蛋白（TRX) 或Cre Recombinase融合的融合多肽。同樣，多肽可以附加異種的抗原表位的盒，通過使 用與該抗原表位特異結合的抗體的免疫親和層析也可以進行純化。在更適合的實施方式 中，如聚組氨酸（poly-His)或聚組氨酸-甘氨酸（poly-His-Gly)盒，而作為抗原表位盒， 例如 AU5, c-Myc，CruzTag 09, CruzTag22, CrzTag 41，Glu-Glu，HA，Ha.ll，KT3，F(xiàn)LAG(regis tered trademark，Sigma-Aldrich)，Omni-prbe，S-probe，T7, Lex A,V5,VP16, GAL4, VSV-G 等（Field et al.，Molecular and Cellular Biology，8:pp. 2159-2165(1988) ;Evan et al. , Molecular and Cellular Biology, 5:pp. 3610-3616 (1985) ；Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):pp. 547-553(1990) ；Hopp et al. , BioTechnologyj 6:pp .1204-1210(1988) ；Martin et al. , Scence, 255:pp. 192-194(1992) ；Skinner et al. , J. Bio. Chem. , 266:pp. 15163-15166 (1991) ；Lutz-Freyermuth et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87:pp. 6393-6397(1990)等）。也可以利用使用酵母雙雜交法。
[0183] 另外作為融合多肽，也可以是附加了變成可檢測蛋白質(zhì)那樣的標志的融合多肽。 在更合適的實施方式中，該可檢測標志可以是生物素/鏈抗生物素蛋白系的Biotin Avi Tag、發(fā)焚光的物質(zhì)等。作為發(fā)該焚光的物質(zhì)，如來自才^ >水母（Aequerea victorea)等 發(fā)光水母的綠色焚光蛋白（green fluorescent protein:GFP)、對其進行改變后的變異體 (GFP變異體）、例如EGFP(Enhance-humanized GFP)、rsGFP(red-shift GFP)，黃色焚光蛋白 (yellow fluorescent protein: YFP)，綠色焚光蛋白(green fluorescent protein:GFP)、 藍色焚光蛋白（cyan fluorescent protein:CFP)，青色焚光蛋白（blue fluorescent protein:BFP)，來自々$ ? 4夕(Renilla reniformis)的GFP等（宮脅敦史編、實驗醫(yī)學 另冊后基因組時代的實驗講座3 - GFP和Bioimaging、羊土公司（2000年））。也可以使用 特異識別上述融合蛋白的抗體（包括單克隆抗體和其片段）進行檢測。這樣的融合多肽的 表達和純化也可以使用適用于表達和純化的試劑盒，按照試劑盒制造者給出的程序?qū)嵤?br> [0184] 得到的蛋白質(zhì)（可以包括肽和多肽），通過酶免疫測定法等已知手法使它結合于 適當?shù)妮d體或固相，可以進行固定化。固相化蛋白質(zhì)、固相化肽可很便利地用于結合分析或 物質(zhì)的篩選。
[0185] 多肽或蛋白質(zhì)的結構的修飾?改變等可以參考例如日本生化學會編「新生化學實 驗講座I、蛋白質(zhì)VII、蛋白質(zhì)工程」東京化學同人（1993)，根據(jù)該文獻所述的方法或其引 用的文獻所述的方法、或與其基本上同樣的方法進行。在如下面所述的那樣的生物學活性 中，也可以包括免疫方面活性、例如抗原性。在該修飾?改變中，可以是脫氨基化、羥基化、 羧基化、磷酸化、硫酸化、甲基化等烷基化、乙?；弱；?、酯化、酰胺化、開環(huán)、閉環(huán)、糖基 化、向含糖鏈種類不同方面改變、將含糖鏈數(shù)增減、脂質(zhì)結合、對D-型氨基酸殘基的置換 等。這些方法都是在該領域已知的方法（例如、T.E. Creighton, Proteins:structure and molecular Properties，pp.79_86W.H.Freeman&Co.，San Francisco，USA(1983)等）。
[0186] 利用本發(fā)明的半乳凝素9突變體，可以篩選對該半乳凝素9的所定生物學活性等 功能（例如，細胞損傷活性、凋亡誘導活性、與糖皮質(zhì)激素類似的活性、抑制惡性細胞轉(zhuǎn)移 的活性等）促進的化合物（激動劑）或抑制的化合物（拮抗劑）或它們的鹽。這也意味著 可以提供該篩選試劑。因此，也可以提供有關利用在本發(fā)明中闡明的該半乳凝素9蛋白質(zhì) 等多肽、其一部分肽或它們的鹽表現(xiàn)出的活性的各種各樣的物質(zhì)，對本發(fā)明中該半乳凝素9 蛋白質(zhì)、其一部分肽或它們的鹽等表現(xiàn)出的活性等所定功能促進的化合物（激動劑）或抑 制的化合物（拮抗劑）或它們的鹽的篩選方法。
[0187] 在該篩選中，例如（i)使適當?shù)脑囼灅悠放c半乳凝素9突變體蛋白質(zhì)、其一部分肽 或它們的鹽（也包括表達該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體）等接觸的場合與（ii)在本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其 一部分肽或它們的鹽等中不存在問題的試驗樣品場合進行比較。具體來說，在上述篩選中， 測定、比較該生物學活性（例如，與各個半乳凝素9蛋白質(zhì)和生物體成分之間的相互作用有 關的活性等）。
[0188] 在該篩選系中也可以存在為了便于測定的適當?shù)臋z測用底物。作為該底物，只要 是在測定中可有效利用的，無論什么樣的都可以。例如，選用已知的眾所周知的底物，最好 是使用合成的化合物等。底物可以直接使用，但最好是使用用熒光素等熒光、酶或放射性物 質(zhì)標記的底物。
[0189] 作為試驗樣品，例如蛋白質(zhì)、肽、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、植物提取 物、動物等組織提取物、細胞提取物等。在試驗樣品中使用的試驗化合物的例子中最好含有 抗凝集素抗體、酶抑制劑、細胞因子、各種具有抑制活性的化合物、特別是合成化合物等。這 些化合物可以是新的化合物，也可以是眾所周知的化合物。該篩選可以根據(jù)通常的結合活 性或酶活性的測定法實施，例如可以參考該領域中眾所周知的方法等進行。另外，可以使用 各種標記、緩沖液系以及其它適當?shù)脑噭?，可以按照在此說明的操作進行。使用的肽等可以 用活化劑進行處理，也可以預先將其前體或潛在型的前體變換為活性型的前體。測定通常 在Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液等對反應沒有壞影響的那樣緩沖液等中，例如在pH約 4?約10(優(yōu)選pH約6?約8)中進行。當分別進行篩選時，在各個方法中的通常條件、操 作法中除了考慮同行通常技術外，可以構建與本發(fā)明的該半乳凝素9蛋白質(zhì)或與其基本上 具有同等活性的多肽或肽有關的測定系。有關這些一般的技術手段的詳細敘述可以參照綜 述、出版的書等[例如、Methods in Enzymology Academic Press公司（USA)發(fā)行等]。另 夕卜，凋亡誘導活性測定法等可以參考田沼靖一監(jiān)修、「細胞工程另冊：實驗程序系列、凋亡實 驗程序」株式會社秀潤社、1995年1月20日（第1版第2次印刷）等，也可以使用市售測 定試劑盒。
[0190] 使用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒得到的化合物或其鹽是從上述的試驗化合 物，例如肽、蛋白質(zhì)、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取物、植物提取物、動物 組織提取物等選擇的化合物，是促進或抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)等的功能的化合物。作為該化 合物的鹽，如藥學上容許的鹽等。例如，與無機堿基的鹽、與有機堿基的鹽、與無機酸的鹽、 與有機酸的鹽、與堿性或酸性氨基酸的鹽等。作為與無機堿基的鹽的合適例子，如鈉鹽、鉀 鹽等堿金屬鹽、鈣鹽、鎂鹽等堿土金屬鹽、以及鋁鹽、銨鹽等。作為與有機堿基的鹽的合適例 子，如與三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、2, 6-二堿基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇 胺、環(huán)己基胺、二環(huán)己基胺、N，N'_二芐基乙二胺等的鹽。作為與無機酸的鹽的合適例子，如 與鹽酸、溴氫酸、硫酸、磷酸等的鹽。作為與有機酸的鹽的合適的例子，例如與甲酸、醋酸、丙 酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸等的 鹽。而作為與堿性氨基酸的鹽的合適例子，如與精氨酸、賴氨酸、組氨酸等的鹽，作為與酸性 氨基酸的鹽的合適的例子，如與天冬氨酸、谷氨酸等的鹽。
[0191] 當將本發(fā)明的活性成分[例如（a)該半乳凝素9突變體多肽、其一部分的肽或它 們的鹽、與其相關的肽等、(b)編碼該半乳凝素突變體9或相關多肽的DNA等的核酸等、（c) 控制該半乳凝素9的問題活性的化合物（該半乳凝素9蛋白質(zhì)的毒害細胞活性、凋亡誘導 活性、對正常細胞沒有壞的影響，促進或抑制?阻礙起著所定功效的活性等現(xiàn)象、或促進或 抑制?阻礙組織或蛋白質(zhì)的變質(zhì)?過剩生產(chǎn)或分解現(xiàn)象達到生物學活性的化合物）或其 鹽、（d)使用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)等]作為藥物使用時，通?？梢詥为毣蚺c藥理上容許的 各種制劑輔助劑混合后，作為藥物組成物或藥物制備物等給予。最好是以適合經(jīng)口給藥、局 部給藥、或非經(jīng)口給藥等使用的制劑制備物的形態(tài)給藥，根據(jù)目的也可以通過任一種給藥 方式（也包括吸入法、或直腸給藥）給藥。
[0192] 另外，本發(fā)明的活性成分也可以配合各種藥物、例如抗腫瘤劑（抗癌劑）、腫瘤轉(zhuǎn) 移抑制劑、血栓形成抑制劑、關節(jié)破壞治療劑、鎮(zhèn)痛劑、消炎劑和/或免疫抑制劑使用，這些 制劑只要是具有有利的作用可以無限制地使用，例如可以從該領域中已知的制劑中選擇。
[0193] 而作為非經(jīng)口給藥方式，可以包括局部、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或腹腔 內(nèi)給藥，也可以直接向患部給藥，對于某些場合也適合。理想的是向包括人在內(nèi)的哺乳動 物經(jīng)口、或非經(jīng)口（例如，細胞內(nèi)、組織內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、胸腔內(nèi)、脊 髓腔內(nèi)、點滴法、注腸、經(jīng)直腸、點耳、點眼或點鼻、齒、向皮膚或粘膜涂布等）給藥。作為具 體的制劑制備物的形態(tài)，如溶液制劑、分散制劑、半固體制劑、粉粒體制劑、成型制劑、浸出 制劑等，例如片劑、包被片劑、加糖衣制劑、丸劑、口含片、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微膠囊劑、埋 入劑、粉末劑、散劑、顆粒劑、細粒劑、注射劑、液劑、酏劑、乳劑、灌注劑、糖漿、水劑、乳劑、懸 濁劑、擦劑、洗劑、氣霧劑、噴霧劑、吸入劑、噴霧劑、軟膏制劑、硬膏制劑、貼附劑、浴劑、濕潤 齊U、膏劑、油劑、栓劑（例如直腸栓劑）、酊劑、皮膚用水劑、點眼劑、點鼻劑、點耳劑、涂布劑、 輸液劑、用于注射用液劑等的粉末劑、冷凍干燥制劑、凝膠制備品等。
[0194] 藥物用的組成物可以根據(jù)通常的方法進行制劑化。例如，根據(jù)適當?shù)男枰?，可以?獨或組合使用生理學上認可的載體，作為藥物容許的載體、佐劑、賦形劑、輔形劑、稀釋劑、 香味劑、香料、甜味劑、媒介物、防腐劑、穩(wěn)定劑、結合劑、PH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、表面活性劑、基 齊IJ、溶劑、填充劑、增量劑、溶解輔助劑、可溶化劑、等滲劑、乳化劑、懸池化劑、分散劑、增粘 齊IJ、凝膠化劑、硬化劑、吸收劑、粘接劑、彈性劑、可塑劑、崩解劑、噴射劑、保存劑、抗氧化劑、 遮光劑、保濕劑、緩和劑、防止帶電劑、無痛化劑等，通過將它們一起與本發(fā)明的蛋白質(zhì)混 合，可以制造成一般認可的制劑實施中要求的單位用量形態(tài)。
[0195] 作為適于非經(jīng)口使用的制劑，活性成分與水或其它的藥學上容許的溶劑的無菌溶 液、或懸濁液劑等、例如注射劑等。一般來說，水、鹽水、葡萄糖水溶液、其它相關的糖的溶 液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇等乙二醇類可作為理想的注射劑用的液體載體。制備注射劑時， 使用蒸餾水、林格液、生理鹽水那樣的載體、適當?shù)姆稚┗驖窕瘎┖蛻覞峄旱龋迷擃I 域已知的方法制備成象溶液、懸濁液、乳劑那樣可以注射的形式。
[0196] 作為注射用的水性液，如包括生理鹽水、葡萄糖或其它的輔助藥（例如，D-山梨糖 醇、D-甘露糖醇、氯化鈉等）等滲液等，也可以與藥理上容許的適當溶解輔助劑、例如醇（例 如乙醇等）、聚醇（例如，丙二醇、聚乙二醇等）、非離子性表面活性劑（例如，聚山梨酯80?， HC0-50等）并用。作為油性液，如芝麻油、大豆油等，也可以與作為溶解輔助劑的苯甲酸芐 酯、芐酯醇等并用。另外，也可以與緩沖劑（例如，磷酸鹽緩沖液、醋酸鈉緩沖液等）或用于 浸透壓調(diào)節(jié)的試劑、無痛化劑（例如，殺藻胺、鹽酸普魯卡因等）、穩(wěn)定劑（例如，人血清白 蛋白、聚乙二醇等）、保存劑（例如，芐醇、酚等）、抗壞血酸等抗氧化劑、吸收促進劑等配合。 制備的注射液通常被填充到適當?shù)陌碴称恐小?br> [0197] 對于非經(jīng)口給藥，可以加或不加表面活性劑以及其它藥學上容許的助劑，做成水、 乙醇或油那樣的無菌的藥學上容許的液體中的溶液或懸濁液形式的制劑。作為制劑中使用 的油性載色劑或溶劑，如天然的、合成的或半合成的單、或雙、或三甘油酯類、天然的、合成 的或半合成的油脂類或脂肪酸類，例如，花生油、玉米油、大豆油、芝麻油等植物油。例如，該 注射劑可以按照含有〇. 1?10重量％程度的本發(fā)明化合物那樣制備。
[0198] 作為適用于局部、例如口腔或直腸使用的制劑，例如洗口劑、磨齒劑、口腔噴霧劑、 吸入劑、軟膏劑、牙科填充劑、牙科包被劑、牙科膏劑、栓劑等。作為洗口劑、其它牙科用劑， 可以使用藥理上容許的載體，通過慣用的方法制備。作為口腔噴霧劑、吸入劑，使本發(fā)明化 合物本身或與藥理上容許的非活性載體一起溶解于濕霧劑或噴霧器用的溶液，或做成吸入 用微粉末給予牙齒等。軟膏劑，可以添加通常使用的基劑、例如軟膏基劑（白色凡士林、石 蠟、橄欖油、聚乙烯二醇400、聚乙烯二醇軟膏等）等，通過慣用的方法制備。
[0199] 向牙、皮膚局部涂布用的藥品可以在適當滅菌的水或非水賦形劑的溶液或懸濁液 中配制、作為添加劑，如亞硫酸氫鈉或乙二胺四乙酸二鈉那樣的緩沖劑；含有醋酸或硝酸苯 汞、氯化烷基二甲基芐基銨或雙氯苯雙胍己烷那樣的滅菌和抗真菌劑的防腐劑和羥丙基甲 基纖維素（t ya ^ a - *)那樣的增稠劑。
[0200] 栓劑使用在該領域中眾所周知的載體、最好是非刺激性的適當?shù)妮o形劑、例如聚 乙二醇類、羊毛脂、可可脂、脂肪酸甘油三酯等載體，最好是在常溫下雖然是固體，但在腸道 的溫度下為液體，在直腸內(nèi)放出融解的藥物的載體等，通過慣用的方法制備，通常按照含有 0. 1?95重量％程度的本發(fā)明化合物那樣制備。由于使用的賦形劑和濃度不同，藥品可以 懸浮于或溶解于賦形劑中。象局部麻醉劑、防腐劑以及緩沖劑那樣的輔助藥可以溶解于賦 形劑中。適于作為經(jīng)口使用的制劑，如片劑、丸劑、膠囊、粉末劑、顆粒劑、口含片那樣的固形 組成物，或液劑、糖漿、懸濁劑那樣的液狀組成物等。制備制劑時，使用在該領域中已知的制 劑輔助劑等。片劑和丸劑還可制造成被糖衣包被。調(diào)劑單位方式為膠囊時，可以在上述類 型的材料中再含有油脂那樣的液狀載體。
[0201] 另外，活性成分為蛋白質(zhì)或多肽時，由于聚乙二醇（PEG)在哺乳動物中毒性極低， 所有與它結合特別有用。而與PEG結合，有時可以有效地減少異種性化合物的免疫原性以 及抗原性。該化合物也可以加入到微膠囊裝置中給予。象PEG那樣的聚合物可以簡單地附 著于在氨基末端的氨基酸的a-氨基、賴氨酸側鏈的e-氨基、天冬氨酸或谷氨酸的側鏈的 羧基、羧基末端的氨基酸的a -羧基、或某種天冬酰胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基的糖基鏈被活 化的衍生物上。
[0202] 已知有很多適于與蛋白質(zhì)直接反應的活化形式的PEG。作為對與蛋白質(zhì)的氨基 反應有用的PEG試劑，如羧酸、碳酸衍生物的活性酯、特別是解離基為N-羥基琥珀酰亞胺、 P-硝基苯酚、咪唑、或1-羥基-2-硝基苯-4-硫酸。同樣，含有氨基肼或酰肼基的PEG在通 過蛋白質(zhì)中的過碘化酸氧化生成的醛反應中有用。
[0203] 本發(fā)明的診斷和治療為了能夠適于也許哺乳動物表現(xiàn)出的特定的自身免疫等疾 患?疾病、包括癌等惡性腫瘤在內(nèi)的腫瘤、變態(tài)性疾患、炎癥等，通過對該哺乳動物進行診斷 開始實施的。為了監(jiān)測治療進行以及例如為了判斷是否要對正在進行的治療中的給予量 或給予次數(shù)那樣的參數(shù)進行改變，作為治療程序診斷可以在治療期間繼續(xù)進行。作為有助 于決定有關半乳凝素9突變體治療藥給予的適當性那樣的診斷手法，如哺乳動物中半乳凝 素9表達水平的分析、和從自身免疫的部位分離的淋巴細胞等細胞與靠近自身免疫部位的 淋巴細胞等細胞之間的這些細胞水平的比較等。要治療的哺乳動物的自身免疫疾患等疾 患?疾病、包括癌等惡性腫瘤在內(nèi)的腫瘤、變態(tài)性疾患、炎癥等通過檢測細胞內(nèi)的半乳凝素 9抗原可以進行監(jiān)測。這樣的監(jiān)測包括使來自哺乳動物的樣品與半乳凝素9特異的抗體接 觸，然后檢測與樣品結合的抗體。
[0204] 基因治療用載體是用于遞送為了在哺乳動物中表達要被遞送到哺乳動物的 本發(fā)明的治療藥的包括編碼序列（例如、半乳凝素9突變體編碼序列）在內(nèi)的構建物 (construct)的載體，或用于遞送半乳凝素9突變體的全部或部分，也包括用于遞送的核酸 序列的該構建物的載體，可以通過局部或全身的任一種方法給予。這些構建物可以在體內(nèi) 或體外，利用通過病毒載體的途徑或非病毒載體形式的途徑遞送。為了表達這樣的編碼序 列，可以通過使用內(nèi)源性的哺乳動物啟動子或異種啟動子誘導來進行。編碼序列在體內(nèi)的 表達可以是構建形式表達，或可調(diào)節(jié)地進行的任一種表達方式。當半乳凝素9突變體在哺 乳動物被表達時，可以以可溶性的半乳凝素9突變體表達，有時也可以以前體型半乳凝素9 突變體形式表達。在這兩種表達形式中或其中的任一種形式中，它們可以是例如整個的半 乳凝素9突變體、或半乳凝素9突變體的生物學的活性部分、變異體、衍生物、或融合體等。
[0205] 本發(fā)明提供可以表達所要的半乳凝素9突變體的核酸序列的基因遞送載體。作為 基因遞送載體，優(yōu)選病毒載體，更優(yōu)選逆病毒、腺病毒、腺隨伴病毒（AAV)、皰疹病毒、或甲病 毒等病毒載體等。作為病毒載體，如星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多泡病毒、副粘病毒、 細小病毒、細小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒等病毒載體。關于該基因遞送載體，一般 可參照D. Jolly, Cancer Gene Therapy, I (I) :51-64 (1994) ;0? Kimura et al.，Human Gene Therapy, 5:845-852(1994) ；S.Connelly et aI. , Human Gene Therapy, 6:185-193(1995)； M.G. Kaplitt et al.，Nature Genetics, 8:148-153 (1994)等。
[0206] 逆病毒載體在該領域都熟知的，例如、包括B型、C型、和D型逆病毒、xenotropic 逆病毒（例如、NZB-X1, NZB-X2, NZB9. I (R. R. 0' Neill, J. Virol.，53:100-106 (1985)參照） 等）、polytropic 逆病毒（例如、MCF，MCF-MLV(M. Kelly, J. Virol.，45:291-298(1983)參 照）等）、泡沫病毒、慢病毒等（參照R. L Weiss et al. (Eds.)，RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1985)在內(nèi)的任意逆病毒 基因治療載體在本發(fā)明中都可以使用。
[0207] 基因治療逆病毒載體的一部分可以是來自不同逆病毒的部分。例如、逆載體的LTR 可以是來自大白鼠肉瘤病毒的，tRNA結合部位可以是來自羅斯肉瘤病毒的，包裝信號可以 是來自大白鼠白血病病毒的，第二鏈合成起源可以是來自鳥白血癥病毒的。這些重組逆病 毒載體通過將它們導入適當?shù)陌b細胞株，可用于能形成可轉(zhuǎn)化的逆病毒載體粒子（參照 美國專利第5, 591，624號說明書）。逆病毒載體可以通過逆病毒粒子內(nèi)帶有的稱之為整合 酶的具有的將目的DNA部位特異地整合到宿主細胞的DNA中的能力的重組酶進行構建。作 為重組病毒載體，最好是復制能力缺損重組病毒。
[0208] 作為適合使用上述逆病毒載體的包裝細胞株，如該領域熟知的細胞株，而且容易 制備（參照美國專利第6, 013, 517號說明書，W092/05266)。該包裝細胞株可以在用于產(chǎn)生 重組載體粒子的生產(chǎn)細胞株（載體細胞株，vector cell line:VCL)中使用。包裝細胞株 最好是能夠在人血清中不進行活化，由人的親細胞（例如、HT1080細胞）或水貂的親細胞 株制作。
[0209] 作為逆病毒基因治療載體構建中理想的逆病毒，如鳥白血癥病毒、牛白血病病毒、 大白鼠白血病病毒、水貂細胞灶形成病毒、大白鼠肉瘤病毒、網(wǎng)狀細胞內(nèi)皮癥病毒、羅斯肉 瘤病毒等。作為大白鼠白血病病毒特別優(yōu)選的，例如、4070A和1504A (HartIey&Rowe，J. VirolO.，19:19-25(1976))、Abelson(ATCC No. VR-999)、Friend(ATCC No. VR-245)、 Graffi, Gross (ATCC No. VR-590)、Kirsten、Harvey 肉瘤病毒和 Rauscher (ATCC No. VR-998)、 以及莫洛尼小鼠白血病病毒（ATCC No. VR-190)等。
[0210] 這樣的逆病毒可以從美國典型培養(yǎng)物保藏所（ATCC, Rockville, Maryland, USA) 那樣的保藏機構或保存機構獲得，或使用通?？衫玫募夹g由已知的供給源分離。
[0211] 作為在本發(fā)明可使用的眾所周知的逆病毒基因治療載體的例子，如GB 2200651,EP 0415731,EP00345242, WO 89/02468, WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03662, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 93/10218, WO 91/02805、美國專利第 5, 219, 740 號說明書、同第 4, 405, 712 號說明書、同第4, 861，719號說明書、同第4, 980, 289號說明書、同第4, 777, 127號 說明書、同第 5,591,624 號說明書、Vile, Cancer Res, 53:3860-3864(1993)，Vil e,Cancer Res,53:962-967 (1993), Ra, Cancer Res, 53:83-88(1993), Takamiya, J Neurosci Res,33:493-503(1992), Baba, J Neurosurg,79:729-735 (1993), Mann, Cel I 33:153(1983), Cane, Proc Natl Acad Sci USA, 81:6349(1984), Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14(1990)等記載的例子。
[0212] 人的腺病毒基因治療載體在該領域中也是眾所周知的，可在本發(fā)明中使用，例如 可以參照 Berkne, Biotechniques, 6:616 (1988) ;Rosenfeld, Science, 252:431 (1991) ;W0 93/07283 ;W0 93/06223 ;W0 93/07282等。作為可在本發(fā)明中使用的已知的腺病毒基因 治療載體例子，如上述參考文獻所述的，例如、WO 94/12649 ;W0 93/03769 ;W0 93/19191; WO 94/28938 ；W0 95/11984 ；W0 95/00655 ；W0 95/27071 ；W0 95/29993 ；W0 95/34671； WO 96/05320 ；W0 94/08026 ；W0 94/11506 ；W0 93/06223 ；W0 94/24299 ；W0 95/14102； WO 95/24297 ；W0 95/02697 ；W0 94/28152 ；W0 94/24299 ；W0 95/09241 ；W0 95/25807 ； TO 95/05835 ;W0 94/18922 ;W0 95/09654 等所述的例子。另外，就像 Curiel, Human Gene Therapy，3:147-154(1992)所述那樣，也可以給予連接在滅活的腺病毒的DNA。
[0213] 另外作為本發(fā)明的基因遞送載體，如腺病毒隨伴病毒（AAV)載體。這樣的載體中 用于本發(fā)明的理想例子，如象WO 93/09239公布的那樣源于AAV-2的載體。作為最理想的 AAV載體，是含有2個AAV的逆末端反復序列的載體。該載體天然的D序列由于核苷酸置 換被改變，其結果應當至少還維持著5個天然型核苷酸和直至18個天然型核苷酸（優(yōu)選 至少10個天然型核苷酸和直至18個天然型核苷酸、最優(yōu)選10個天然型核苷酸），D序列 剩下的核苷酸缺失，或被非天然型的核苷酸置換。AAV逆末端反復領域的天然型D序列是 在各AAV逆末端反復序列中含有20個連續(xù)核苷酸的序列（即在各末端存在一個序列），該 序列與HP形成無關。非天然型置換的核苷酸可以是與在同一部位天然型的D序列中發(fā)現(xiàn) 的核苷酸不同的任意的核苷酸。作為其它的可使用的AAV載體的例子，如pWP-19、pWN-1 等（Nahreini, Gene, 124:257-262(1993))。作為這樣的 AAV 載體的其它例子，如 psub201 等（Samulski，J. Virol. ,61:3096 (1987))。作為其它的 AAV 載體例子，如 Double-D ITR 載 體等。制作Double-D ITR的方法如美國專利第5, 478, 745號說明書公布的方法。此外， AAV載體如美國專利第4, 797, 368號說明書、同第5, 139, 941號說明書、同第5, 474, 935號 說明書、WO 94/288157號等公布的載體。作為可在本發(fā)明利用的另外的AAV載體例子，如 SSV9AFABTKneo，該載體含有AFPO增強子和白蛋白啟動子，而且傾向于在肝臟中優(yōu)先表達。 其結構和制作方法如Su，Human Gene Therapy, 7:463-470(1996)公布的方法。作為其它 的AAV基因治療載體，如美國專利第5, 354, 678號說明書、同第5, 173, 414號說明書、同第 5, 139, 941號說明書、同第5, 252, 479號說明書等記載的載體。
[0214] 本發(fā)明的基因治療載體可以是皰疹載體。作為主要的皰疹載體的理想例子， 如含有編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶多肽序列的單純皰疹病毒載體（例如、美國專利 第5, 288, 641號說明書和EP 0176170公布的載體）。作為單純皰疹病毒載體的例子 如 WO 95/04139 等公布的 HFEM/ICP6-LacZ, Geller, Science, 241:1667-1669 (1988)、 W090/09441、W0 92/07945 等記載的 pHSVlac, Fink, Human Gene Therapy, 3:11-19 (1992)記 載的 HSV Us3: :pgC-lacZ、EP 0453242 A 記載的 HSV7134, 2RH 105 和 GAL4、以保藏號 ATCC VR-977和ATCC VR-260寄托于ATCC的載體等。
[0215] 在本發(fā)明中也可以使用甲病毒基因治療載體。作為理想的甲病毒載體，如新培斯 病毒載體、披膜病毒、Semliki Forest 病毒（ATCC VR-607;ATCC VR-1247)、Middleberg 病 毒（ATCC VR-370)、Ross River 病毒（ATCC VR-373;ATCC VR-1246)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病 毒（ATCC VR923 ;ATCC VR-1250 ;ATCC VR-1249 ;ATCC VR-532)、美國專利第 5, 091，309 號、 同第5, 217, 879號、和WO 92/10578記載的載體等。另外作為可使用的甲病毒載體，如美 國專利第5, 091，309號說明書、同第5, 217, 879號說明書、同第5, 843, 723號說明書、同第 6,376,236號說明書、恥94/21792、恥92/10578、恥95/07994等記載的載體。這樣的甲病 毒可以從ATCC(Rockville, Maryland, USA)那樣的保藏機構或保存機構獲得，或使用通常 可利用的技術從已知的供給源分離。最好是能夠使用細胞傷害性可降低的甲病毒載體（參 照美國專利第6, 391，632號說明書）。
[0216] DNA載體系（例如、真核生物級聯(lián)式表達系（eukarytic layered expression system)等）在用于表達本發(fā)明的半乳凝素9突變體的核酸中是有用的。有關真核生物級 聯(lián)式表達系的詳細情況可以參照W095/07994。作為本發(fā)明的真核生物級聯(lián)式表達系最好是 來自甲病毒載體的，優(yōu)選來自新培斯病毒載體的表達系。
[0217] 作為適合本發(fā)明使用的其它病毒載體，如來自脊髓灰質(zhì)炎病毒（例如、ATCC VR-5 8, Evans, Nature, 339:385 (1989)，Sabin, J. Biol. Standardization, 1:115 (1973)等記載的 病毒等）；鼻病毒（例如、ATCC VR-IllO和Arnold, J. Cell Biochem, L401-405(1990)記載的 病毒等）；痘病毒（例如、金絲雀痘病毒等）或痘苗病毒（例如、ATCC VR-111，ATCC VR-2010 等、Fisher-Hoch，Proc Natl Acad Sci USA，86:317(1989)，F(xiàn)lexner，Ann NY Acad Sci， 569:86 (1989)，F(xiàn)lexner, Vaccine, 8:17 (1990)、美國專利第 4, 603, 112 號說明書以及同第 4, 769, 330號說明書、和WO 89/01973中記載的病痘毒等）；SV40病毒（例如、ATCC VR-305 和 Mulligan, Nature, 277:108 (1979)和 Madzak, J. Gen. Vir, 73:1533 (1992)中記載的病毒 等）；流感病毒（例如、ATCC VR-797等）、使用美國專利第5, 166,057號說明書411&1^，？1'〇(3 Natl Acad Sci USA, 87:3802-3805(1990), Enami & Palese1J Virol, 65:2711-2713(1991 ),Luytjes, Cell, 59:110(1989), McMicheal., N E J Med, 309:13(1983), Yap, Nature, 273: 238 (1978)、以及Nature, 277:108 (1979)等中記載的那樣的逆遺傳學技術制作的重組流感 病毒；EP 0386882、Ruchschacher, J. Vir.，66:2731 (1992)等記載的人免疫不全癥病毒；麻 疹病毒（例如、ATCC VR-67，VR-1247以及EP 0440219記載的病毒等）；奧拉病毒（例如、 ATCC VR-368 等）；Bebaru 病毒（例如、ATCC VR-600 和 ATCC VR-1240 等）；Cabassou 病 毒（例如、ATCC VR-922 等）；奇昆貢亞病毒（例如、ATCC VR-64, ATCC VR-1241 等）；Fort Morgan 病毒（例如、ATCC VR_924 等）；Getah 病毒（例如、ATCC VR_369, ATCC VR-IM3 等）；Kyzylagach病毒（例如、ATCC VR-927等）；馬亞羅病毒（例如、ATCCVR-66等）；穆 茨布病毒（例如、ATCC VR-580，ATCC VR-1244等）；恩杜姆病毒（例如、ATCC VR-371等）； Pixuna病毒（例如、ATCC VR-372，ATCC VR-1245 等）Jonate 病毒（例如、ATCCVR-925 等）； Triniti 病毒（例如、ATCC VR-469 等）；Una 病毒（例如、ATCC VR-374 等）；Whataroa 病 毒（例如、ATCC VR-926 等）；Y-62-33 病毒（例如、ATCC VR-375 等）；0' Nyong 病毒、東部 腦炎病毒（例如、ATCC VR-65，ATCC VR-1242等）；西部腦炎病毒（例如、ATCC VR-70，ATCC VR-125L, ATCC VR-622, ATCC VR-1252 等）；冠狀病毒（例如、ATCC VR-740, Hamre, Proc Soc Exp Biol Med, 121:190(1966)記載的病毒）的載體等。
[0218] 將本發(fā)明的組成物向細胞遞送不限定于上述的病毒載體。也可以使用其它的 遞送方法和媒體，作為這樣的方法和媒體，例如核酸表達載體、只與滅活的腺病毒連結的 多陽離子性復合體DNA(例如參照Curiel, Hum Gene Ther, 3:147-154(1992))、配位體連 結DNA (例如參照Wu，J Biol Chem, 64:16985-16987(1989))、真核生物細胞遞送載體細胞 (例如、參照美國專利第6, 013, 517號說明書、同第6, 015, 686號說明書等）、光聚合的水 凝膠物質(zhì)沉淀物、象美國專利第5, 149, 655號說明書記載的那樣的攜帶型基因?qū)肓Ｗ?槍、W092/11033記載的電離放射線法、核電荷中和法、或與細胞膜的融合法等。另外作為手 法如 Philip，Mol Cell Biol, 14:2411-2418(1994)，Woffendin，Proc NaOOOOtl Acad Sci USA, 91:1581-585 (1994)記載的方法等。
[0219] 也可以使用粒子媒介基因轉(zhuǎn)移技術，序列被插入到用于高水平表達的含有慣用 的調(diào)控序列的通常載體，然后與被連接在合成基因轉(zhuǎn)移分子（例如、細胞靶配位體（例 如、Wu et al.，J. Biol. Chem. ,262:4429-4432(1987)記載的那樣的脫唾液酸類黏蛋白、 Hucked, Biochem Pharmacol, 40:253-263 (1990)記載那樣的膜島素、Plank, Bioconjugate Chem，3:533-539(1992)記載的那樣的半乳糖、乳糖、或鐵傳遞蛋白等）的聚賴氨酸、魚精蛋 白、和白蛋白那樣的聚合性DNA結合陽離子溫育。
[0220] 也可以使用裸DNA，例如、作為裸DNA的導入方法如WO 90/11092和美國專利第 5, 580, 859號說明書記載的方法等。收率使用生物降解性乳膠珠可以改善。DNA包被乳膠 珠，該珠被胞飲后可有效地輸送到細胞內(nèi)。該方法使疏水性增大，由此通過使包裹小泡破裂 和使DNA釋放到細胞質(zhì)那樣的珠處理可以進一步改善。
[0221] 作為基因遞送載體可以起作用的那樣脂質(zhì)體如美國專利第5, 422, 120號說明書、 WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/144445 和 EP 524, 968 記載的。在非病毒的遞送法中， 編碼半乳凝素9突變體多肽的核酸序列可以被插入到用于高水平表達的通常含有調(diào)控序 列的慣用的載體，然后與合成基因?qū)敕肿訙赜?。作為該合成基因?qū)敕肿樱缗c細胞靶 的配位體（例如、脫唾液酸血清類粘蛋白、胰島素、半乳糖、乳糖、鐵傳遞蛋白等）連接的聚 合性DNA結合陽離子。作為聚合性DNA結合陽離子，例如、聚賴氨酸、魚精蛋白、白蛋白等。 作為其它的遞送系，例如可以使用用于將含有多種組織特異的或普遍活性的啟動子調(diào)控下 的基因的DNA膠囊化的脂質(zhì)體。作為適合使用的非病毒的遞送法，如機械遞送系（例如、 WofTendin et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (24) :11581-11585 (1994)記載的手法）。
[0222] 另外編碼序列和這樣的表達產(chǎn)物可以通過光聚合的水凝膠物質(zhì)的沉淀遞送。作為 可用于遞送編碼序列的基因遞送的其它方法，例如、使用美國專利第5, 149, 655號00說明 書記載的攜帶型基因?qū)肓Ｗ訕尩姆椒?、WO 92/11033記載那樣的為了對導入的基因進行 活化使用電離放射線的方法等。
[0223] 作為脂質(zhì)體和多陽離子性基因遞送載體的例子，如美國專利第5, 422, 120號說 明書和同第 4,762,915 說明書、恥 95/13796，恥94/23697，恥 91/14445，￡? 0524968,3 tryer, Biochemistry, 236-240 (1975),ff.H.Freeman et al. , Biochem Biophys Acta,600:I (1980), Bayer, Biochem Biophys Acta,550:464(1979), Rivnay, Meth Enzymol,149:119(1987), Wang, Proc Natl Acad Sci USA,84:7851 (1987), Plant, Anal OBiochem, 176:420(1989)等記載的載體。
[0224] 本發(fā)明公布了對陷于包含包括癌等惡性腫瘤在內(nèi)的腫瘤、變態(tài)性疾患、炎癥、免疫 異常、活化淋巴細胞（特別是活化T細胞，也可包括活化B細胞）的自身免疫疾患等疾患和 疾病的哺乳動物通過給予半乳凝素9突變體或來自半乳凝素9突變體的治療劑（例如、作 為治療活性成分含有半乳凝素9突變體多肽或用于在哺乳動物中表達的編碼半乳凝素9突 變體多肽的聚核苷酸等的組成物）進行治療的方法。作為可以通過本發(fā)明的方法和組成物 治療的自身免疫疾患，如任意的自身免疫疾患或移植排斥（例如、包括本說明書中列舉的 自身免疫疾患，但不限定于這些）。
[0225] 半乳凝素9突變體例如可以以通過重組技術表達的多肽、或半乳凝素9突變體多 肽的突變體、其衍生物、或它的融合蛋白質(zhì)形式給予，可以通過局部或全身任一種方式遞送 給哺乳動物。編碼半乳凝素9突變體、半乳凝素9突變體的衍生物或突變體、或半乳凝素9 突變體融合體的核酸（DNA、RNA等）在基因治療程序中可以以包含用于在哺乳動物中表達 的調(diào)節(jié)區(qū)的裸質(zhì)粒DNA形式，或通過用于在哺乳動物中表達的病毒載體給予。用于表達的 半乳凝素9突變體多肽的遞送可以使用使遞送變得容易的那樣的藥學上容許的載體完成。 對有自身免疫疾患的哺乳動物用來自半乳凝素9突變體的治療劑進行治療后，可以使自身 免疫疾患改善或緩解，或使起因于自身免疫的臨床癥狀消失。
[0226] 本發(fā)明不受本發(fā)明公開的治療劑怎樣起作用的理論限定，而是應當由引起自己識 另IJ，然后傷害自身免疫的活化T細胞等決定。通過表達半乳凝素9突變體，或是使半乳凝素 9突變體表達，或給予來自半乳凝素9突變體治療劑，有問題的活化淋巴細胞受到可利用的 半乳凝素9突變體的影響，優(yōu)先成為靶子，進行凋亡。半乳凝素9突變體多肽或來自半乳凝 素9突變體治療劑可以投到表現(xiàn)出自身免疫的區(qū)域（例如、進行治療的表現(xiàn)出特定自身免 疫疾患特征那樣的局部區(qū)域）。由此，給予的半乳凝素9突變體以及其它治療劑與在該區(qū)域 的細胞表達的具有靶標的活化T細胞等之間的接觸被最適化。因此，該區(qū)域的細胞成了借 助于基因遞送載體的幫助被投到該區(qū)域的編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸表達時 的良好的候補。由此對本發(fā)明進行各種變更、運用，按照能夠使半乳凝素9突變體多肽表達 那樣進行操作，可以在處于被活化T細胞等攻擊下的細胞中進行表達。對于移植排斥的場 合，例如與能夠結合很多細胞型的在細胞表面上遍在表達的蛋白質(zhì)的分子結合部融合的半 乳凝素9突變體多肽。該結合部分，例如可以是肝素，而結合的細胞表面上的分子也可以是 葡糖胺聚糖。另外該結合部分也可以是對任意選擇的細胞表面抗原特異的單鏈抗體的結合 結構域。
[0227] 關于本發(fā)明，對于包括癌等惡性腫瘤細胞在內(nèi)的腫瘤細胞獲得細胞傷害作用，或 獲得抗變態(tài)性作用，或獲得抗炎癥作用，或使免疫異常正?；?，對于活化淋巴細胞（特別是 也可以包括活化T細胞）誘導凋亡的場合都應當與上述自身免疫的場合同樣理解。
[0228] 本說明書中使用的「給藥」或「進行給藥」指的是將治療劑或治療劑的配合物遞送 到哺乳動物的過程。給藥過程可以因治療劑（單個或多個的治療劑）和所期望的效果不同 進行改變。給藥可以通過例如非經(jīng)口的遞送或經(jīng)口的遞送等適合治療劑的任意手段完成。 作為非經(jīng)口的遞送，例如向皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)遞送、向器官組織的注射、通過粘 膜、肺、局部的或通過導管遞送等。經(jīng)口的手段是經(jīng)由口給藥的手段，例如、可以使用片劑或 其它經(jīng)由胃腸的遞送手段（包括可飲用的液體）等進行。作為經(jīng)由粘膜的遞送，例如鼻腔 內(nèi)遞送等。作為經(jīng)由肺的遞送，可以使藥劑吸入。給藥一般來說也可以通過使用藥學上容 許的載體（例如、緩沖液、多肽、肽、云芝多糖綴合物、脂質(zhì)體、脂等）遞送進行。基因治療程 序包括作為治療劑認為可以給予在哺乳動物以轉(zhuǎn)錄物或多肽形式表達時能夠達到治療目 的聚核苷酸的場合，也可適用于非經(jīng)口的遞送手段和經(jīng)口的遞送手段中任一種手段。這樣 的給藥手段可以按照適合治療的疾患情況進行選擇。例如，疾患為器官基底的場合，遞送可 以是局部遞送，例如，疾患為全身的場合，遞送可以是全身的。所謂聯(lián)合用藥指的是在對某 患者的治療中再給予一種或一種以上的治療劑。治療劑可以使用同樣的藥學的載體給予， 或也可以使用不同的載體給予。這些載體可以通過同樣的或不同的給予手段給予。藥劑可 以是同型的藥劑，或不同型的藥劑，例如、作為不同型，如聚核苷酸、多肽、或低分子的藥劑。 給藥時間可以是恰好同一時間，1種治療劑也可以在另外的藥劑之前或之后給藥。因此聯(lián)合 用藥可以同時，也可以連續(xù)進行。用于將治療劑做成所定的組合的正確程序可以在考慮藥 劑和按照其它考慮已治療的狀態(tài)后決定。
[0229] 所謂用語「體內(nèi)給藥」指的是為了在哺乳動物中表達，將編碼多肽的聚核苷酸投給 患者（例如、哺乳動物）。特別是作為直接的體內(nèi)給藥，如細胞不從哺乳動物取出，而是通過 編碼序列轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞。因此作為直接的體內(nèi)給藥，為了在患者細胞中發(fā)生表達，可以 直接將編碼目的多肽的DNA直接注射到陷于自身免疫疾患煩惱的區(qū)域。
[0230] 用語「體外給藥」指的是將細胞從患者（例如、哺乳動物）中取出后，對細胞（例 如、來自于處于自身免疫攻擊下的細胞集団的細胞）進行轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染后，細胞被返回到 哺乳動物。體外給藥是將細胞從哺乳動物取出，根據(jù)需要，選擇要轉(zhuǎn)化的細胞（即受到自身 免疫機構攻擊下的細胞），要將被選擇的細胞做成不能復制，將選擇的細胞用編碼要表達的 基因（即半乳凝素9突變體）的聚核苷酸（為了使表達容易進行也可含有調(diào)節(jié)區(qū)域）進行 轉(zhuǎn)化，為了使半乳凝素9突變體表達，通過將被轉(zhuǎn)化的細胞返回到患者達到。
[0231] 作為治療的有效量，指的是產(chǎn)生所期望的治療結果那樣的量。例如、當所期望的治 療效果是自身免疫治愈時，所謂的治療的有效量指的是容易達到治愈的那樣的量。所謂治 療上有用的量可以是例如、在包括數(shù)日或數(shù)周間給藥那樣的投藥程序中投給的那樣的量。 治療效果，例如在自身免疫疾患的癥狀出現(xiàn)期間，可以使哺乳動物的自身免疫應答的影響 降低時在哺乳動物中用于獲得這樣效果的藥劑的有效量指的是造成自身免疫的癥狀減少 那樣的量。
[0232] 用語「藥學上容許的載體」指的是用于給予治療劑（例如、多肽、聚核苷酸、低分 子、肽性物質(zhì)、肽等）載體,載體本身不誘導接受組成物的個體產(chǎn)生有害的抗體,而且不能 產(chǎn)生有問題那樣的毒性，可以給予的那樣的任意的藥學上容許的載體。在本發(fā)明的另外方 式中，提供與藥學上容許的載體或稀釋劑組合，含有上述那樣的重組病毒載體的藥學的組 成物。這樣的藥學的組成物可以是液體溶液形式的組成物，或制備成在給予前可懸浮于溶 液的固體形式（例如、冷凍干燥的產(chǎn)品）。另外，該組成物也可以使用適合于給予表面，或 注射，或經(jīng)口給予，或經(jīng)直腸給予的載體或稀釋劑進行制備。作為藥學上容許的載體或稀釋 齊U，在使用的給予量和濃度下對接受者（recipient)基本上是無毒的。作為用于可注射的 溶液的載體或稀釋劑的代表例子，如水、等滲生理食鹽水溶液（理想的是在生理PH下具有 緩沖的溶液、例如、磷酸緩沖生理鹽水、Tris緩沖生理鹽水等）、甘露醇、葡萄糖、甘油糖、乙 醇、多肽或蛋白質(zhì)（例如、人血清白蛋白）等。載體或重組病毒可以加入到含有l(wèi)Omg/ml甘 露醇、lmg/ml HSA、20mM Tris(pH7. 2)、和150mM NaCl的藥學的組成物后進行遞送。此時重 組載體約為Ig物質(zhì)，高分子物質(zhì)不到1 %，總物質(zhì)量（包括水）在1/100, 〇〇〇以下。該組成 物至少了在20°C下穩(wěn)定6個月間。
[0233] 本發(fā)明的藥學的組成物可以含有刺激細胞分裂的因子，因此可以含有整合重組逆 病毒載體，刺激組合的因子。重組病毒的保存法可以參照美國專利第5, 792, 643號說明書 記載的保存法。
[0234] 用于實施本發(fā)明提供的治療法的所有治療劑可以加入到含有治療藥用的藥學上 容許的載體的適當?shù)乃帉W組成物。用于治療藥的藥學載體可以是同樣的，也可以因各個治 療藥不同而不一樣。作為合適的載體，可以是大的、而且代謝緩慢的巨大分子（例如、蛋白 質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、粒子中的不活性病毒等）。這樣的 載體對于同行眾所周知。
[0235] 作為藥學上容許的鹽，例如無機酸鹽（例如鹽酸鹽、溴氫酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽 等）；有機酸鹽（例如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等）），這些鹽可以加入到該 組成物后使用。有關藥學上容許的賦形劑可以參照例如Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J.，USA, 1991)。作為治療組成物中的藥學上容許的載體，例如 水、生理鹽水、甘油糖、乙醇等液體。作為助劑，例如濕潤劑、乳化劑等，也可以將pH緩沖物 質(zhì)等加入到這樣的載體中。代表性的治療組成物可以制備成可以注射的任一種液體溶液或 懸浮物；在注射前制備成可以使用液體載體適合做成液體或懸浮物的固體形態(tài)載體。在藥 學上容許的載體的定義內(nèi)也包含脂質(zhì)體。
[0236] 還可以提供與藥學上容許的載體或稀釋劑組合，包含有重組逆病毒或一個上述的 載體構建物的病毒的藥學組成物。該組成物可以制備成液體溶液或在給予前可懸浮于溶液 的固體形式（例如、冷凍干燥的產(chǎn)品）中任一種。另外，該組成物也可以使用適合于給予表 面，或注射，或經(jīng)口給予，或經(jīng)直腸給予的載體或稀釋劑進行制備。
[0237] 作為藥學上容許的載體或稀釋劑，在使用的給予量和濃度下對接受者 (recipient)基本上是無毒的。作為用于可注射的溶液的載體或稀釋劑的代表例子，如水、 等滲生理食鹽水溶液（理想的是在生理pH下有緩沖作用的溶液、例如、磷酸緩沖生理鹽水、 Tris緩沖生理鹽水等）、甘露醇、葡萄糖、甘油糖、乙醇、多肽或蛋白質(zhì)（例如人血清白蛋白） 等。載體或重組病毒可以加入到含有l(wèi)Omg/ml甘露醇、lmg/mlHSA、20mM Tris(pH7.2)、和 150mM NaCl的藥學組成物后進行遞送。此時重組載體約為Ig物質(zhì)，高分子物質(zhì)不到1 %， 總物質(zhì)量（包括水）在1/100, 〇〇〇以下。該組成物至少了在20°C下穩(wěn)定6個月間。
[0238] 藥學上容許的載體或稀釋劑為了能夠做成液體溶液或給藥前能夠懸浮于溶液的 固體方式（例如、冷凍干燥的方式）中的任一種方式的組成物，可以與基因遞送載體組合。 2個以上的基因遞送載體可以借助于代表性的傳統(tǒng)的直接途徑例如頰/舌下、直腸、經(jīng)口、 經(jīng)鼻、局部（例如、經(jīng)皮和眼等）、陰道、肺、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、鼻腔內(nèi)、或 靜脈內(nèi)），或間接給藥。
[0239] 本發(fā)明的治療藥可以任意地含有例如用于在哺乳動物中表達的聚核苷酸，該治 療藥可以根據(jù)該領域中眾所周知的方法，制作成腸溶性片劑和膠囊劑等制劑。這些可以 參照以下的專利：例如、美國專利第4, 853, 230號說明書、EP 225, 189、AU 9, 224, 296、AU 9, 230, 801、和WO 92144, 52等。這樣的膠囊可以經(jīng)口給予，以腸為靶。經(jīng)口給藥后1?4 日，通過使用抗該蛋白質(zhì)的抗體等測定血漿和血液決定例如多肽的表達是否在進行，或例 如是否發(fā)生由核酶或反義寡核苷酸引起的表達被抑制。
[0240] 基因遞送載體可以象例如美國專利第4, 411，648號說明書、同第5, 222, 936號說 明書、同第5, 286, 254號說明書、WO 94/05369等記載的那樣，通過例如注射、粒子槍、局部 給藥、非經(jīng)口給藥、吸入、或離子導入遞送等導入哺乳動物。
[0241] 治療組成物或治療劑也可以與能夠改善包括癌等惡性腫瘤在內(nèi)的腫瘤、變態(tài)性 癥、炎癥、免疫異常、自身免疫疾患那樣的其它治療劑、或能夠增強給予半乳凝素9突變體 治療劑獲得的治療上利益那樣的其它治療劑一起給予。例如、在為了治療變態(tài)性反應給予 時，為了能夠在存在于粘膜、鼻、支氣管、肺等組織的細胞中表達，可以給予半乳凝素9突變 體聚核苷酸的氣霧，為了更有利，例如在變態(tài)性反應平息之前的期間，每日數(shù)次、通過鼻用 噴霧或氣霧噴霧反復給藥。
[0242] 基因遞送載體可以直接給到哺乳動物的單一部位或多個部位，例如可以通過直接 注射給予?；蜻f送載體也可以使用通過體外轉(zhuǎn)化導入的靶細胞給予。本發(fā)明還提供適合 基因遞送載體給予的藥學組成物（包括例如各種賦形劑）。
[0243] 可以將半乳凝素9突變體多肽、其突變體、衍生物、類似物、變異體、或指示嵌合表 達的載體構建物直接給予包括癌等惡性腫瘤在內(nèi)的腫瘤部位、表現(xiàn)出變態(tài)性的部位、炎癥 部位、表現(xiàn)出免疫異常的部位、表現(xiàn)出自身免疫的部位（例如、胰臟、腎臟、肝臟、關節(jié)、腦、 脊髓液、皮膚、或身體其它區(qū)域或器官）。為了直接給予載體構建物，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以 使用各種各樣的方法。例如、如果已鑒定有在某區(qū)域起作用的動脈的話，為了直接將載體遞 送到該部位，可以注射到這樣的動脈中。同樣通過使用例如含有載體構建物的局所用藥劑 組成物，可以將載體構建物直接給到皮膚表面。
[0244] 在直接給藥中，可以將半乳凝素9突變體治療劑和含有其它的抗自身免疫藥劑的 配合治療劑一起給予。聯(lián)合用藥可以同時進行，例如，通過在同一載體中放置編碼藥劑的聚 核苷酸，不管是聚核苷酸、多肽、其它的藥物，將藥劑加入到同一藥劑組成物中，或可以在幾 乎同一時間，幾乎同一位置將藥劑加入到可以注射的其它的藥劑組成物中然后給予可以完 成聯(lián)合用藥。不同時進行聯(lián)合用藥時（例如，給予藥物前體激活劑后，給予藥物前體那樣的 場合）、第2個藥劑為了適合治療目的，可以通過直接注射給藥。因此，象例如給予藥物前體 那樣的場合，藥物前體應當給到與藥物前體激活劑同一部位。因此作為聯(lián)合用藥程序，可以 含有用于達到治療目的的給藥組合。另外，聯(lián)合用藥根據(jù)需要，可以包括之后給藥（例如， 反復進行體內(nèi)直接注射給予半乳凝素9突變體治療那樣的方式）。
[0245] 本發(fā)明中，取出的細胞應當理解為能夠返回到同一動物或另外的同種異系的動物 或哺乳動物的細胞。這樣的場合，一般來說，組織適合性最好是符合該動物（并非限定于此， 例如參照 Yamamoto et al.，AIDS Research and Human Retroviruses, 7:911-922(1991); Yamamoto et al. , Journal of Virology, 67:601-605(1993))〇
[0246] 可以從患者的各個部位取出細胞。另外在本發(fā)明的其它的實施方式中，可以將載 體構建物導入到例如來自皮膚的細胞（皮膚成纖維細胞等）或來自血液的細胞（例如、夕卜 周血白細胞等）?？梢詮难禾禺惾〕鏊谕?、細胞的特定級分（例如、T細胞部分集合 或干細胞等）（參照例如、WO 91/16116)。然后利用任意的上述技術使取出細胞與載體構建 物接觸，然后將該細胞返回到溫血動物（最好是表現(xiàn)出自身免疫的區(qū)域付近或付近內(nèi)）。
[0247] 例如一旦對哺乳動物等患者進行診斷，進行包括給予半乳凝素9突變體治療劑， 或按照適于治療的特定疾患?疾?。ɡ纭⒛[瘤、變態(tài)性、自身免疫疾患等）的手法和用量 將該治療劑給予哺乳動物，以及為了決定有無必要連續(xù)給予治療劑或修正給予進行監(jiān)測哺 乳動物等在內(nèi)的本發(fā)明的實施。本發(fā)明中所謂實施包括對治療的疾患進行鑒定，決定可適 用于靶基因治療的有希望細胞型或身體區(qū)域。構建半乳凝素9突變體聚核苷酸（含有用于 在哺乳動物中表達的調(diào)節(jié)區(qū)域的質(zhì)粒、或含有用于表達的病毒載體），取出一些哺乳動物細 胞，再用編碼半乳凝素9突變體的聚核苷酸進行轉(zhuǎn)染處理，然后為了使半乳凝素9突變體表 達，加入到哺乳動物中。或者，聚核苷酸例如為了在疾患清楚的區(qū)域中進行表達可以投給哺 乳動物。
[0248] 因此，例如對于惡性腫瘤細胞的場合，通過在體內(nèi)或體外使用半乳凝素9突變體 可以對患部組織或臟器等腫瘤細胞進行轉(zhuǎn)染處理。另外，例如對于慢性關節(jié)炎風濕病的場 合，可以在體外使用半乳凝素9突變體對由關節(jié)液得到的細胞進行轉(zhuǎn)染。
[0249] 例如在多發(fā)性硬化癥治療中，可以向受到影響的腦區(qū)域注射半乳凝素9突變體， 也可以使半乳凝素9突變體在處于自身免疫反應型的活化T細胞等攻擊的細胞中容易表 達。另外一個例子，對于多發(fā)性硬化癥的場合，半乳凝素9突變體DNA可以局部注射于哺乳 動物腦中，也可以取出來自脊髓液的細胞，將它用半乳凝素9突變體DNA進行轉(zhuǎn)染處理，返 回到脊髓區(qū)域。作為另外的例子，為了治療具有肖格倫綜合征的哺乳動物，作為該疾病的靶 器官，也可以選擇適于通過注射給予半乳凝素9突變體多肽的方式。另外對于患有肖格倫 綜合征的哺乳動物，也可以對罹患器官（例如、腎臟等）進行鑒定，直接將半乳凝素9突變 體DNA給到該器官，也可以取出來自器官的細胞，進行轉(zhuǎn)染處理，然后返回到身體使半乳凝 素9突變體在哺乳動物的這些細胞中表達。
[0250] 例如予防移植排斥時，接受移植的動物由于象對外來細胞、外來組織、或外來器官 進行攻擊那樣捕殺活化患者細胞，所以可以局部或全身給予半乳凝素9突變體治療劑，為 了能夠暫時對患者身體內(nèi)器官進行保護，在移植開始前也可以使半乳凝素9突變體多肽在 器官外表面上的細胞中進行表達。接受移植的人的免疫系在順應外來細胞、外來組織、或外 來器官之前期間，連續(xù)給予半乳凝素9突變體治療劑大概是很有必要的。
[0251] 預期半乳凝素9突變體治療劑具有類似于天然半乳凝素9的作用。為了引起凋亡 反應可以使用半乳凝素9突變體治療劑。因此，在臨床醫(yī)療中，為了達到凋亡，應當可以從 化學計量上知道需要表達或給予哺乳動物的半乳凝素9突變體量。就本發(fā)明的其它方式來 說，本說明書中公開的載體構建物當然也可以指示來自非載體的基因的表達。例如，與適于 與半乳凝素9突變體一起給予的藥物前體系可以起到用于基因治療的安全機構的作用，也 可以用作并用治療劑。
[0252] 也可以使藥物前體激活劑與半乳凝素9突變體一起在載體中表達，確保安全機 構。如果決定該活化系應當被停止，給予藥物前體，使該藥物前體激活劑活化。通過這樣治 療，可以賦予臨床醫(yī)治基因治療期間的調(diào)控手段。藥物前體激活劑/藥物前體系可用于哺 乳動物（例如、自身免疫由于半乳凝素9突變體表達惡化的那樣場合）中轉(zhuǎn)染細胞的鈍化。 藥物前體激活劑/藥物前體系為了能夠使用通過該系提供的藥物前體活化的細胞傷害作 用，可以進行組合治療，或在治療劑中并用給予使用。
[0253] 包括與藥物前體激活劑和藥物前體一起給予編碼半乳凝素9突變體多肽的聚核 苷酸的治療可以是免疫調(diào)節(jié)性的治療。所謂免疫調(diào)節(jié)性指的是引起性質(zhì)或效力與因子不存 在下發(fā)生的免疫應答不同的免疫應答的因子的使用，該因子可以是與免疫應答有關的一個 以上細胞制造的，也可以外源添加到細胞的因子。應答的性質(zhì)或效力可以通過同行眾所周 知的各種分析（例如、測定細胞增殖（例如、 3H胸腺嘧啶脫氧核苷的換入）的體外分析和體 外細胞傷害分析（包括例如測定51Cr的釋放））進行測定（參照Warner et al.，AIDS Res. and Human Retroviruses, 7:645-655(1991))。作為免疫調(diào)節(jié)因子，是在體內(nèi)和體外都具有 活性的因子。這樣的因子的代表例如細胞因子（例如、白介素2, 4, 6, 12和15)、a干擾素、 3干擾素、Y干擾素、GM-CSF、G-CSF、和腫瘤壞死因子（TNF)等。作為其它的免疫調(diào)節(jié)因 子，例如 CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, MHC 類 I 分子，MHC 類 II 分子、P 2-巨球蛋白、 伴侶、其類似物等。而且當基因遞送載體不表達作為細胞因子的免疫調(diào)節(jié)輔因子時，該細胞 因子可以包含在上述的組成物中，與上述的組成物同時或延后給予。需要時，在這樣的實施 方式中，免疫調(diào)節(jié)補因子最好是根據(jù)該領域中已知的標準的程序和給藥量給予。例如、a干 擾素在2?4個月間可以按照100?500萬單位/日給藥量給予，而IL-2可以在2?12 周間，按照1?3次/日、10, 000?100, 000單位/kg體重的給藥量給予。Y干擾素例如 為了通過給予半乳凝素9突變體達到更有效的治療，為了在活化T細胞中對問題基因的表 達進行正調(diào)節(jié)，可以按照2?12周間、2?3次/周、150, 000?1，500, 000單位的給藥量 給予。
[0254] 在并用治療劑中，藥物前體激活劑也可以由該激活劑的載體表達，也可以由與半 乳凝素9突變體多肽同樣的載體進行表達?？梢詫⑷我环N載體系（單一載體或2個載體） 通過體內(nèi)或體外手段給予。在自身免疫治療中，例如，藥物前體激活劑的添加可以更進一步 促進支持由半乳凝素9突變體達到的效果的免疫調(diào)節(jié)效果，而藥物前體添加可以對轉(zhuǎn)染細 胞的殺傷再進行活化。
[0255] 伴侶分子可以在聚核苷酸治療藥給予前、給予同時，或給予后給予，而伴侶分子可 以是例如熱休克蛋白質(zhì)（例如、hsp70)。在哺乳動物中表達的聚核苷酸可以再與例如用于 確實只在所期望靶細胞進行聚核苷酸表達目的的誘導啟動子（例如、組織特異的啟動子） 連接。為了將聚核苷酸有效地遞送到組織的目的，聚核苷酸可以與適合于向該組織的細胞 基因組整合的核苷酸序列鄰接。
[0256] 對于本發(fā)明的這一方式和許多方式，對人進行治療的有效性最初可以在所定的 自身免疫疾患動物模型中進行試驗。作為這樣的現(xiàn)存動物模型，包括例如肖格倫綜合征 (自身免疫淚腺炎或免疫媒介唾液腺炎）、自身免疫心肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變（PBC)、 炎癥性心疾患、水銀誘導性腎臟自身免疫、胰島素依賴性糖尿?。↖型糖尿病或IDD)、胸 腺摘出后自身免疫、中樞神經(jīng)系（CNS)脫髓損傷、CNS狼瘡、發(fā)作性睡眠、重癥肌無力癥 (MG)、突眼性甲狀腺腫、免疫媒介PNS損傷、變形性關節(jié)癥、慢性關節(jié)風濕病、葡萄膜炎、髓 質(zhì)囊胞性纖維癥、自身免疫溶血性疾患、自身免疫脈管炎、卵巢自身免疫疾患、和人強皮癥 (schleroderma)等在內(nèi)的自身免疫疾患動物模型。
[0257] 可以將多個基因遞送載體給予動物或植物。在理想的實施方式中，動物為溫血動 物，最好是從小鼠、雞、牛、豬、寵物（例如、貓和狗）、馬、和人中選擇。至于多肽治療藥（例 如、半乳凝素9突變體或其它細胞因子），給藥量可以是約5?50 y g/kg哺乳動物體重、或 約50 ii g/kg?約5mg/kg、或約100?500 ii g/kg哺乳動物體重和約200?約250 ii g/kg的 范圍。
[0258] 關于多肽治療藥（例如編碼天然或變異體的半乳凝素9突變體多肽的聚核苷酸 等）在以組織為靶的給藥中，根據(jù)聚核苷酸在患者（例如、哺乳動物）中的表達，可以象下 面那樣給予含有編碼序列或非編碼序列的可表達構建物的載體：在局部給藥的基因治療 程序中，可以在約IOOng?約200mg DNA、或約500ng?約50mg DNA、或約I u g?約2mg DNA、或約5iig DNA?約500 iig DNA范圍內(nèi)給藥，而在基因治療程序中的局部給藥中間，可 以在約20 ii g?約100 ii g范圍給藥，例如每次注射或給藥，按照約500 ii g的用量給藥。期 望更多表達時，遍及組織的更廣的區(qū)域，按照連續(xù)給藥程序再給予更多的量的DNA或同樣 量的DNA，例如可以向腫瘤部位附近不同的或緊連的組織部分給予一些，這樣給藥對于帶來 陽性的治療結果很有必要。
[0259] 有關低分子治療藥的給予，可以根據(jù)低分子的效力改變給藥量。如果是非常強的 抑制劑，其給藥量如用哺乳動物每公斤的量表示的話，例如、在約I y g/kg?約500mg/kg、 或約100 ii g/kg?約5mg/kg、或約I ii g/kg?約50 ii g/kg、或例如約10 ii g/kg的范圍非常 充分。就肽和類肽的給藥來說，效力因給藥量而有所變化，可以是約I U g/kg?約500mg/kg 哺乳動物體重、和約100 y g/kg?約5mg/kg、和約I ii g/kg?約50 ii g/kg的范圍。而通常 的用量可以是約IOu g/kg。
[0260] 本發(fā)明的活性成分可以在很寬范圍選擇該成分的給藥量給藥，該給藥量和給藥次 數(shù)等可以根據(jù)治療患者的性別、年齡、體重、一般的健康狀態(tài)、飲食、給藥時間、給藥方法、排 泄速度、藥物的組合、患者此時進行治療的病狀的程度考慮這些因素或其它要因之后決定。
[0261] 在進行藥物品制造時，其添加劑等和制備法等可以參考例如日本藥局方解說書編 集委員會編、第十四改正日本藥局方解說書、平成13年6月27日發(fā)行、株式會社廣川書店； 一番 >瀬尚他編醫(yī)藥品的開發(fā)12卷（制劑素劑〔I〕）、平成2年10月15日發(fā)行、株式會社 廣川書店；同、醫(yī)藥品的開發(fā)12卷（制劑素材〔II〕）平成2年10月28日發(fā)行、株式會社 廣川書店等記載，從這些記載中根據(jù)需要適當選擇運用。
[0262] 本發(fā)明的活性成分包括本說明書中說明的（a)半乳凝素9突變體以及與其具有基 本上均等的生物活性的多肽等、（b)編碼半乳凝素9突變體以及與其具有基本上均等的生 物活性的多肽的聚核苷酸、（c)利用半乳凝素9突變體技術發(fā)現(xiàn)的因子等、（d)半乳凝素9 突變體以及與其具有基本上均等的生物活性的多肽基因遞送載體等，這些成分在利用人半 乳凝素9對正常細胞不表現(xiàn)出傷害活性，而對腫瘤細胞表現(xiàn)傷害細胞活性的性狀、對腫瘤 細胞誘導凋亡，但對正常細胞不誘導凋亡的性狀、抑制惡性細胞的轉(zhuǎn)移性的性狀、誘導被活 化的免疫細胞、特別是活化的CD4陽性T細胞的凋亡的活性（與此相反，靜息T細胞、特別 是CD4陽性T細胞（協(xié)助者T細胞）的凋亡誘導稱之為不誘導凋亡的性狀）等上是有用的， 有望作為利用與抗腫瘤劑、抗變態(tài)性劑、免疫調(diào)節(jié)劑、自身免疫疾患用劑、抗炎癥劑、腎上腺 皮質(zhì)類固醇激素同樣活性的藥劑。
[0263] 根據(jù)使用本發(fā)明的活性成分、例如半乳凝素9突變體（特別是G9NC(null))確認 的生物活性效果，認為半乳凝素9以及半乳凝素9突變體（特別是G9NC(null))對于如下 給出的那樣病的癥狀和疾患表現(xiàn)出有用的生物活性。
[0264] 在炎癥性疾患中有各臟器中發(fā)生的各種急性和慢性炎癥、變態(tài)性和自身免疫性的 炎癥、感染癥等。
[0265] 作為急性和慢性疾患，包括例如肺炎中支氣管炎、支氣管肺炎、間質(zhì)性肺炎、肺臟 炎、細支氣管炎和急性縱隔炎等，以及其它的的臟器的炎癥，例如心外膜炎、心內(nèi)膜炎、心肌 炎、口內(nèi)炎、口角炎、扁桃炎、咽炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、 蟲垂炎、缺血性大腸炎、藥物性大腸炎、直腸炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重癥肝炎、慢 性肝炎等各種急性和慢性肝炎和肝硬變、膽囊炎、急性胰炎、慢性胰炎、還有急性和慢性腎 炎、膜性腎炎、絲球體腎炎、IgA腎癥等和各種各樣的膀胱炎、腦髓炎、乳腺炎、皮炎、表層角 膜炎、干性角結膜炎、各種中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸等、牙肉炎、牙周炎、牙周圍炎等 各種各樣的炎癥。
[0266] 另外，在神經(jīng)性炎癥（例如神經(jīng)性胃炎、神經(jīng)性膀胱炎等）中也看到了效果。例如， 通過實施例8確認，半乳凝素9在辣椒辣素誘導神經(jīng)性皮炎癥模型中對模型的炎癥反應具 有強的抑制效果。辣椒辣素是通過刺激末梢神經(jīng)引起神經(jīng)性炎癥和疼痛的物質(zhì)。辣椒辣素 具有刺激儲藏在作為知覺神經(jīng)C纖維末端的神經(jīng)肽的物質(zhì)P釋放的作用。物質(zhì)P具有使組 胺從肥大細胞釋放的作用，結果血管被擴張，出現(xiàn)浮腫。另外，由于釋放的組胺作用，知覺神 經(jīng)受到刺激，物質(zhì)P由C纖維末端釋放，作用于其周圍的肥大細胞，出現(xiàn)再使組胺釋放的增 強循環(huán)。半乳凝素具有抑制該病態(tài)形成的作用。
[0267] 再者辣椒辣素與感覺神經(jīng)末梢的疼痛受容傳感器的辣椒辣素受體（香草素受體） 結合，引起疼痛。疼痛是由于化學刺激（酸等）、熱刺激（開水等）或過度的機械刺激（創(chuàng) 傷等）感覺神經(jīng)末梢被活化引起的，辣椒辣素受體也參與由于這樣的刺激引起的疼痛。這 表明半乳凝素9抑制由辣椒辣素受體導致的神經(jīng)末梢的活化，預期有可能具有使伴隨癌或 炎癥引起的疼痛減輕等鎮(zhèn)痛作用。
[0268] 變態(tài)性炎癥疾患如全身性過敏性、支氣管哮喘、過敏性肺炎、花粉癥、變態(tài)性鼻炎、 變態(tài)性結膜炎、免疫復合體引起的變態(tài)性疾患、血管神經(jīng)性浮腫等。
[0269] 另外自身免疫性的炎癥（自身免疫疾患）中有全身性（慢性關節(jié)風濕病、全身性 紅斑狼瘡、結節(jié)性多發(fā)性動脈炎、強皮癥、多發(fā)性肌炎?皮膚肌炎、肖格倫綜合征、貝切特病 等）、神經(jīng)系（多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力癥、HAM(HTLV-1脊髓癥）、肌萎縮性側索硬化癥 等）、內(nèi)分泌性（巴澤多病、橋本病、1型糖尿病等）、血液（特發(fā)性血小板減少性紫斑病、 自身免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血等）、呼吸器（結節(jié)病、肺纖維癥等）、消化管（潰 瘍性大腸炎、克羅恩病等）、肝臟（自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性硬化性膽 管炎、自身免疫性膽管炎等）、腎?尿路系（抗嗜中性白細胞細胞質(zhì)抗體關聯(lián)腎炎、血管炎、 Goodpasture綜合征、抗絲球體基底膜抗體病等）等。
[0270] 感染癥是病原體由于生物體的細胞?組織?臟器產(chǎn)生的疾患的總稱。關于感染 癥可以參考監(jiān)修：町并陸生、編集：秦順一、坂本穆彥、「標準病理學（第2版）」、醫(yī)學書院、 2002年3月15日發(fā)行。引起人感染癥的病原體有1)細菌（包括螺旋體、衣原體、立克次 體）、2)病毒、3)真菌、4)植物（藻類）、5)原蟲、6)寄生蟲（吸蟲、條蟲、線蟲）、7)節(jié)足動 物。各病原體引起的主要的疾患如細菌性感染癥（霍亂、瘟疫、大腸桿菌感染癥等）、螺旋 體感染癥（鉤端螺旋體病等）、衣原體感染癥（鸚鵡病等）、立克次體感染癥（斑疹傷寒、破 傷風等）、病毒性感染癥（帶狀皰疹、病毒性出血熱、狂犬病等）、真菌癥（念珠菌病、隱球菌 病、曲霉菌病等）、原蟲性疾患（阿米巴性痢疾、瘧疾、弓形體病等）、寄生蟲（吸蟲癥、線蟲 癥等）、以及支原體感染癥（支原體肺炎等）、分支桿菌感染癥（結核、非定型抗酸菌癥等）。
[0271] 至于癌和肉瘤，如腦腫瘤（多形形惡性膠質(zhì)腫等）、脊髓腫瘤、上顎洞癌、胰液腺 癌、齒肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉頭癌、甲狀腺癌、甲狀芳腺癌、肺癌、胸 膜腫瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大腸癌、膽管癌、膽囊癌、胰臟癌、肝癌、腎 臟癌、膀胱癌、前立腺癌、陰莖癌、精巢腫瘤、腎上腺癌、子宮頸癌、子宮體癌、陰道癌、外陰 癌、卵巢癌、纖毛上皮腫、惡性骨腫瘤、軟部肉瘤、乳癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、基底細胞瘤、 白血病、伴隨骨髓化性的骨髓纖維癥、惡性淋巴瘤、惡性淋巴肉芽腫病、漿細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì) 瘤等。
[0272] 也適用皮膚科領域，例如1)在皮膚疾患中存在著包括感染癥、變態(tài)性炎癥和自身 免疫性炎癥在內(nèi)的炎癥和干癬、水皰癥、膿皰癥、角化、角化異常癥等特有的炎癥。另外2) 與美容皮膚科關系，
[0273] a)黑色素代謝調(diào)節(jié)（美白）? --半乳凝素9基因?qū)牒谒亓黾毎珊谏{(diào)向 白色變化。皮膚基底細胞層有半乳凝素9陽性細胞。
[0274] b)毛發(fā)成長（生發(fā)）的調(diào)節(jié)? --毛根部有半乳凝素9表達，隨時期而變。半乳 凝素9基因?qū)胄∈蟮拿l(fā)的成長與突變體半乳凝素9基因?qū)胄∈笙啾确浅：谩?br> [0275] c)膠原產(chǎn)生調(diào)節(jié)等? --成纖維細胞通過各種刺激有半乳凝素9表達、纖維結締 組織有半乳凝素9陽性的部分。
[0276] 至于生活習慣病如高脂血癥、動脈硬化癥、高血壓、糖尿病等。已闡明與生活習慣 病動脈硬化癥的病態(tài)形成有關的細胞之一泡沫細胞中存在著gal9陽性細胞和陰性細胞。 因此，表明gal9與動脈硬化癥的病態(tài)有關，不可否認通過控制它，治療或予防成為可能。至 于高血壓，在動物實驗模型高血壓發(fā)癥時由于半乳凝素9在尿細管或絲球體中的表達增 強，所以有時對半乳凝素9表達進行控制，通過給予半乳凝素9能夠治療的可能性增大。
[0277] 另外，也適用于正常細菌叢的維持，例如、gal9在腸管上皮正常強烈表達，另外對 于給予惡玉細菌叢時，半乳凝素9在腸管上皮和巨噬細胞等炎癥細胞中的表達增強。由此 明顯表示出半乳凝素9與消化管中正常細菌叢的維持有關。
[0278] 另外，在可適用于淀粉樣變性，例如在確認淀粉樣變性的部分的巨噬細胞中，有表 現(xiàn)出半乳凝素9表達的巨噬細胞存在。存在著通過半乳凝素9可以控制淀粉樣沉積的可能 性。
[0279] 認為對阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松癥、骨折等也有用，例如、在阿爾茨海默病患者的 腦中變性的神經(jīng)細胞表現(xiàn)出半乳凝素9陽性特征。因此存在可用于治療和診斷的可能性。 另外在骨質(zhì)疏松癥中，認為半乳凝素9有抑制骨吸收，促進骨形成的可能性。這樣的作用從 骨代謝方面考慮，認為是理想的藥劑。
[0280] 另外在腦、神經(jīng)領域中也有用，例如、腦梗塞、心肌梗塞等缺血性病變的進展伴隨 著炎癥細胞的濕潤，引起超氧化物產(chǎn)生等進一步惡化。預期半乳凝素9和半乳凝素9突變 體可控制這樣的炎癥。作為炎癥、免疫系的變化為原因的脫骨髓性疾患，例如多發(fā)性硬化癥 等。作為變性疾患，如肌萎縮性側索硬化癥、帕金森病等。另外綜合失調(diào)癥可以說原因是某 種炎癥性的變化。即EPA(二十碳五烯酸）可用于腦中炎癥反應的控制和神經(jīng)細胞膜的形 成。在綜合失調(diào)癥患者中，有細胞膜中的EPA和其它的必需脂肪酸表現(xiàn)出枯竭的研究例。
[0281] 預期半乳凝素9和半乳凝素9突變體對痛風也有用。預期半乳凝素9和半乳凝素 9突變體對于對尿酸結晶的組織沉著的疼痛的強急性炎癥也能進行控制。
[0282] 哮喘是引起可逆性呼吸道阻塞（哮喘發(fā)作）的呼吸器疾患，指的是對抗原特異的 (變態(tài)原）或非特異的（感染、冷氣等）刺激，呼吸道反應性亢進的狀態(tài)。近年證明對于哮 喘的呼吸道在不發(fā)作的穩(wěn)定期存在以嗜酸性細胞、T淋巴細胞、和肥大細胞為主體的炎癥， 現(xiàn)在，認為是哮喘本身慢性的支氣管炎。另外、很多的小兒哮喘與特應性起因（IgE產(chǎn)生） 的關聯(lián)雖然強（特應型哮喘）、在成人哮喘中約半數(shù)被確認不能證明與IgE有關（非特應型 哮喘）。哮喘予防?管理指導原則（1998年厚生省研究班）已出臺，哮喘治療可以分為急性 發(fā)作和慢性呼吸道炎癥兩種。作為發(fā)作治療藥，支氣管擴張藥（0 2刺激藥、氨茶堿）可用作 第一選擇藥，在中等癥以上的發(fā)作中用這些藥劑不充分，要進行類固醇藥的大量全身給藥。 類固醇藥副作用大、特別是消化性潰瘍、高血壓、高血糖、精神癥狀等重大，如果長期使用， 感染癥、腎上腺抑制、骨質(zhì)疏松癥等逐漸成為問題。另外伴隨著合併癥的場合類固醇的使用 伴隨著危險。期盼副作用少、具有與類固醇同等效果的藥劑的開發(fā)。作為長期的管理藥，在 慢性呼吸道炎癥的治療中抗炎癥藥為主體，其中推薦吸入類固醇藥的使用。長期大量使用 該類固醇藥時，腎上腺抑制、骨質(zhì)疏松癥、呼吸道感染等副作用出現(xiàn)的可能性不能否定。另 夕卜、吸入藥要求正確吸入手技，與內(nèi)服藥比較，在順應性這點差。就中等癥以上的哮喘來說， 除了吸入類固醇藥之外，推薦吸入h刺激藥、白三烯拮抗藥或并用緩釋性茶堿藥。如果是 重癥例，不得已只能全身給予類固醇。期盼開發(fā)取代這樣藥劑的藥劑。
[0283] 已知在哮喘的病態(tài)形成中，對T淋巴細胞、嗜酸性細胞的肺組織以及呼吸道的浸 潤起著重要的作用。另外半乳凝素9具有誘導細胞凋亡的功能，誘導活化T細胞和嗜酸性 細胞的凋亡。按照這樣的思路，根據(jù)本發(fā)明中使用半乳凝素9突變體等的研究，顯然半乳凝 素9和半乳凝素9突變體具有改善（抑制）哮喘中呼吸道炎癥的活性。
[0284] 而半乳凝素9和半乳凝素9突變體具有增強成骨細胞增殖和分化以及抑制破骨細 胞分化的活性，認為對于骨質(zhì)疏松癥的予防和/或治療、類固醇長期給藥中成為問題的副 作用之一骨生長抑制也有效。
[0285] 半乳凝素9和半乳凝素9突變體在對淋巴細胞的作用中與類固醇不同，表現(xiàn)出活 化淋巴細胞特異的抑制作用，與類固醇相比，預期副作用、例如、免疫抑制少。另外，還具有 抑制類固醇中不存在的粘附分子的功能以及抑制神經(jīng)性炎癥的作用，有望作為哮喘治療、 例如發(fā)作治療藥。另外認為可減輕類固醇的副作用。
[0286] 實施例
[0287] 以下給出實施例，對本發(fā)明進行具體說明，該實施例只是為了對本發(fā)明進行說明， 用于其具體方式的參考提供的。這些實施例是為了說明本發(fā)明的特定的具體方式的例子， 并不表示限定或限制本申請書公開的發(fā)明范圍。本發(fā)明應當理解為源于本說明書的思想的 各種各樣的可實施方式。
[0288] 所有的實施例除了另外詳細記載的以外，使用的標準的技術實施的或可以實施的 例子，這些對于同行眾所周知、慣用的技術。而在以下的實施例中，沒有特別指出時，具體 的操作和處理條件等，DNA 克隆根據(jù) J. Sambrook, E. F. Fritsch&T. Maniatis, "Molecular Cloning"，2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) 和 D. M. Glover et al. ed.，"DNA Cloning", 2nd ed.，Vol. Ito 4，（The Practical Approach Series)，IRL Press, Oxford University Press (1995);使用 PCR 法全時根據(jù) H. A. Erlich ed.，PCR Technology, Stockton Press, 1989 ;D.M. Glover et al.ed.，"DNA Cloning"，2nd ed.,Vol. I, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995)和 M. A. Innis et al.ed. , ^PCR Protocols"，Academic Press, New York (1990)所述的方法進行，而使用市售的試劑或試劑盒時使用附帶的指示書 (protocols)和添付的藥品等。
[0289] 實施例1
[0290] (A)半乳凝素9突變體表達載的構建
[0291] 在制作表達載體時,使用
[0292] (1)由 Jurkat 細胞的 poly (A)+RNA 級分制備的 cDNA
[0293] (? pET-1 Ia 載體（STRATAGENE)
[0294] (3) PCR 用引物：
[0295] G9NCRD1: CGTCCTCATATGGCCTTCAGCGGTTCCCAG 序列 10
[0296] G9NCRD6: CGACCGCATATGCTGGAAGCTGATGTAGGACAG 序列 11
[0297] G9CCRD5:CGTCCTCATATGACTCCCGCCATCCCACCTATG 序列 12
[0298] G9CCRD6: CGACCGGGATCCCTATGTCTGCACATGGGTCAG 序列 13
[0299] Jurkat細胞（來自T細胞的細胞）由美國模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC)獲得。細胞 系于添加了 10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基（Sigma、圣路易斯、美國）中在5% CO2的條件 下維持在37°C。從Jurkat細胞提取總RNA象下面那樣進行。即將使用含有10% FBS的 RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的Jurkat細胞進行離心、收集。用IOmlPBS將細胞清洗2次。向清洗 后的細胞沉淀按照每2x IO8個細胞加15mlISOGEN (商品名：日本人），按照指南（日本人） 提取總RNA。從總RNA純化poly (A) +RNA和cDNA合成象下面那樣進行。即，將從Jurkat細 胞提取的總RNA按照終濃度為lmg/ml濃度那樣溶解于DEPC處理水中。使用PolyATtract mRNA Isolation System (商品名：Promega),根據(jù)指南從總 RNA 純化 poly (A)+RNA。將純化 的poly (A) +RNA按照終濃度為5 ii g/20 ill溶解于DEPC處理水中。
[0300] 使用 First-Strand cDNA 合成試劑盒（商品名：Amersham Biosciences)，按照指 南由5 ii g的poly (A)+RNA合成cDNA(對于引物使用Not I-d(T) 18)。
[0301] 接下來，按照圖1所示順序，在pET-1 Ia載體NdeI-BamHI位點插入半乳凝素9的 N-末端側糖鏈結合結構域（N-terminal carbohydrate recognition domain, NCRD)和 C-末端側糖鏈結合結構域（CCRD)，制作缺少連接肽的改變型半乳凝素9 (G9NC(null))的表 達載體。首先從半乳凝素9cDNA分別取得（1)對應于人半乳凝素9的C-末端側CRD的cDNA 和（2)對應于人半乳凝素9的N-末端側CRD的cDNA。即使用PCR用引物：G9CCRD5+G9CCRD6 從cDNA擴增對應于人半乳凝素9的C-末端側CRD的cDNA(G9CCRD)。將G9CCRD用制限 酶（Ndel+BamHI)切后，插入到用同樣制限酶處理的pET-lla載體，得到pET-G9CCRD。PCR 使用KOD DNA聚合酶試劑盒（T0Y0B0 Code No. K0D-101)進行。使PCR反應混合物（dNTP mix，25mM MgCl2，10XBuffer，K0D DNA 聚合酶（0. 05u),引物和模板 cDNA)在以下那樣的 PCR的循環(huán)條件下進行反應：94°C處理2分鐘后，進行25次循環(huán)（98°C下15秒、然后65°C下 2秒、而后74°C下處理30秒），最后于4°C下停止反應。被PCR擴增的片段向載體的插入使 用Ligation high kit (T0Y0B0 Code No. LGK-101)進行。反應按照插入片段：載體的摩爾 比為約5 :1進行混合，加其總DNA溶液（體積）量的1/2 (體積）量的試劑Ligation high 混合后進行。通過于16 °C反應16小時（0/N)進行插入。
[0302] 另外使用PCR用引物：G9NCRD1+G9NCRD6從該半乳凝素9cDNA擴增對應于人半乳 凝素9的N-末端側CRD的cDNA(G9NCRD)。將G9NCRD用制限酶（NdeI)切斷后，將得到的片 段用同樣的制限酶（NdeI)處理，再插入到脫磷酸化的pET-G9CCRD中得到pET-G9NC (null)。 PCR擴增以及向載體的整合與上述同樣進行。pET-G9NC(null)編碼具有將人的M型半乳凝 素9的第149位Pro開始至第177位Ser的29個氨基酸序列置換為His-Met序列的氨基 酸序列的多肽。即是具有序列1所示的堿基序列，編碼具有序列2所示的氨基酸序列的多 肽。
[0303] (B)半乳凝素9突變體重組蛋白質(zhì)的表達和純化
[0304] 將上述工程（A)得到的表達用質(zhì)粒載體pET-G9NC (nul 1)導入大腸桿菌 (BL21(DE3))。導入通過電穿孔法進行。即將感受態(tài)BL21(DE3)和質(zhì)粒載體水溶液混合，通 過使用I. 8kV電壓的電穿孔法進行轉(zhuǎn)染。
[0305] 重組蛋白質(zhì)的表達通過將大腸桿菌于含有2% (w/v)葡萄糖和IOOii g/ml氨 芐青霉素的2X YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當600nm的吸光度達到0. 7時，添加0. IM異丙基硫 代-P -D-半乳糖苷（最終濃度0. ImM)，誘導重組蛋白質(zhì)的表達來進行。于20°C培養(yǎng)18小 時后，通過離心收集菌體，懸浮于 IOmM Tris-HCl(pH 7.5),0. 5M NaCl, ImM DIT, ImM PMSF 中。將懸浮液進行10分鐘超聲波處理后，加10% (w/v)Triton X-100 (最終濃度1% )，于 4°C下攪拌30分鐘。于15, OOOXg下離心30分鐘，將得到的上清液中的重組蛋白質(zhì)通過使 用乳糖-瓊脂糖的親和層析進行純化。
[0306] 結果純度高的標準品以比較高的收率獲得。得到的重組蛋白質(zhì)的電泳結果如 圖 2 所示。SDS-PAGE 條件如下：Gel, Acrylamide-BIS(12 % gel),電泳用緩沖液，25mM Tris-192mM 甘氨酸-0? 1 % SDS,泳動條件，180V, 45min.，染色，CBB, 60 °C /30min. 電泳樣品吸附于Strata Clean? Resin(Stratagene)，用IX樣品緩沖液（62. 5mM Tris-HCl，Ph6. 8, 2% (w/v)SDS, 5% (W/V)2-ME，Glycerol)調(diào)整到 0? 2mg/ml，98°C /3min. 熱處理后以每條帶約2 y g的蛋白質(zhì)量進行電泳。
[0307] 純化的G9NC(null)于4°C下可以穩(wěn)定保存90天以上。而野生型的半乳凝素 9(M-type、G9(M))在同一保存條件下在2周以內(nèi)大部分被分解（參照圖3)。該分解被認為 是由于純化半乳凝素標準品中含有來自大腸桿菌的蛋白水解酶引起的。
[0308] 實施例2
[0309] 比較野生型的半乳凝素9 (S-type、G9 (S):帶有最短連接肽的同種型）和 G9NC(null)對存在于人組織中的蛋白水解酶的敏感性。向溶解于PBS的半乳凝素中加 1/100(重量比）的基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)或彈性蛋白酶，于37°C下保溫。任一場合 下G9 (S)大部分都在1?2小時被分解，而相反G9NC (null)在2小時后還完全沒有被分解 (參照圖4和5)。
[0310] 實施例3
[0311] 為了研究寄予半乳凝素9生物活性的變異導入的效果，研究了對M0LT-4細胞 (來自人Tcell leukemia的細胞株）的凋亡誘導活性和對外周血嗜酸性細胞的趨化活性 (eosinophil chemoattractant activity、ECA activity)〇
[0312] (a)細胞培養(yǎng)物
[0313] MOLT -4 (T細胞）由ATCC獲得。所有細胞系都在添加了 10% FCS的RPMI - 1640 培養(yǎng)基（Sigma、圣路易斯、美國）中維持在5% CO2的條件、37°C下。為了抑制Gal - 9的 活性，在培養(yǎng)用培養(yǎng)基中添加30mM的乳糖。作為對照使用同濃度的蔗糖。
[0314] (b)凋亡分析
[0315] (1)利用PI進行細胞周期（apoptosis)解析（PI法）
[0316] 將被凋亡誘導處理的細胞于4°C、IOOOrpm下進行5分鐘離心處理后，將細胞團再 懸浮于PBS(300iU)，一邊渦旋、一邊向細胞懸浮液慢慢添加100%冷乙醇（700iU)，使終 濃度變?yōu)?0%乙醇。于4°C下進行30分鐘溫育處理，對細胞進行固定，然后加PBS (Iml)，于 4°C、IOOOrpm下進行5分鐘離心處理后，將細胞團再懸浮于PBS (440 ill)。將細胞與2. 5mg/ ml的核酸酶A(10 ii 1，終濃度50 ii g/ml，Sigma,圣路易斯、密蘇里州、美國）一起于37°C下 進行30分鐘溫育處理，然后與2. 5mg/ml的碘化丙錠（4 ill ;PI，終濃度20 ii g/ml，Sigma) - 起于4°C、暗中進行10分鐘溫育處理。通過尼龍篩除去變成集塊的細胞后，于PBS中對細胞 進行計數(shù)，通過流式細胞儀（Sandstrom, aK. et al.，J Immunol Methods, 240:55 (2000)以 及 Zhang L.et al.，Cancer Lett, 142:129(1999))對染色細胞進行解析。
[0317] (2) TUNEL(TdT-mediated 標記 dUTP nick end labeling)法
[0318] 對于通過DNA的片段化產(chǎn)生的末端，用在DNA末端附加核苷酸的酶（TdT :末端 脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶）整合標記的核苷酸（dUTP-biotin或FITC-dUTP等）后，對作為凋 亡的顯著特征的細胞核DNA的片段進行檢測。在實驗中，使用MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct (MBL、名古屋、日本）。根據(jù)試劑盒銷售商的指示，象下述那樣進行實驗。即，將進行 了凋亡誘導的細胞（約2X IO5個/樣品）用含有0. 2% FSA的PBS洗，然后加4%多聚甲 醛（0. lMnaH2PL4, pH7. 4中），于4°C下進行30分鐘固定化后，用含有0. 2% FSA的PBS洗。 向細胞團加70%冷乙醇后于一 20°C下進行30分鐘溫育處理，使透過性亢進。用含有0. 2% FSA的PBS洗后，向細胞團加TdT反應液（TdT、FITC-dUTP以及TdT緩沖液的混合物），攪拌 后，于37°C下進行1小時溫育處理，用含有0. 2% FSA的PBS洗后，再懸浮于含有0. 2% FSA 的PBS中，對染色細胞通過流式細胞儀進行解析。
[0319] (c) T細胞解析
[0320] 用按照各個孔每孔3 ii g/ml的抗⑶3抗體（Immunotech, Marseille、法國）的TBS 液（pH8. 0)對24孔板于4°C下溫育過夜處理后，除去抗⑶3抗體，用PBS洗滌孔，得到用抗 ⑶3抗體包被的孔板。
[0321] 使用HIST0PAQUE(登錄商標、SIGMA)從加肝素的血液中分離單核白細胞細胞。 然后，使用C4陽性分離試劑盒（Cd4-positive isolation kit ;DYNAL, Oslo,挪威）以及 Dynabeads (登錄商標）M - 4500)8 (DYNAL, Oslo,挪威），按照試劑盒制造銷售商所述那樣 分別分離⑶4陽性T細胞以及⑶8陽性T細胞。為了對T細胞進行活化，將⑶4陽性T細 胞或⑶8陽性T細胞于含有10% FCS的RPMI - 1640中調(diào)整為IX IO6個/ml的細胞，在 37°C下在用抗⑶3抗體包被的板上于5% CO2培養(yǎng)箱中溫育處理20?24小時，然后與重組 體半乳凝素9(野生型G9(S)或突變體G9NC(null)) -起于37°C下在5% CO2培養(yǎng)箱中進 行溫育處理。然后，象上述（b)那樣，進行凋亡?分析。即，將細胞于37°C下與50i!g/ml的 PI (Sigma) -起在暗處進行溫育處理。將染色細胞通過流式細胞儀（Sandstrom, K. et al.，J Tmmun〇I Methods, 240:55 (2000)以及 Zhang L. et al.，Cancer Lett, 142:129 (1999))進行 解析。
[0322] 對于非活化（靜息）T細胞與與重組體半乳凝素9(野生型G9⑶或突變體 G9NC(null)) -起于37°C下在5% CO2培養(yǎng)箱中進行溫育處理后，與上述同樣進行凋亡?分 析。
[0323] (d)結果
[0324] 將伴隨凋亡出現(xiàn)的DNA片段化通過瓊脂糖凝膠電泳和FACS進行研究，結果表明無 論使用那一種方法，G9NC (null)都保持與G9(S)同等或在其以上的凋亡誘導活性（圖6,表 1)。通過Chamber法研究ECA活性，結果表明G9NC (null)與G9⑶比較，表現(xiàn)出更高的活 性（圖7)。
[0325] 表 1
[0326] 已經(jīng)凋亡的MOL - 4細胞的比例（％ )

【權利要求】
1. 蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是半乳凝素9或基本上具有與半乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì) 的連接肽或其附近區(qū)域被改變。
2. 權利要求1所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是：改變由在半乳凝素9或基本上具有與 半乳凝素9同等活性的蛋白質(zhì)的連接肽或其附近區(qū)域的氨基酸序列中缺失、取代或添加的 1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列形成，與半乳凝素9比較，至少對于連接肽的分解敏 感性被改變。
3. 權利要求1或2所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是：基本上具有與半乳凝素9同等活 性的蛋白質(zhì)與半乳凝素9的氨基酸序列至少具有70%以上同源性。
4. 權利要求1?3中任一項所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是：（1)和⑵借助于⑶連 接，其中⑴為具有半乳凝素9的N末端側的糖鏈識別區(qū)域（NCRD)或與該區(qū)域具有基本 上同等活性的多肽；（2)為具有半乳凝素9的C末端側的糖鏈識別區(qū)域（CCRD)或基本上與 該區(qū)域具有同等活性的多肽；（3)為在半乳凝素9的連接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添 加的1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成的改變連接肽。
5. 權利要求1?4任一項所述的蛋白質(zhì)或其鹽，其特征是：（1)和⑵借助于⑶連 接，其中（1)為具有序列3所示的氨基酸序列的多肽或基本上與它具有同等活性、且具有 與序列3所示的氨基酸序列至少70%以上同源性的氨基酸序列的多肽，或具有在序列3所 示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1?8個氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽；（2)為 具有序列4所示的氨基酸序列的多肽或基本上與它具有同等活性、且具有與序列4所示的 氨基酸序列至少70%以上同源性的氨基酸序列的多肽，或具有在序列3所示的氨基酸序 列中至少缺失、取代或添加1?21個氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽；（3)為在序列7? 9中任一個序列表示的氨基酸序列中缺失（不過，序列7中的1?32以及1?44的缺失、 和序列8中1?12的缺失除外）、取代或添加1個或1個以上的氨基酸的氨基酸序列構成 的改變連接肽。
6. -種核酸，其特征是具有編碼權利要求1?5任一項所述的蛋白質(zhì)的堿基序列。
7. 權利要求6所述的核酸，其特征是聚核苷酸。
8. 權利要求6或7所述的核酸，其特征是DNA或RNA。
9. 一種重組載體，其特征是含有權利要求6?8任一項所述的核酸。
10. 權利要求9所述的重組載體，其特征是除了含有權利要求6?8任一項所述的核酸 夕卜，還含有編碼標記蛋白質(zhì)和/或膚的喊基序列。
11. 一種轉(zhuǎn)化體，其特征是含有權利要求6?8任一項所述的核酸或權利要求9或10 所述的重組載體。
12. 權利要求11所述的轉(zhuǎn)化體，其特征是：轉(zhuǎn)化體宿主細胞是原核細胞或真核細胞。
13. -種藥物，其特征是：作為有效成分含有從權利要求1?5中任一項所述的蛋白 質(zhì)、權利要求6?8中任一項所述的核酸、權利要求9或10所述的重組載體和權利要求11 或12所述的轉(zhuǎn)化體中選擇的成分。
14. 權利要求13所述的藥物，其特征是免疫調(diào)節(jié)劑。
15. 權利要求13所述的藥物，其特征是抗腫瘤藥。
16. 權利要求15所述的藥物，其特征是抗來自于包含腦腫瘤（多形形惡性膠質(zhì)瘤等）、 脊髓腫瘤、上顎洞癌、胰液腺癌、齒肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉頭癌、甲 狀腺癌、甲狀旁腺癌、肺癌、胸膜腫瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大腸癌、膽管 癌、膽囊癌、胰臟癌、肝癌、腎臟癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、精巢腫瘤、腎上腺癌、子宮頸 癌、子宮體癌、陰道癌、外陰癌、卵巢癌、纖毛上皮瘤、惡性骨腫瘤、軟部肉瘤、乳癌、皮膚癌、 惡性黑色素瘤、基底細胞瘤、白血病、伴隨骨髓化性的骨髓纖維癥、惡性淋巴瘤、惡性淋巴肉 芽腫病、漿細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等癌和肉瘤的腫瘤的抗腫瘤藥。
17.權利要求13所述的藥物，其特征是該藥物是針對下面疾患或疾病、或病的癥狀的 藥物： (A) 炎癥性疾患，來自于在各臟器中發(fā)生的各種急性和慢性炎癥、變態(tài)性和自身免疫性 炎癥、感染癥等中的疾?。? (B) 急性和慢性疾患，來自于包括支氣管炎、支氣管肺炎、間質(zhì)性肺炎、肺炎、細支氣管 炎、急性縱隔炎的肺的疾患、包括心外膜炎、心內(nèi)膜炎、心肌炎、口內(nèi)炎、口角炎、扁桃炎、咽 炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、蟲垂炎、缺血性大腸炎、藥物性 大腸炎、直腸炎在內(nèi)的肺以外的其它臟器的疾患、包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重癥 肝炎、急性和慢性肝炎以及肝硬變、膽囊炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性和慢性腎炎、膜 性腎炎、絲球體腎炎、IgA腎癥、各種膀胱炎、腦髓炎、乳腺炎、皮炎、表層角膜炎、干性角結膜 炎、中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸、牙肉炎、牙周炎、牙周圍炎在內(nèi)的炎癥等疾??； (C) 來自于神經(jīng)性炎癥（例如、神經(jīng)性胃炎、神經(jīng)性膀胱炎等）、癌或伴隨炎癥疼痛的疾 ??； (D) 變態(tài)性炎癥疾患，全身性過敏性、支氣管哮喘、過敏性肺炎、花粉癥、變態(tài)性鼻炎、變 態(tài)性結膜炎、免疫復合體引起的變態(tài)性疾患、血管神經(jīng)性浮腫等在內(nèi)的疾?。? (E) 自身免疫性的炎癥（自身免疫疾患），來自于全身性（慢性關節(jié)風濕病、全身性 紅斑狼瘡、結節(jié)性多發(fā)性動脈炎、強皮癥、多發(fā)性肌炎?皮膚肌炎、肖格倫綜合征、貝切特病 等）、神經(jīng)系（多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力癥、HAM(HTLV-1脊髓癥）、肌萎縮性側索硬化癥 等）、內(nèi)分泌性（巴澤多病、橋本病、1型糖尿病等）、血液（特發(fā)性血小板減少性紫斑病、自 身免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血等）、呼吸器（結節(jié)病、肺纖維癥等）、消化管（潰瘍 性大腸炎、克羅恩病等）、肝臟（自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性硬化性膽管 炎、自身免疫性膽管炎等）、腎·尿路系（抗嗜中性白細胞細胞質(zhì)抗體相關腎炎、血管炎、肺 腎綜合征（Goodpasture)、抗絲球體基底膜抗體病等）等疾?。? (F) 感染癥，由于病原體傷害生物體的細胞?組織?臟器產(chǎn)生的疾患、或起因于給人帶 來感染癥的病原體的疾患，病原體來自于1)細菌（包括螺旋體、衣原體、立克次體）、2)病 毒、3)真菌、4)植物（藻類）、5)原蟲、6)寄生蟲（吸蟲、條蟲、線蟲）、7)節(jié)足動物，包括細 菌性感染癥（霍亂、瘟疫、大腸桿菌感染癥等）、螺旋體感染癥（鉤端螺旋體病等）、衣原體 感染癥（鸚鵡病等）、立克次體感染癥（斑疹傷寒、破傷風等）、病毒性感染癥（帶狀皰疹、 病毒性出血熱、狂犬病等）、真菌癥（念珠菌病、隱球菌病、曲霉菌病等）、原蟲性疾患（阿米 巴性痢疾、瘧疾、弓形體病等）、寄生蟲（吸蟲癥、線蟲癥等）、此外還包括支原體感染癥（支 原體肺炎等）、分支桿菌感染癥（結核、非定型抗酸菌癥等）疾??； (G) 皮膚科領域的疾患，i)皮膚感染癥、包括變態(tài)性炎癥和自身免疫性炎癥等在內(nèi)的 皮炎癥，干癬、水皰癥、膿皰癥、角化、角化異常癥等具有特有炎癥的皮膚疾患、ii)來自于由 于美容皮膚科相關的損傷或老化，與a)黑色素代謝調(diào)節(jié)（美白）、b)毛發(fā)成長（生發(fā)）的 調(diào)節(jié)、C)膠原產(chǎn)生調(diào)節(jié)有關的皮膚科領域的疾患（包括老化）； (H) 生活習慣病，來自于包括高脂血癥、動脈硬化癥、高血壓、糖尿病等在內(nèi)的疾??； (I) 有關正常細菌叢的維持的異常； (J) 來自于包括淀粉樣變性、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松癥、骨折等在內(nèi)的疾??； (K) 腦、神經(jīng)領域中的炎癥反應，例如伴隨著腦梗塞、心肌梗塞等缺血性病變的進展出 現(xiàn)的炎癥、綜合失調(diào)癥； (L) 痛風； (M) 骨質(zhì)疏松癥；或 (N) 間質(zhì)性肺炎。
18.分析或檢查試劑，特征是作為有效成分含有選自于權利要求1?5中任一項所述的 蛋白質(zhì)、權利要求6?8中任一項所述的核酸、權利要求9或10所述的重組載體以及權利 要求11或12所述的轉(zhuǎn)化體的成分。
【文檔編號】C12N5/10GK104292321SQ201410443899
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2005年3月29日 優(yōu)先權日:2004年3月29日
【發(fā)明者】西望, 平島光臣, 山內(nèi)清明, 伊藤愛子 申請人:株式會社嘉爾藥物